Name: Isolamento, cultura, e imagem de Fetal Humano pancreáticas grupos de células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-18T19:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a isolar, cultivar e imaginar aglomerados de células pancreáticas fetais humanas usando colagenase e microscopia de imunofluorescência. Este método auxilia pesquisadores a estudar a diferenciação celular e o desenvolvimento de terapias para diabetes tipo 1.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Califórnia de Medicina Regenerativa (RB3-02266) e do NIH (DK54441).

Notas antes de começar: <ol><li> Pancreata fetais humanos foram obtidos a partir dos defeitos congénitos Research Laboratory, da Universidade de Washington (Seattle, Washington, EUA), que colheu o tecido. O consentimento informado para a doação de tecido, armazenamento e utilização das amostras foi obtida a partir dos dadores pelo centro. O termo de consentimento protocolo foi fornecido por escrito e da Universidade da Califórnia, em San Diego Pesquisa Proteções Humanos Programa aprovado todo o estudo (Protocolo n 081237XT). </li><li> É essencial para manter tanto o pâncreas fetal humano e o recipiente que contém o pâncreas em gelo durante todo o procedimento. A dissociação e a digestão deverá ser executada tão rápido quanto possível. </li><li> Enviar clínica onde o pâncreas fetal humano foi obtido a partir da memória intermédia para o armazenamento e transporte do pâncreas. (RPMI-1640 + 10% de soro humano normal (NHS), 300 mM de trealose SG, penicilina / estreptomicina, e fungizona). </li></ol>1. Dissecção da fetais pâncreas humano <ol><li> Dissolve-se 5 mg de colagenase XI RT em HBSS para obter uma concentração final de 2,5 mg / ml. Filtrar esterilizar a solução com um filtro de seringa de 0,22 micron para um estéril (autoclavado) frasco de cintilação e armazenar a 4 ° C. Em uma capa de cultura de tecidos, estabelecido duas placas de Petri estéreis, um pequeno cadinho estéril (se um cadinho não estiver disponível, um pequeno copo pode ser substituído), tesouras e pinças esterilizadas. Adicionar 2 ml de HBSS para uma placa de Petri, para lavar o pâncreas. Líquido aspirado a partir do tubo que contém o pâncreas fetais, deixando cerca de 1 ml. </li><li> Retire do pâncreas com uma pinça na 60 milímetros placa de Petri sem HBSS. Para estes experimentos, CCIs fetais são gerados a partir pancreata fresco com idade gestacional variando de 9 a 23 semanas. Isolamento a partir de pâncreas em idades gestionational anteriores é difícil devido ao tamanho do pâncreas. O protocolo é aplicável a provável idade gestacional após 23 semanas, no entanto aquisição de pancreata após este tempo é difícil devido a restrições federais (EUA). Ocasionalmente, o pâncreas fetal chega com baço, gordura ou tecido conjuntivo anexado da dissecção originais. O tecido extra é facilmente visível a olho nu, e deve ser removido a partir do pâncreas, antes de iniciar o protocolo. </li><li> Lavar o pâncreas em um volume mínimo de HBSS frio (~ 0,5 ml) numa placa de Petri. </li><li> Mova o pâncreas limpas ao pequeno cadinho estéril usando uma pinça estéril e coloque em um balde de gelo. Colocar o cadinho de um suporte para um tubo de centrífuga de 50 ml e, utilizando 2 pares de tesouras, vigorosamente cortar o pâncreas durante vários minutos. (Normalmente 2-5 minutos, mas o tempo depende do tamanho e da firmeza do tecido). Técnica de corte é importante. Segurar um lado da tesoura numa posição fixa mover apenas as pegas opostas. As pontas das tesouras deve assentar no fundo do cadinho. Continue com o movimento tesoura rápida para quebrar o pâncreas em pequenospeças. Quanto menores forem os pedaços de tecido, melhor a colagenase funcionará. </li><li> Adicionar 1,5 ml de HBSS + pâncreas picada até o frasco contendo a colagenase e coloque em um conjunto agitador banho-maria a 37 ° C a 200 rpm por até 10 min. Não marque mais freqüentemente do que uma vez durante os primeiros 5 min. Tempo de digestão depende da qualidade do tecido, tão pouco quanto 6 minutos pode ser suficiente. O ponto final é quando as partículas são pequenas e uniformes. </li><li> Encha o frasco (10-15 ml) com HBSS frio para parar a atividade da colagenase. Coloque sobre o gelo e permitir que os aglomerados que se contentar com 10 min. Muitas vezes, a esta altura, alguns a morte celular ocorreu e DNA é liberado para os meios de comunicação. Isso pode tornar a mídia &#39;pegajoso&#39;; neste caso, adiciona-se 100 ul de ADNase (10 mg / ml) para a solução. </li><li> Depois que o tecido do frasco de cintilação decidiu-se por 10 minutos, aspirar a camada superior deixando-o um pouco menos de metade (7-8 ml). Transferência das células para um tubo cónico de 15 ml, Adicionar 5 ml de HBSS. Centrifugar durante 5 minutos a 300 x g. </li><li> Aspirar o HBSS e ressuspender as células em 5 ml de meio contendo meio RPMI-1640, glutamax, 10% de soro humano normal (NHS), 10 mM de HEPES pH 7,2, penicilina / estreptomicina e fungizona. Placa em 60 milímetros placa de Petri. Para os pesquisadores que tentam gerar células β, adicione HGF (10 ng / ml de solução final) para os meios de comunicação. Além disso, um certo número de grupos têm demonstrado que a suplementação do meio de cultura com a hormona incretina, GLP-1 também aumenta as células β 28. As células devem ser deixadas em suspensão durante 72 h, para agregar e formar CCI. </li><li> Depois de 72 horas em suspensão, as células podem ser semeadas em matriz da matriz HTB9 linha celular humana tal como descrito anteriormente 29. Independentemente das condições de crescimento, a mídia deve ser trocado a cada 48 horas. </li></ol> 2. Imunofluorescência de Marcadores de Proliferação Celular Endócrino e Maturação em CCIs Grown em suspensão, monocamada ou em lamínulas <ol><li> Para medir a proliferação celular, BrdU rotulagem de quer células aderentes ou células em suspensão é realizada durante 12 horas antes da fixação do PFA. Reagente de BrdU é diluída 1:100 e esterilizado por filtração em meio RPMI-1640, glutamax, 10% NHS, 10 mM de HEPES pH 7,0, penicilina / estreptomicina e fungizona. </li><li> No caso de células em suspensão: Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg, e o meio de cultura aspirado. Adicionar 10 ml de PBS para lavar os CCI, centrifuga-se durante 5 min a 300 xg e aspirado. Se os CCIs serão incluídos em parafina, por favor, siga o protocolo opcional 3,1-3,17 Para células aderentes:. Remover meio de cultura e lavar as células com PBS, como descrito acima. Fixar as células durante 20 minutos com 4% de PFA em RT, em seguida, lavar duas vezes com PBS. Neste ponto, as placas podem ser embrulhados com Parafilm e armazenada em PBS a 4 ° C durante até 1 semana. </li><li> Incubar as células com 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 10 min à temperatura ambiente. Lave as células duas vezes com PBS e aplicar tampão de bloqueio (2% de fazersoro nkey, 2% de albumina de soro bovino, 50 mM de glicina diluído em PBS) durante 1 hora. Lavar as células com tampão de Trabalho (Bloqueio Tampão diluído 1:10). Dilui-se o anticorpo em tampão de trabalho. Para as células que cresceram em lamelas de vidro, dilui-se o anticorpo em 60 ul de volume total. No caso de células em um prato de 6 poços, diluir o anticorpo em 600 ul de volume total. Para corar vários epítopos, um cocktail de anticorpos pode ser aplicado. Como controlo, usa IgG ou pré soro imune em vez do anticorpo específico. As amostras de controlo devem ser incubadas com IgG de controlo, da mesma espécie que o anticorpo primário a ser utilizado. </li><li> Incubar o anticorpo primário ou 1,5 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C. Aspirar o anticorpo primário e lava-se 3x com tampão de trabalho à temperatura ambiente. </li><li> Dilui-se o anticorpo secundário a 1:200 de anticorpos conjugados com FITC e rodamina, 1:500 - 1:1000 para os anticorpos conjugados com Alexa. É importante observar que todos os anticorpos secundários são sensíveis à luz. Cubra as amostrasem papel de alumínio para evitar a perda de sinal. Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Opcional: Para visualizar os núcleos, DAPI pode ser adicionado a 1:500 durante a incubação secundária. Isto é útil para a quantificação da expressão da proteína no total da população de células. </li><li> Aspirar o anticorpo secundário e lava-se 3x com tampão de trabalho à temperatura ambiente. Para células crescidas em lâminas, levantar suavemente as lamelas com fórceps enquanto mergulha no tampão; lavá-lo por imersão em PBS. Para células crescidas em uma placa de 6 poços, adicionar fosfato de modo a lavar e aspirado. Neste ponto, eles estão prontos para examinar sob um microscópio invertido. </li><li> Toque na borda da lamela suavemente em um Kimwipe para se livrar do excesso de PBS. Adicionar uma gota de gel de montagem em uma lâmina de vidro e inverta a lamela sobre a lâmina. Retire o excesso de gel de montagem por aspiração. Toque a lamela suavemente com a parte traseira de uma ponta de pipeta de 200 mL para remover bolhas. </li><li> Seca à temperatura ambiente durante cerca de 20 minutos ou O / N a 4 ° C e sob uma examinar fluorescent ou microscópio confocal. </li></ol> 3. (Opcional) Immunofluorescent Coloração de Proteínas de parafina CCIs Embarcados <ol><li> Prepare uma solução de agarose 3% e deixe esfriar para 55-60 ° C. </li><li> Transferir os CCIs incubadas em suspensão para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 1500 g durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar a mídia a partir de células e corrigir com 500 mL PFA 4% por 10 minutos em temperatura ambiente. Não misturar o sedimento, a menos que o pelete é muito grande. </li><li> Lava-se a pelete duas vezes com 750 ul de PBS. Como o PFA 4%, este resíduo é considerado perigoso e devem ser eliminados de acordo com as especificações de resíduos perigosos da sua instituição. </li><li> Agite suavemente o pellet celular para soltar e adicionar 150-200 mL de agarose para baixo a parede do tubo de 15 ml. </li><li> Misturar sacudindo suavemente o tubo, mas não se formam bolhas. </li><li> Deixa-se solidificar a 4 ° C durante 5-10 min. </li><li> Use uma agulha 21 G para desalojara pelota e coloque em um 15 ml novo tubo cônico. </li><li> Inclusão em parafina e preparação de secções em lâminas pode ser feito no local usando um micrótomo ou por suas instalações de microscopia do núcleo. </li><li> Retire a parafina de tecido, hidrato, e lava-se com água rapidamente. </li><li> Adicionar 0,2 M de glicina durante 30 min à temperatura ambiente para extinguir o aldeído restante. </li><li> Lava-se a corrediça duas vezes com PBS durante 2 minutos cada. </li><li> Para recuperação antigênica, trazer 10 mM tampão citrato (pH 6,0) a ferver sobre a placa quente. Mergulhe os slides no buffer, esperar por ele para voltar a ferver, e esperar por 15 min. </li><li> Retirar o copo do fogão. Aguarde cerca de 40 minutos para os slides arrefecer no buffer. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes com H 2 O durante 5 min cada, lavar as lâminas com PBS duas vezes durante 5 min cada, bloquear com 2% de soro de burro normal em PBS, durante 1 hora. </li><li> Incubar com anticorpo primário diluído a concentração correcta no tampão de trabalho, contendo 0,2% de Triton X-100.Geralmente, o anticorpo primário é incubado durante a noite, se a coloração para os factores de transcrição e durante 1,5 horas, se a coloração para hormonas, marcadores de proliferação e / ou diferenciação. </li><li> Siga os passos de 2,3-2,9 descritos acima. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os métodos aqui apresentados permitem uma para gerar CCIs de pâncreas fetais humanos e subsequentemente imagem para os marcadores de proliferação celular e endoderme pancreático. O processo de dissociação do pâncreas humano fetal requerido cerca de 90 min, seguido de um período de formação de ICC 72 horas, uma abordagem que é substancialmente diferente dos protocolos para isolar células progenitoras de células β de rato. O protocolo aqui apresentado fornece um método reprodutível, que permite ao pesquisador explorar desenvolvimento pancreático fetal humano. Dois tipos diferentes de estudos longitudinais pode ser realizada. Em primeiro lugar, o potencial de gerar tipos de células funcionais do pâncreas (células ductais, as células exócrinas e células hormonais positivos) de diferentes idades gestacionais podem ser avaliados após o transplante. Em segundo lugar, a partir de um único ICCs idade gestacional podem ser cultivadas em cultura, tratadas com agentes farmacológicos seleccionados e transplantadas em diferentes pontos de tempo durante a cultura ICC para explorar as diferençasno destino da célula. Com os esforços tremendos sendo dirigidas a diferenciação hESC em células produtoras de insulina, os problemas associados com a secreção de insulina em resposta a estímulos fisiológicos estão novamente sendo revivido. CCIs Humanos fornecer um sistema modelo único para estudar este aspecto crítico da proliferação de células do pâncreas fetal e β desenvolvimento celular. Como acontece com qualquer protocolo para isolar as células dos tecidos, os detalhes são fundamentais para o sucesso. Um certo número de parâmetros são, infelizmente, fora do controlo do pessoal de laboratório que executa a experiência. Dois problemas encontrados por este laboratório incluem a má qualidade do material de partida e entrega de tecido não-pancreático. Tecido pancreático fetal saudável é firme a um corte em tesoura. Se os cortes de tecido com muita facilidade, é um sinal de que as enzimas pancreáticas começaram a digerir o próprio pâncreas. Deste infelizmente, não há recuperação ea preparação é melhor cancelada. Raramente, uma emtécnico experiente remoção do pâncreas vai confundir secções do intestino para o pâncreas. Estas amostras terá muito mais elasticidade do que um pâncreas e um lúmen notável estará presente. Mais uma vez, estas amostras devem ser descartadas. Quando o protocolo acima é seguido como descrito, raramente existem quaisquer problemas que surjam para lançar o isolamento fora da pista. Alguns pontos a serem lembrados para assegurar um isolamento suave incluem, para usar uma tesoura afiada para cortar pâncreas precisa e ter a certeza de não deixar qualquer amostra de tecido grande demais para digerir. Se os cortes não são suficientemente pequenos, em seguida, a colagenase não funciona de forma eficaz, e alguns ICCs são formados. Por outro lado, quando se utiliza um novo lote de colagenase, começar com um nível semelhante se UI (unidades internacionais) para a digestão como utilizado anteriormente. No entanto, reduzir o tempo de incubação para assegurar que durante a digestão não ocorre. Esta solução de problemas técnica garante que o rótulo IU não varia significativamente de lote para batch. Tomados em perspectiva, esta técnica de isolamento de vários CCI fetais humanos é relativamente padrão no campo. A maioria dos laboratórios confirmaram nossos resultados que a adição de HGF para a mídia ajuda as células sobrevivem e proliferam 33. Em resumo, temos desenvolvido um método para isolar os CCI fetais humanos pâncreas fresco com idades gestacionais entre 9 e 23 semanas. As células podem ser cultivadas como uma monocamada ou em suspensão para as experiências de visualizar factores de transcrição endócrina do pâncreas e da insulina humana.

A principal limitação para terapias de reposição de insulina com base em células na diabetes tipo 1 é a escassez de ilhotas humanos disponíveis para transplante. A capacidade para regular a proliferação e diferenciação de células precursoras pancreáticos humanos em células produtoras de insulina que satisfaçam as exigências metabólicas de um estado deficiente de insulina continua a ser um bloco de construção fundamental para uma terapia baseada em células para o tratamento de diabetes tipo 1. Até ao advento das células produtoras de insulina, células estaminais embrionárias humanas, derivadas de células endócrinas pancreáticas fetais humanos ou dos seus precursores foram vistos como potenciais fontes de células para transplantes clínicos. Embora a paisagem científica e regulamentar mudou nos últimos anos, continua a haver uma necessidade vital para compreender como o pâncreas fetal humano desenvolve. Muitos agora ver o uso terapêutico de células de fetos humanos como improvável, no entanto, se foram estabelecidos métodos eficazes e seguros para expandir as células, o uso terapêutico dessas células poderia again ser explorado. Um grande obstáculo que resta é que na transformação vitro de células pancreáticas fetais humanos agregados (CCI) em glicose responsivo, insulina células secretoras endócrinas é atualmente um processo ineficiente. Apesar de muito trabalho ao longo de quase 30 anos elucidou e delineado o perfil de fatores de transcrição necessários para o desenvolvimento do pâncreas endócrino expressão, continuam a existir lacunas em nosso conhecimento sobre como expressão temporal de fatores de transcrição é regulada e relacionada com a função celular. Até ao advento das células produtoras de insulina, células estaminais embrionárias humanas, derivadas de células endócrinas pancreáticas fetais humanos ou dos seus precursores foram vistos como potenciais fontes de células para transplantes clínicos. Embora a paisagem científica e regulamentar mudou nos últimos anos, continua a haver uma necessidade vital para compreender como o pâncreas fetal humano desenvolve. Muitos agora ver o uso terapêutico de células de fetos humanos como improvável, no entanto, se eficaze métodos seguros para expandir as células foram estabelecidos, o uso terapêutico de tais células podem ser novamente explorada. Um grande obstáculo que resta é que na transformação vitro de células pancreáticas fetais humanos agregados (CCI) em glicose responsivo, insulina células secretoras endócrinas é atualmente um processo ineficiente. Apesar de muito trabalho ao longo de quase 30 anos elucidou e delineado o perfil de fatores de transcrição necessários para o desenvolvimento do pâncreas endócrino expressão, continuam a existir lacunas em nosso conhecimento sobre como expressão temporal de fatores de transcrição é regulada e relacionada com a função celular. Recentemente, o domínio de células estaminais empregou o conhecimento acumulado sobre temporais expressão do factor de transcrição durante o desenvolvimento da ilhota para dirigir a produção de células que expressam os marcadores de células endócrinas maduros. Embora gênese de células produtoras de insulina de células estaminais embrionárias humanas e células pluripotentes induzidas (iPSC) fez substancial eavanços significativos nos últimos anos, os protocolos mais eficazes requerem duas fases de diferenciação diferentes: 1) uma diferenciação precoce in vitro para gerar células que expressam factores de transcrição precursor pancreáticas, seguido por 2) in vivo após o transplante de maturação - uma chamada &quot;caixa preta &quot;período. Para avançar, os avanços na compreensão da biologia subjacente ilhota maturação in vivo, independentemente da fonte de células, deve ser entendido em um nível bioquímico. A similaridade entre os resultados obtidos com CCI e células estaminais embrionárias humanas sugere que uma série de processos bioquímicos importantes que regulam a passagem de células precursoras pancreáticos humanos, em células secretoras de insulina, glicose responsivos maduras in vitro permanecem desconhecidos. A parte central desse entendimento será o de desenvolver novas metodologias para obter populações de células endócrinas funcionais a partir de células progenitoras do pâncreas e células estaminais embrionárias humanas exigirá não apenas aprox bioquímicaoaches que elucidar os eventos de maturação, mas os métodos para analisar as mudanças. Por que acreditamos que a imagem células pancreáticas fetais humanos é um aspecto crítico de identificar alterações na maturação ilhota? A resposta está em parte na busca histórica para gerar as células produtoras de insulina. Ambos os sistemas de cultura de tecidos e modelo para precursores e ilhotas pancreáticas têm permitido aos pesquisadores explorar as diferenças significativas que existem entre a maturação de ilhotas de animais e ilhotas humanas in vitro. Uma limitação para a exploração do desenvolvimento fetal pâncreas humano é que a idade gestacional que podem ser utilizados legalmente só dão origem a agregados de células heterogéneas. Apesar de as células humanas fetais isoladas assemelham ilhotas, coloração após a cultura in vitro a partir de 9-23 semanas de idade gestacional revela menos de 15% contêm marcadores de células endócrinas, com a maioria das células não coloração para as hormonas das ilhotas. No entanto, após o transplante e novivo de maturação, a grande maioria das células expressam marcadores endócrinos 6,25. Os resultados destes estudos estão sendo ecoado hoje com protocolos de diferenciação hESC que só são capazes de gerar populações modestas de células endócrinas positivas hormonais único após a diferenciação in vitro nos métodos. In vitro para aumentar populações de células hormônio positivo provavelmente vai fornecer informações sobre in vivo ilhota maturação. Além disso, a compreensão dos eventos moleculares que impulsionam o desenvolvimento pancreático fetal humano, provavelmente, melhorar os esforços para derivar células produtoras de insulina a partir de células estaminais embrionárias humanas e ainda delinear os mecanismos que regulam a regeneração celular β e transdiferenciação célula pancreática. As semelhanças entre células de pâncreas humano fetal e células estaminais embrionárias humanas maturação pode ser estendido para a função celular. Como as células de murídeo, ambas as células fetais humanas e células estaminais embrionárias humanas diferenciadas são capazes de libertar insulina em resposta à glicosedepois neoformação ilhota in vitro 26,27. No entanto, após o transplante em camundongos nude e maturação, ambos grupos de ilhotas como humanos e de células produtoras de insulina derivadas de células estaminais embrionárias humanas apresentam um fenótipo endócrino. Três meses após o enxerto, cerca de 90% das células transplantadas ou de população são de insulina positivo, e funcionar normalmente, tal como determinado pela libertação de péptido C 17,26. Estes resultados indicam que o transplante proporciona contexto e não identificados sinais que promovem a maturação ilhota. Protocolos de imagem optimizada, como a descrita aqui, para as células pancreáticas fetais humanos vai ajudar na busca para identificar os fatores que modulam e acelerar a maturação. Exploração bioquímica Fundamental de células pancreáticas fetais humanos e células estaminais embrionárias humanas diferenciados para uma linhagem endócrina nesta fase de desenvolvimento é essencial para medir a eficiência de maturação. O protocolo seguinte, esboçado no Figure 1, fornece o método actual para o isolamento de células pancreáticas fetais humanos, chamado CCIs de pâncreas fetal humano inteiro e imagiologia destas células. Este protocolo necessita de uma preparação inicial de células a partir de tecido, que pode ser subsequentemente cultivada como uma monocamada ou em suspensão. Preparação de células para imagiologia de marcadores usados ​​de proliferação de células do sistema endócrino e maturação é descrita. Geração e imagiologia de ICC na ausência ou na presença de uma variedade de agentes químicos modificação proporciona um método rápido, em comparação com os modelos de transplante, para ajudar a identificar as condições de cultura e os compostos que aceleram a maturação de células pancreáticas fetais humanos em exócrina totalmente funcional, ductal, ou hormona produzir células pancreáticas.

<table><tbody><tr><td>Trealose SG</td><td>Hayashibara</td><td>Trealose SG</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase XI&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C-9407</td><td></td></tr><tr><td>Hank ' s Solução salina balanceada (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 com glutamato</td><td>Life Technologies</td><td>11879020</td><td>sem glicose ou HEPES</td></tr><tr><td>Human AB Sera, doadores masculinos</td><td>Omega Scientific</td><td>HS-30</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Life Technologies</td><td>15290018 Solução de</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes, pH 7.0</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina/estreptomicina 100x</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td>Fator</tr> de <tr><td>crescimento de hepatócitos (HGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>GLP-1</td><td>Peprotech</td><td>130-08</td><td></td></tr><tr><td>Soro</td> <td>fetal bovinoInvitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri estéreis, 60 x 15 mm; nervuras empilháveis e de ventilação</td><td>Spectrum Laboratory Products, Inc.</td><td>D210-13</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Burro</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Life Technologies</td><td>00-0103</td><td></td></tr><tr><td>anti-insulina (camundongo monclonal; 1:1.000)</td><td>Sigma</td><td>I2018</td><td></td></tr><tr><td>anti-glucagon (monoclonal de camundongo; 1:2.000)</td><td>Sigma</td><td>G2654</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (monoclonal de camundongo)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-47910</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (policlonal de cabra)</td><td>AbCam</td><td>47383</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (policlonal de coelho)</td><td>AbCam</td><td>47267</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 (coelho)</td><td>Invitrogen</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 (mouse)</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (coelho)</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (mouse)</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Lab Vision Neomarkers</td><td>RM 9016-50</td><td></td></tr><tr><td>pan-CK (monoclonal de camundongo; 1:100)</td><td>Immunotech</td><td>2128</td><td></td></tr><tr><td>CK19</td><td>AbD Serotech</td><td>MCA 2145</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>HTB9 linha celular</td><td>ATCC</td><td>5637</td><td>ver Beattie 1997 referência para gerar matriz</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A-6013</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento, cultura, e imagem de fetal humano pancreáticas grupos de células

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Para cerca de 30 anos, os cientistas demonstraram que ICCs fetais humanos transplantados sob a cápsula renal de ratinhos nus amadurecido em funcionamento das células endócrinas, tal como evidenciado por um aumento significativo na circulação de péptido-C humano após a estimulação da glucose 1-9. No entanto, in vitro, gênese de células produtoras de insulina de CCIs fetais humanos é baixa 10; resultados que lembram experimentos recentes realizados com células-tronco embrionárias humanas (hESC), uma fonte renovável de células que possuem uma grande promessa como um potencial tratamento terapêutico para diabetes tipo 1. Como CCIs, o transplante de células estaminais embrionárias humanas parcialmente diferenciado gerar glicose responsivo, as células produtoras de insulina, mas na gênese vitro de células produtoras de insulina de células estaminais embrionárias humanas é muito menos robusto 11-17. Uma compreensão completa dos fatores que influenciam o crescimento e diferenciação de células precursoras do sistema endócrino provavelmente vai exigir dados gerados a partir de ambos os CCIs e eleSC. Enquanto existir uma série de protocolos para gerar células produtoras de insulina a partir de células estaminais embrionárias humanas in vitro 11-22, muito menos existe para ICCs 10,23,24. Parte da discrepância que provavelmente vem a dificuldade de trabalhar com pâncreas fetais humanos. Para esse fim, nós continuamos a construir sobre os métodos existentes para isolar ilhotas fetais a partir de pâncreas humanos com idade gestacional variando de 12 a 23 semanas, crescem as células como uma monocamada ou em suspensão, e imagem para a proliferação celular, marcadores e hormônios pancreáticos humanos incluindo o glucagon e péptido-C. ICCs gerado pelo protocolo descrito abaixo resultado na libertação do peptídeo C após transplante sob a cápsula do rim de ratinhos nus que são semelhantes aos níveis de C-péptidos obtidos por transplante de tecido fresco 6. Embora os exemplos aqui apresentados concentrar-se a proliferação endoderme pancreático e β sintese de células, o protocolo pode ser utilizado para estudar outros aspectos do desenvolvimento pancreático, Incluindo exócrina, ductal, e outras células produtoras de hormonas.

A preparação cuidadosa dos CCIs fetal é fundamental para o sucesso deste protocolo. Representativos de imagens como as células normalmente olhar para períodos definidos após o plaqueamento são mostrados na Figura 2. Após purificação, os agregados de células recém-plaqueadas aparecem como pequenos aglomerados claras, escasso que contêm poucas células (Figura 2A). Após as primeiras 24 horas (Figura 2B), muitos dos aglomerados de células tornam-se maiores, mas numerosos pequenos aglomerados permanecem. Por 48 horas, os clusters têm se expandido significativamente, mas permanecem assimétrica (Figura 2C). Em 72 horas, os CCI deve ser clara, relativamente uniformes em tamanho e forma (Figura 2D). É neste ponto que as células podem ser semeadas em ou matrizes, tais como HTB-9, durante 24 horas antes de imunofluorescência ou deixaram-se crescer por mais 72 horas na ausência ou na presença de produtos químicos ou drogas que podem alterar a expressão de genes necessário para pancreático células endócrinas generation. Figura 3 destaca um número de anticorpos comumente utilizados para avaliar quer a proliferação ICC ou diferenciação para endoderme pâncreas. Na Figura 3A, os CCI foram semeadas em HTB-9, cultivadas durante 4 dias, e coradas para Pdx1, um marcador crítico de desenvolvimento pancreático. Embora a coloração in vitro de vários CCI é realizada rotineiramente no nosso laboratório, mais frequentemente, os CCI fetais humanos transplantados sob a cápsula renal de ratinhos nus e deixou-se proliferar e diferenciar in vivo 6,9,30-32. Em tempos específicos após o transplante, os ratos são sacrificados e os rins transplantados contendo os CCI é removido, fixo em paraformaldeído a 4% e embebidos em parafina. Seções 5 mícrons seqüenciais são gerados no local usando um micrótomo ou por uma instalação de microscopia núcleo. Desmascaramento Epitope e coloração das proteínas de parafina incorporado tecido para microscopia de imunofluorescência é descrita no protocolo facultativo 3.10-3.. 17 Na Figura 3B, CCIs transplantados foram coradas com o marcador de células pan citoqueratina epitelial (PanCK; verde) e com Ki67 (vermelho) para avaliar a proliferação celular. Em outro exemplo, a insulina humana (verde) e glucagon (vermelho) foram detectados após o transplante e maturação sob a cápsula renal de um ratinho nu (Figura 3C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig1highres.jpg" width="500"> Figura 1. Plano de preparação ICC fetal humano e coloração para Imunofluorescência de fluxo. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" width="500"> Figura 2. Preparação fetal representativas ICCs a 0, 24, 48, ou 72 horas após o plaqueamento (A) CCI.em suspensão foram fotografada imediatamente após o plaqueamento, (B) 24 horas após o plaqueamento, hr (C) 48 após o plaqueamento, ou (D), 72 h após o plaqueamento. Barra de escala para AC, ampliação 10X = 300 mm, barra de escala para D, 20 ampliação = 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig3highres.jpg"> .. Figura 3 Imunofluorescência de CCIs banhado Rotineiramente, CCIs são gravadas para (A) a Pdx1 marcador endoderme pancreático (verde), (B), as células endócrinas (pan-CK; verde) e proliferação (Ki67, vermelho), (C) insulina (verde) e glucagon (vermelho). Barra de escala para AC, aumento de 40 vezes = 20 m.

Um protocolo para isolar, os clusters da cultura e imagem de células ilhotas (CCI) derivadas de células pancreáticas fetais humanos é descrito. O método detalha os passos necessários para gerar CCIs de tecido, cultura como monocamadas em suspensão ou na forma de agregados, e imagem para os marcadores de proliferação e decisões destino celular do pâncreas.

Isolamento, cultura, e imagem de Fetal Humano pancreáticas grupos de células

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar aglomerados de células pancreáticas fetais humanas. Isso é feito primeiro limpando e cortando grosseiramente o pâncreas. Em seguida, o tecido pancreático é digerido com colagenase.Em seguida, os agregados digeridos são ressuspensos e plaqueados em placas de Petri. Finalmente, as células são plaqueadas na matriz HTB nove ou incubadas como agregados, e um experimento é realizado. Em última análise, R-T-P-C-R.A análise de sangue ocidental ou a microscopia de imunofluorescência são usadas para mostrar alterações na expressão ou localização de genes ou proteínas. As implicações dessa técnica se estendem para a terapia do diabetes tipo um, porque uma série de processos bioquímicos críticos que regulam a transição de células precursoras pancreáticas humanas em células secretoras de insulina responsivas à glicose maduras in vitro permanecem desconhecidos. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à digestão incompleta ou excessiva que leva à má formação de aglomerados de células pancreáticas fetais.Demonstrando este procedimento estará Lopez, um técnico do meu laboratório Para começar a dissecar o pâncreas fetal, aspire líquido e transfira o pâncreas para a placa de 60 milímetros com fórceps sem HBSS e remova qualquer gordura esplênica visível ou tecido conjuntivo. Use cerca de meio mililitro de HBSS para enxaguar o pâncreas antes de usar uma pinça para transferi-lo para um pequeno cadinho estéril e para um balde de gelo. Coloque o cadinho em um suporte para um tubo de centrífuga de 50 mililitros e, com duas tesouras, corte vigorosamente o pâncreas por vários minutos, segurando um lado da tesoura em uma posição fixa e movendo apenas as alças opostas enquanto descansa as pontas da tesoura no fundo do cadinho a 1,5 mililitros de colagenase e o pâncreas picado em um frasco contendo colagenase que foi preparado.De acordo com o protocolo de texto e coloque em um agitador em banho-maria ajustado para 37 graus Celsius a 200 RPM por até 10 minutos. Não verifique com mais frequência do que uma vez durante os primeiros cinco minutos. O tempo de digestão depende da qualidade do tecido, apenas seis minutos podem ser suficientes.O ponto final é quando as partículas são pequenas e uniformes. Para interromper a atividade da colagenase. Use HBSS frio para encher o frasco, coloque no gelo e deixe os aglomerados assentarem por 10 minutos.Após a incubação, aspire a camada superior, deixando-a um pouco menos da metade cheia. Se cadeias de DNA estiverem presentes devido à morte celular a 100 microlitros de 10 miligramas por mililitro, os DNAs para a solução e, em seguida, transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros e adicione cinco mililitros de centrífuga HBSS por cinco minutos a 300 gs. Após a aspiração, o HBSS ressuspende as células em cinco mililitros de meio contendo glutamato RPMI 1640, soro humano 10% normal, 10 montes milimolares, pH 7,2, penicilina estreptomicina e zona de fungos.Em seguida, coloque as células em uma placa de Petri de 60 milímetros e incube as células em suspensão a 37 graus Celsius por 72 horas para agregar e formar iccs. Após a placa de incubação, as células da matriz da linhagem celular humana HTB nove, conforme descrito anteriormente, trocam o meio de crescimento a cada 48 horas para realizar imunofluorescência nas células de aderência. Removemos o meio de cultura e lavamos as células com PBS.Depois de lavar as células uma vez com 10 mililitros de PBS, adicione 4% de PFA para fixar as células por 20 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, use PBS para lavar as células duas vezes. Em seguida, depois de incubar as células com 0,2% tritton X 100 em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente e lavar as células duas vezes com PBS, incubar as células em tampão de bloqueio por uma hora, pipetar 60 microlitros da solução de anticorpo primário em perfil que foi colocado em um recipiente selável. Em seguida, remova a lamínula da placa de 12 poços e limpe o tampão de bloqueio extra antes de colocá-lo em cima da gota de anticorpos primários.Incubar a amostra durante 90 minutos à temperatura ambiente. Depois de lavar as amostras três vezes, coloque uma gota de anticorpos secundários fluorescentes em um pedaço de paraforma com PBS. Enxágue as amostras e use papel de seda para enxugar o excesso de PBS antes de colocá-lo na gota de solução de anticorpo.Proteja a amostra da luz e incube por uma hora em temperatura ambiente após lavar as amostras e secar como antes, adicione uma gota de gel de montagem e inverta a lamínula em uma lâmina. Use aspiração para remover qualquer excesso de gel de montagem e a parte de trás de uma ponta de pipeta de 200 microlitros para retirar suavemente as bolhas de ar. Deixar secar as amostras durante 20 minutos e examinar ao microscópio fluorescente ou confocal.A preparação cuidadosa dos CCIs fetais é fundamental para o sucesso do protocolo descrito neste vídeo. Esta série de painéis ilustra como as células normalmente se parecem em períodos definidos após o revestimento. Por exemplo, após a purificação, os agregados celulares recém-plaqueados aparecem como aglomerados pequenos e esparsos que contêm poucas células.Após as primeiras 24 horas, muitos dos aglomerados de células tornam-se maiores e numerosos aglomerados pequenos permanecem por 48 horas. Os aglomerados se expandiram significativamente, mas permanecem assimétricos em 72 horas. Os iccs devem ser claros, relativamente uniformes em tamanho e forma, e podem ser plaqueados em matrizes ou deixados crescer por mais 72 horas com ou sem produtos químicos ou drogas para gerar células endócrinas pancreáticas.Esses números mostram vários anticorpos comumente usados para avaliar a proliferação ou diferenciação de ICC para endoderma pancreática. Aqui, os iccs foram plaqueados em HTV nove, cultivados por quatro dias e corados para PDX um, um marcador crítico do desenvolvimento pancreático. Embora realizemos rotineiramente a coloração in vitro de ICCs, mais frequentemente os ICCCs fetais humanos são transplantados sob a cápsula renal de camundongos nus e podem proliferar e se diferenciar in vivo.Neste exemplo, seções renais embebidas em parafina contendo iccs transplantados foram coradas com o marcador de células epiteliais citoqueratina em verde e KI 67 mostrado em vermelho para avaliar a proliferação celular. Em outro exemplo, tanto a insulina humana em verde quanto o glucagon em vermelho foram detectados após o transplante e maturação sob a cápsula renal de um camundongo nu. Uma vez mestre, essa técnica pode ser feita em 90 minutos se executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que cada lote de colagenase difere e precisa ser otimizado empiricamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar cultura e imagem. Aglomerados de células pancreáticas fetais humanas.

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