Atuação Remoto magnética de micrométricas para Sondas In situ Mapping 3D de bactérias biofilme Propriedades Físicas

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar em C duas medições das propriedades físicas locais de um biofilme bacteriano na escala micrométrica. Para fazer isso, partículas magnéticas são introduzidas em um biofilme em crescimento para servir como sondas que podem ser acionadas remotamente sem perturbar as propriedades estruturais do biofilme. Pinças magnéticas dedicadas são então usadas para exercer uma força definida em cada partícula.

No filme de biofilme, o deslocamento de partículas induzido pela tração magnética é monitorado usando microscopia de vídeo para derivar os parâmetros viscoelásticos locais e fornecer a distribuição espacial 3D das propriedades mecânicas do biofilme. São obtidos resultados que mostram a heterogeneidade mecânica do biofilme de E coli e dão pistas sobre quais componentes do biofilme suportam as propriedades físicas do biofilme. Portanto, a principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como microscopia, cologia ou biovegetação inteira, é que ela relata a distribuição espacial das propriedades mecânicas in situ sem perturbar a estrutura original do material.

Para preparar partículas magnéticas para este protocolo, o frasco de estoque do vórtice de partículas de 2,8 micrômetros para ressuspendê-las. Em seguida, transfira 10 microlitros para um tubo de microcentrífuga. Em seguida, para lavar as partículas, adicione 190 microlitros de meio mínimo e gire o tubo, coloque-o em um suporte de amostra magnética, aguarde a formação de um pellet e aspire a solução supernat.

Repita esta etapa de lavagem mais duas vezes e ressuspenda as contas em 190 microlitros de meio mínimo. Em seguida, adicione 950 microlitros de M 63 B one com 0,4% de glicose a 50 microlitros da solução de grânulos lavados para ajustar a concentração de partículas para aproximadamente 5 milhões de grânulos por mililitro. Para preparar o canal, use um cortador de vidro diamantado para cortar dois capilares quadrados de vidro de silicato bo de 10 centímetros de comprimento para obter dois pedaços de oito centímetros de comprimento.

Usando o cortador de vidro, corte uma lâmina de vidro ao meio. Em seguida, usando uma cola de cianoacrilato de ação rápida ou supercola, prenda as duas peças capilares a duas lâminas de vidro, conforme mostrado neste diagrama. Dois centímetros de distância com uma saliência de um centímetro em cada extremidade autoclave toda a configuração e a tubulação necessária necessária.

Para posterior conexão do canal, reúna os seguintes materiais estéreis sob uma coifa de fluxo lanar. A tubulação e os conectores montados do canal, dois filtros ou armadilhas pediátricas da bolha. Duas pinças, seringas de 30 mililitros cheias de M 63 B, 1,4% de glicose e o frasco de resíduos.

Conecte os dois capilares da mesma maneira. Usando um dos tubos. Conecte o frasco de resíduos a uma extremidade capilar.

Em seguida, usando conectores de trava de isca como junções, conecte a outra extremidade do capilar à armadilha de bolhas caseira ou prenda uma e prenda uma para prender duas. Em seguida, conecte a seringa M 63 B de 30 mililitros uma à armadilha dois. Em seguida, preencha a configuração com estéril M 63 B um com 0,4% de glicose.

Instale a seringa na bomba da seringa e ligue a bomba da seringa a uma taxa de cerca de cinco mililitros por hora acima das taxas experimentais. Rastreie e elimine cuidadosamente todas as bolhas no circuito, se necessário. Desconecte e reconecte o circuito ao tentar este procedimento.

Tenha cuidado para remover quaisquer bolhas antes e quando Introduzir a mistura de partículas celulares na tubulação, ajuda a colocar o lixo acima dos capilares, e isso ajudará no crescimento contínuo do biofilme. Deixe o meio fluir pelo sistema por 10 a 15 minutos. Enquanto isso, em um tubo de microcentrífuga, misture um mililitro da suspensão bacteriana na densidade óptica 0,5 com um mililitro da solução de grânulo lavada preparada anteriormente.

Desligue o fluxo, reconecte a tubulação e feche as braçadeiras. Em seguida, encha uma seringa de um mililitro com a mistura de esferas de bactérias e introduza-a no capilar. Após a armadilha de bolhas caseira, transfira o aparelho para o microscópio lá.

Instale o capilar no microscópio stage e coloque o recipiente de resíduos em um nível ligeiramente mais alto. Coloque a bomba de seringa na bancada ao lado do microscópio. Deixe o aparelho repousar por 15 a 20 minutos para permitir que as bactérias se instalem e se fixem na superfície do capilar.

Assim que as bactérias se ligarem ao capilar, abra as pinças e ajuste a taxa de fluxo na bomba da seringa e inicie o fluxo. Ao longo de 24 a 48 horas, um biofilme se desenvolverá na superfície capilar, focará no plano inferior capilar e iniciará a gravação em lapso de tempo das imagens da amostra. Normalmente, uma frequência de aquisição de duas imagens por minuto relatará adequadamente o crescimento do biofilme.

Este filme mostra o estágio inicial do biofilme logo após a injeção da mistura de partículas celulares. Na aquisição capilar, a frequência é de uma imagem por segundo e o filme é reproduzido a 10 quadros por segundo. Após quatro horas de crescimento, as partículas se desprenderam progressivamente da superfície para serem distribuídas no volume do biofilme.

As setas azuis marcavam eventos de destacamento. Aqui, a frequência de aquisição é de duas imagens por minuto e o filme é reproduzido a 15 quadros por segundo. Após 20 horas de crescimento, uma dúzia de partículas uniformemente distribuídas pode ser monitorada em um plano focal.

Este filme é feito em um plano intermediário, 20 micrômetros acima do fundo capilar. Foram adquiridas duas imagens por minuto. O filme é reproduzido a 15 quadros por segundo.

Uma vez que o biofilme semeado com partículas magnéticas esteja crescendo manualmente, aparafuse as pinças magnéticas no microscópio stage. Para garantir que os gradientes de campo magnético apropriados sejam gerados na zona de observação, certifique-se de que as pinças sejam colocadas conforme mostrado neste diagrama no qual a região de medição mostrada em vermelho está localizada a 300 micrômetros das bordas dos pólos esquerdo direito das pinças ao longo do eixo Y. A parte inferior do capilar é colocada 200 micrômetros abaixo da parte inferior da pinça.

Para realizar esta etapa, use o controle de movimento XY da platina do microscópio para trazer a borda do pólo magnético esquerdo e a borda esquerda do capilar. No mesmo campo de observação, ajuste a posição do poste a 300 micrômetros da borda do capilar usando o mostrador x do manipulador microm esquerdo da pinça. Faça a mesma operação no lado direito.

Em seguida, ajuste a posição da pinça ao longo do eixo Z em relação à parte inferior do capilar. Primeiro, alinhe a parte inferior dos postes com a parte inferior do capilar e desloque os postes. 200 micrômetros para cima.

Usando o botão Z do micro manipulador, defina os parâmetros do gerador de funções para 24 segundos de sinal zero e 16 segundos de quatro amperes. Corrente contínua com um gatilho. Envie para o obturador de luz de campo claro após 20 segundos.

Para sincronização de sinal, conecte a pinça ao gerador de funções através do amplificador de potência. Preste atenção para conectar corretamente os pólos em série para adquirir curvas de fluência distribuídas espacialmente. Pegue uma origem espacial, pegue a origem do eixo Z na parte inferior interna do capilar.

Anote a posição de controle Z do microscópio. Em seguida, localize a interseção dos eixos x e Y, que são definidos pela borda do capilar e pela borda da peça polar, respectivamente. Esta é a origem da análise.

Anote as coordenadas. Todas as coordenadas serão tomadas em relação a esta origem a seguir. Uma vez que o biofilme tenha crescido, usando o botão de controle de foco fino, ajuste a posição vertical do capilar para que o primeiro plano fique localizado de quatro a sete micrômetros acima do fundo capilar.

Esta fatia corresponde à fatia de biofilme na qual a origem do referencial espacial está localizada no canto superior esquerdo. Em seguida, ligue o gerador atual e acione manualmente a sequência de aquisição de imagem. Para iniciar a 42ª sequência de eventos, o fluxo de imagens adquirido aqui corresponde a um determinado plano e campo XY.

Depois que a sequência for capturada, mova o capilar para capturar um vídeo do novo campo. Continue repetindo esse processo para obter todos os vídeos necessários para analisar os dados. Abra as imagens na imagem J ou em um software de rastreamento de partículas equivalente para todas as pilhas adquiridas em todas as partículas.

Converta as imagens em arquivos de texto rastreando o deslocamento das partículas. Em seguida, usando um software de tratamento de dados, desenhe as curvas de deslocamento e converta as curvas de deslocamento em curvas de conformidade nas quais a conformidade total do material JFT é calculada em função do tempo de acordo com a fórmula de conformidade mostrada aqui, Esta fórmula descreve a relação entre a tensão aplicada e a deformação do material para uma partícula histórica de vermelhos, ou embutido no meio viscoelástico e incompressível como foi previamente estabelecido, e seus colegas de trabalho A partir do ajuste da curva de fluência para o modelo geral de hambúrgueres para materiais viscoelásticos derivam os parâmetros viscoelásticos J zero J um no zero em um primo para fornecer a distribuição espacial das curvas de fluência do biofilme foram coletadas em diferentes profundidades em um micro volume de biofilme de aproximadamente 200 por 200 por 40 micrômetros cúbicos. Os resultados típicos são mostrados aqui.

Os valores de J zero, a complacência elástica são dados em função do eixo Z ao longo da profundidade e do eixo y ao longo de uma dimensão lateral do biofilme. Cada ponto corresponde a um cordão para o qual a análise da curva de fluência forneceu um valor J zero. Os dados revelam que a conformidade local varia ao longo da profundidade do biofilme em quase três ordens de magnitude.

Além disso, uma forte heterogeneidade lateral ocorreu em todas as alturas do biofilme. Os dados também fornecem a distribuição dos valores de conformidade, que exibem uma forma generalizada e assimétrica. A comparação desses resultados com os obtidos anteriormente em outros polímeros biológicos sugere que as propriedades mecânicas do biofilme são suportadas por géis poliméricos altamente reticulados.

Em C duas medições de biofilme, as propriedades locais também foram realizadas sob diferentes condições ambientais, como menor vazão, como pode ser visto aqui. Os valores de complacência de um biofilme cultivado a 0,1 mililitro por hora ainda exibem um perfil mecânico altamente heterogêneo. Mas a clara dependência da profundidade Z da rigidez do biofilme observada no biofilme cultivado a um mililitro por hora desapareceu.

Esses resultados demonstram o impacto significativo das condições externas na organização do biofilme assistindo ao vídeo. Você deve ter uma boa compreensão de como mapear as propriedades viscológicas do Biofilm Institute sob condições de crescimento totalmente controladas.