Um Modelo murino de próstata humana Metástase Ortotópico

Este modelo ortotópico de cancro de próstata humana permite a quantificação do tamanho do tumor, as células tumorais, e a formação de metástases distinta circulante para o pulmão. Como as células deve escapar o principal órgão, entrar na corrente sanguínea, e implantar em um site secundário, este modelo recapitula efetivamente o cenário em seres humanos.

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar o tamanho do tumor primário, a formação de metástases pulmonares e o número de células tumorais circulantes em um modelo de camundongo de câncer de próstata humano. Isso é conseguido pela implantação direta de células de câncer de próstata humano no lobo ventral da próstata de um camundongo babsi atímico. Após o desenvolvimento dos tumores, os fêmures e o sangue cardíaco são removidos do animal, permitindo a identificação das células tumorais circulantes.

Finalmente, os tumores primários e os pulmões são removidos para análise. Em última análise, alterações no tamanho do tumor primário, peso e características moleculares, bem como a formação de metástases pulmonares, podem ser medidas. A principal vantagem desta técnica sobre outras técnicas, como a veia da cauda ou a injeção intercardíaca, é que, com esta técnica, a extensão total da metástase pode ser medida a partir da formação do extravasamento do tumor primário e da sobrevivência na corrente sanguínea e da chegada e formação de uma metástase secundária em um novo local.

As implicações desta técnica estão relacionadas ao tratamento da metástase do câncer de próstata humano. Usamos esse modelo para testar os efeitos de várias terapias de moléculas pequenas na inibição da metástase do câncer de próstata humano. Além disso, o modelo pode ser usado para validar potenciais alvos terapêuticos para inibir a metástase do câncer de próstata humano Comece usando bolas de algodão estéreis e Betadine para esfregar a região abdominal inferior de um camundongo atímico anestesiado de seis a oito semanas de idade.

Em seguida, limpe a área com um lenço umedecido com álcool e, em seguida, limpe o animal com uma solução de Betadine. Depois de deixar a área secar, use uma tesoura cirúrgica estéril afiada para fazer uma incisão abdominal na linha média baixa de três a quatro milímetros. Em seguida, use uma pinça para levantar suavemente a bexiga sem mover nenhum outro órgão ou músculo e identifique o lobo ventral da próstata localizado diretamente abaixo da bexiga.

Agora injete a população de células tumorais de interesse com uma seringa de 0,5 cc equipada com uma agulha de calibre 28 e meio na próstata ventral, minimizando o vazamento e garantindo que uma pequena bolha seja observada dentro do tecido. Em seguida, substitua a bexiga e use suturas de monofilamento de Vicryl absorvíveis 4.0 para fechar a camada muscular em um padrão simples interrompido. Feche a camada de pele com grampos estéreis de nove milímetros.

Após quatro a seis semanas, os tumores são visualmente aparentes ou podem ser palpados após a eutanásia. Use uma tesoura cirúrgica para cortar horizontalmente diretamente sob a caixa torácica, depois verticalmente na axila para expor o coração, remova o sangue do animal usando uma punção cardíaca terminal usando uma tesoura cirúrgica, corte a traqueia e remova os pulmões e coloque imediatamente os pulmões em um de tecido e depois em um recipiente contendo 10% de formalina. Em seguida, individualmente, corte todos os vasos sanguíneos ligados ao tumor primário da próstata, tomando cuidado para garantir que nenhum órgão adicional esteja anexado, registre o peso e o tamanho do tumor.

Em seguida, encaixe imediatamente, congele o tecido em nitrogênio líquido ou coloque o tecido em um de tecido e, em seguida, em um recipiente contendo 10% de formina. Por fim, use uma tesoura cirúrgica para expor as articulações do quadril e do joelho. Em seguida, desconecte as pernas, tomando cuidado para manter o fêmur intacto antes de colocá-las em solução salina estéril.

Nesta primeira figura, são mostradas as mudanças no peso corporal e no consumo alimentar de camundongos seis semanas após a inoculação do tumor. Observe que há uma pequena queda no peso corporal e no consumo de alimentos na data da cirurgia devido à anestesia. Durante o curso do experimento, o peso corporal e o consumo de alimentos aumentam lentamente após a cirurgia e começam a diminuir no final do experimento.

À medida que a carga tumoral atinge um nível crítico nesses gráficos, tamanhos representativos do tumor são mostrados. Os tamanhos individuais dos tumores variam, mas, em média, tumores de aproximadamente um grama de peso e um centímetro cúbico de tamanho são alcançados conforme ilustrado. Aqui, é importante considerar as mudanças no peso e no tamanho do tumor que ocorrem entre quatro e seis semanas.

Ao planejar o ponto final do experimento neste experimento representativo durante as últimas duas semanas, o peso médio do tumor aumentou 2,7 vezes e o tamanho do tumor cresceu 1,9 vezes drasticamente. Influenciando os resultados experimentais, podem ser observadas alterações no total de células metastáticas por pulmão e necropsia de camundongos em quatro versus seis semanas, bem como ilustradas neste gráfico. Os camundongos sacrificados em quatro semanas não mostraram desenvolvimento metastático, enquanto os camundongos seis semanas após a inoculação do tumor mostraram células metastáticas em todos os camundongos.

Avaliado ainda ressaltando a importância de que as necropsias de camundongos sejam realizadas em um endpoint de estágio tardio para garantir a ocorrência de metástase. Esses tempos podem variar de acordo com a linha celular ou com modificações genéticas. O número de metástases pode ser quantificado de três maneiras diferentes.

Por exemplo, o número total de células de câncer de próstata humano positivas para GFP pode simplesmente ser contado usando coloração imuno-histoquímica para GFP ou usando coloração h e e, como nessas imagens em que uma célula individual com magnitude 40 x é destacada com uma seta. Observe a coloração marrom na seção pulmonar corada com GFP e grandes núcleos distintos. Outra maneira de quantificar o número de metástases é considerar o número de locais onde os depósitos metastáticos estão presentes.

Por exemplo, nesta imagem com magnitude de 10 x, vários loci de números de células variados, cada um destacado com uma seta, podem ser observados nesta imagem de magnitude aumentada, um loci com três células distintas também é destacado. Finalmente, o número de metástases distintas, conforme definido por um grupo de células claramente ligado mostrando cinco ou mais células de câncer de próstata humano GFP positivas, também pode ser quantificado como nesta imagem onde um depósito metastático de 10 células é mostrado nestes três últimos gráficos, experimentos QR TPCR R representativos medindo a expressão de três genes de interesse na metaloproteinase da matriz de progressão metastática tipo dois, metaloproteinase da matriz tipo nove e proteína de choque térmico 27 em amostras individuais de tumores coletadas de camundongos em seis semanas são mostradas. Ao desenvolver inicialmente esta técnica, é importante trabalhar com sua unidade de animais e equipe veterinária para administrar adequadamente anestesia, analgésicos e minimizar a coação cirúrgica.