Atuação Remoto magnética de micrométricas para Sondas

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar em C duas medições das propriedades físicas locais de um biofilme bacteriano em escala micrométrica. Para isso, partículas magnéticas são introduzidas em um biofilme em crescimento para servir como sondas que podem ser atuadas remotamente sem perturbar as propriedades estruturais do biofilme. Em seguida, pinças magnéticas dedicadas são utilizadas para exercer uma força definida sobre cada partícula.

Inserido no biofilme, o deslocamento das partículas induzido pelo puxão magnético é monitorado por microscopia de vídeo para determinar os parâmetros viscoelásticos locais e fornecer a distribuição espacial tridimensional das propriedades mecânicas do biofilme. São obtidos resultados que mostram a heterogeneidade mecânica do biofilme de e coli e fornecem pistas sobre quais componentes do biofilme sustentam suas propriedades físicas. Assim, a principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como microscopia, cologia ou análise de biovegetação inteira, é que ela relata a distribuição espacial das propriedades mecânicas in situ, sem perturbar a estrutura original do material.

Para preparar as partículas magnéticas para este protocolo, agite vigorosamente o frasco estoque de partículas de 2,8 micrômetros para ressuspendê-las. Em seguida, transfira 10 microlitros para um tubo de microcentrífuga. Para lavar as partículas, adicione 190 microlitros de meio mínimo, gire o tubo suavemente, coloque-o em um suporte magnético, aguarde a formação do pellet e aspire a solução sobrenadante.

Repita esta etapa de lavagem mais duas vezes e re-suspenda os grânulos em 190 microlitros de meio mínimo. Em seguida, adicione 950 microlitros de M 63 B1 com 0,4% de glicose a 50 microlitros da solução de grânulos lavados para ajustar a concentração de partículas a aproximadamente 5 milhões de grânulos por mililitro. Para preparar o canal, utilize um cortador de vidro de diamante para cortar duas capilares quadradas de vidro borossilicato com 10 centímetros de comprimento, obtendo dois pedaços de oito centímetros de comprimento.

Usando o cortador de vidro, corte um lâmina de vidro ao meio. Em seguida, utilizando uma cola de cianoacrilato de ação rápida ou supercola, fixe os dois pedaços de capilar em dois pedaços de lâmina de vidro conforme mostrado neste diagrama. Com dois centímetros de distância entre eles e uma saliência de um centímetro em cada extremidade, autoclave todo o conjunto e as tubulações necessárias.

Para conexão adicional de canais, reúna os seguintes materiais estéreis sob uma cabine de fluxo laminar. As tubulações e conectores do canal montados, dois filtros ou armadilhas de bolhas pediátricos, duas pinças, seringas de 30 mililitros preenchidas com M 63 B, 1,4% de glicose e o frasco de resíduos.

Conecte os dois capilares da mesma maneira, utilizando um dos tubos. Conecte o frasco de resíduos a uma extremidade do capilar.

Em seguida, utilizando conectores tipo lure lock como junções, conecte a outra extremidade do capilar ao coletor de bolhas caseiro ou do coletor um ao coletor dois. Depois, conecte a seringa de 30 mililitros de M 63 B1 ao coletor dois. A seguir, preencha o sistema com M 63 B1 estéril contendo 0,4% de glicose.

Instale a seringa na bomba de infusão e ligue a bomba a uma taxa de cerca de cinco mililitros por hora acima das taxas experimentais. Acompanhe cuidadosamente e elimine todas as bolhas no circuito, se necessário. Desconecte e reconecte o circuito ao tentar este procedimento.

Tenha cuidado para remover todas as bolhas antes e durante a introdução da mistura de partículas celulares no tubo; é útil colocar o recipiente de resíduos acima das capilares, o que favorecerá o crescimento contínuo do biofilme. Deixe o meio fluir pelo sistema durante 10 a 15 minutos. Enquanto isso, em um tubo de microcentrífuga, misture um mililitro da suspensão bacteriana com densidade óptica 0,5 com um mililitro da solução de esferas lavada preparada anteriormente.

Desligue o fluxo, reconecte a tubulação e, em seguida, feche as pinças. Em seguida, encha uma seringa de um mililitro com a mistura de bolas de bactérias e introduza-a no capilar. Após a armadilha de bolhas caseira, transfira o aparato para o microscópio localizado ali.

Instale o capilar na platina do microscópio e coloque o recipiente de resíduos em um nível ligeiramente mais alto. Coloque a bomba de seringa sobre a bancada ao lado do microscópio. Deixe o aparato em repouso por 15 a 20 minutos para permitir que as bactérias sedimentem e se liguem à superfície do capilar.

Uma vez que as bactérias tenham se ligado ao capilar, abra as pinças e ajuste a taxa de fluxo na bomba de seringa e inicie o fluxo. Ao longo de 24 a 48 horas, um biofilme se desenvolverá na superfície do capilar, concentre-se no plano inferior do capilar e inicie a gravação com lapso de tempo das imagens da amostra. Normalmente, uma frequência de aquisição de duas imagens por minuto relatará adequadamente o crescimento do biofilme.

Este vídeo mostra a fase inicial do biofilme logo após a injeção da mistura de partículas celulares. Na aquisição capilar, a frequência é de uma imagem por segundo, e o vídeo é reproduzido a 10 quadros por segundo. Após quatro horas de crescimento, as partículas se destacaram progressivamente da superfície para se distribuírem no volume do biofilme.

As setas azuis indicam eventos de desprendimento. Aqui, a frequência de aquisição é de duas imagens por minuto, e o vídeo é reproduzido a 15 quadros por segundo. Após 20 horas de crescimento, uma dúzia de partículas distribuídas uniformemente pode ser monitorada em um plano focal.

Este vídeo foi filmado em um plano médio, a 20 micrômetros acima do fundo do capilar. Duas imagens foram adquiridas por minuto. O vídeo é reproduzido a 15 quadros por segundo.

Uma vez que o biofilme semeado com partículas magnéticas esteja crescendo manualmente, parafuse as pinças magnéticas na platina do microscópio. Para garantir que os gradientes de campo magnético apropriados sejam gerados na zona de observação, assegure-se de que as pinças sejam posicionadas conforme mostrado neste diagrama, no qual a região de medição indicada em vermelho está localizada a 300 micrômetros das bordas dos polos esquerdo e direito das pinças ao longo do eixo Y. A base do capilar é colocada a 200 micrômetros abaixo da base das pinças.

Para realizar esta etapa, utilize o controle de movimento XY da platina do microscópio para alinhar a borda do polo magnético esquerdo com a borda esquerda do capilar. No mesmo campo de observação, ajuste a posição do polo a 300 micrômetros da borda do capilar utilizando o botão x do micromanipulador esquerdo das pinças. Realize a mesma operação no lado direito.

Em seguida, ajuste a posição da pinça ao longo do eixo Z em relação à base do capilar. Primeiro, alinhe a base das hastes com a base do capilar e desloque as hastes 200 micrômetros para cima.

Usando o dial Z do micromanipulador, ajuste os parâmetros do gerador de funções para 24 segundos de sinal zero e 16 segundos de quatro ampères. Corrente contínua com um gatilho. Envie para o obturador da luz de campo claro após 20 segundos.

Para a sincronização do sinal, conecte a pinça ao gerador de funções por meio do amplificador de potência. Preste atenção para conectar corretamente os polos em série a fim de obter curvas de fluência distribuídas espacialmente. Estabeleça uma origem espacial, posicionando a origem do eixo Z na parte inferior interna do capilar.

Observe a posição do controle Z do microscópio. Em seguida, localize a interseção dos eixos x e Y, definidos pela borda da capilaridade e pela borda da peça polar, respectivamente. Esse ponto é a origem da análise.

Registre as coordenadas. Todas as coordenadas serão tomadas em relação a esta origem a partir de agora. Uma vez que o biofilme tenha crescido, utilize o botão de controle de foco fino para ajustar a posição vertical do capilar, de modo que o primeiro plano fique localizado de quatro a sete micrômetros acima do fundo do capilar.

Esta fatia corresponde à fatia do biofilme na qual a origem do referencial espacial está localizada no canto superior esquerdo. Em seguida, ligue o gerador de corrente e dispare manualmente a sequência de aquisição de imagens. Para iniciar a 42ª sequência de eventos, o fluxo de imagens adquirido aqui corresponde a um plano e campo XY específicos.

Após a sequência ter sido capturada, mova o capilar para capturar um vídeo do novo campo. Continue repetindo esse processo para obter todos os vídeos necessários para analisar os dados. Abra as imagens no ImageJ ou em um software equivalente de rastreamento de partículas para todas as pilhas adquiridas em todas as partículas.

Converta as imagens em arquivos de texto rastreando o deslocamento das partículas. Em seguida, utilizando um software de tratamento de dados, trace as curvas de deslocamento e converta-as em curvas de fluência, nas quais a complacência total do material JFT é calculada como uma função do tempo de acordo com a fórmula de complacência mostrada aqui. Esta fórmula descreve a relação entre a tensão aplicada e a deformação do material para uma partícula histórica de reds, ou incorporada em um meio viscoelástico e incompressível, conforme previamente estabelecido por ele e seus colegas. A partir do ajuste da curva de fluência ao modelo geral de Burgers para materiais viscoelásticos, obtenha os parâmetros viscoelásticos J zero, J um, η zero e η um linha, a fim de fornecer a distribuição espacial das propriedades viscoelásticas. As curvas de fluência foram coletadas em diferentes profundidades em um micravolume de biofilme de aproximadamente 200 por 200 por 40 micrômetros cúbicos. Os resultados típicos são mostrados aqui.

Os valores de J zero, a complacência elástica, são apresentados como uma função do eixo Z ao longo da profundidade e do eixo y ao longo de uma dimensão lateral do biofilme. Cada ponto corresponde a uma microesfera para a qual a análise da curva de fluência forneceu um valor de J zero. Os dados revelam que a complacência local varia ao longo da profundidade do biofilme em quase três ordens de grandeza.

Além disso, uma forte heterogeneidade lateral ocorreu em todas as alturas do biofilme. Os dados também fornecem a distribuição dos valores de complacência, que exibem uma forma ampla e assimétrica. A comparação desses resultados com os obtidos previamente em outros polímeros biológicos sugere que as propriedades mecânicas do biofilme são sustentadas por géis poliméricos altamente reticulados.

Em C, duas medições do biofilme também foram realizadas para avaliar propriedades locais sob diferentes condições ambientais, como menor taxa de fluxo, conforme mostrado aqui. Os valores de complacência de um biofilme cultivado a 0,1 mililitro por hora ainda exibem um perfil mecânico altamente heterogêneo. No entanto, a clara dependência da rigidez do biofilme em relação à profundidade Z observada no biofilme cultivado a um mililitro por hora desapareceu.

Esses resultados demonstram o impacto significativo das condições externas na organização do biofilme assistindo ao vídeo. Você deve ter uma boa compreensão de como mapear as propriedades viscoelásticas do Biofilm Institute sob condições de crescimento totalmente controladas.