Drosophila melanogaster: Coleta e Preparação de Embriões e Larvas

<em>Drosophila melanogaster</em> Embryo and Larva Harvesting and Preparation

JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

Drosophila melanogaster Embryo and Larva Harvesting and Preparation

3.9: C. elegans Development and Reproduction

3.15: C. elegans Chemotaxis Assay

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08:14 min

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May 10, 2013

Overview

Embriões e larvas de melanogaster de Drosophila são fáceis de manipular e se desenvolver rapidamente por mecanismos análogos a outros organismos, incluindo mamíferos. Por essas razões, muitos pesquisadores utilizam embriões de moscas e larvas para responder a perguntas em diversos campos que vão do comportamento à biologia do desenvolvimento. Antes da experimentação, no entanto, os embriões e larvas devem primeiro ser coletados.

Este vídeo demonstrará primeiro como “copos de criação de ovos” são usados para coletar embriões de Drosophila em placas de ágar. A colheita e descorção de embriões serão então descritas. Em seguida, o vídeo demonstrará como identificar e manipular Drosophila em um dos três estágios larvais que seguem o estágio do embrião. Finalmente, são fornecidos exemplos de algumas das maneiras pelas quais embriões e larvas de moscas são usados em pesquisas biológicas.

Procedure

Embriões e larvas de melanogaster de Drosophila são fáceis de manipular e seu desenvolvimento é guiado por mecanismos que existem em outros organismos, incluindo mamíferos. Aprender a colher e preparar embriões e larvas é um passo preliminar em muitos processos experimentais, desde a biologia comportamental até o desenvolvimento. Este vídeo abordará os métodos padrão de coleta e colheita de embriões e larvas de Drosophila, procedimentos essenciais no uso deste versátil organismo modelo.

O estudo do embrião de Drosophila forneceu uma grande visão da forma como os genes regulam o desenvolvimento, desde o mRNA expresso como um gradiente no oócito, até os genes que formam o plano corporal segmentado anterior a posterior. Alguns desses genes, como os genes da caixa de homeobox são altamente conservados entre este inseto e mamíferos.

A natureza saudável dos embriões de Drosophila permite que eles resistam à exposição a ambientes e produtos químicos severos, o que os torna extremamente práticos de estudar.

Após a fertilização, uma mosca fêmea pode colocar até 100 embriões por dia, que eclodirão em larvas após 12-15 horas.

Para manipular embriões de Drosophila, eles devem primeiro ser coletados.

Os embriões são coletados em câmaras de colocação de ovos muitas vezes referidas como “xícaras de colocação de ovos”.

Para montar o copo de colocação, primeiro faça furos ou corte parte de um recipiente e cubra-o com material poroso para permitir a ventilação. Em seguida, obtenha uma placa de ágar de suco de maçã ou uva, listra-lo com pasta de levedura, e arranhar as placas no centro. A presença de pasta de levedura induzirá a colocação de ovos.

Adicione rapidamente moscas à câmara de colocação de ovos, inverta a câmara para que a placa fique na parte inferior, e deixe incubar. Após o tempo de incubação desejado inverta a câmara de ovos e bata-a no topo do banco algumas vezes. As moscas caem para o fundo e são brevemente desorientadas. Substitua rapidamente a placa de ágar antiga pela placa fresca em camadas com a pasta de levedura. Para adquirir os embriões mais envelhecidos troque as placas a cada 1-3 horas.

As placas terão centenas de embriões, especialmente perto dos arranhões e leveduras.

20 moscas de cada sexo devem produzir 100-200 embriões por hora. Agora os embriões podem ser colhidos.

As ferramentas necessárias para a colheita de embriões são um coador ou peneira, que pode variar muito em tamanho e complexidade, um pincel e água destilada.

Primeiro, solte os embriões imergindo a placa com água destilada, escovando suavemente a superfície com um pincel. Em seguida, filtrar o líquido despejando a mistura na peneira. Enxágüe os embriões com água.

A lavagem é frequentemente seguida pela descorionação — a remoção da membrana externa dura do embrião, ou chorão.

A descorção pode ser feita manualmente através de uma dissecção do embrião fora da baia coriônica. Alternativamente, os embriões podem ser colocados em 50% de alvejante. Leva de 2 a 10 minutos para o acorde se dissolver, como observado pelo desaparecimento dos apêndices dorsais. Enxágüe bem com água destilada para garantir que o embrião nu não seja danificado por alvejante. A descorção é um pré-requisito para técnicas como microinjeção e imagem de células vivas.

Agora que você tem uma sensação de biologia embrião, coleta e colheita, vamos passar para o próximo estágio no ciclo de vida de Drosophila: larvas.

As larvas de drosophila têm três estágios “instar”, ou de fundidos. O primeiro instar dura um dia, o segundo outro dia, e o terceiro mais dois dias. Primeira e segunda larvas instar são encontradas na comida do frasco 1-3 dias depois de configurar uma cruz. No quarto dia, terceiras larvas instar migram para cima, ou “vagueiam” pelos lados do recipiente, onde finalmente formarão casulos chamados pupas.

Larvas são frequentemente usadas para experimentação por causa de seus discos imagináveis. Discos imagináveis são órgãos parcialmente desenvolvidos que são conhecidos por se tornarem partes inteiras da mosca adulta. Por exemplo, um disco de olho imaginável se tornará um olho adulto, discos antenas se tornarão antenas, e discos de asa imaginais se tornarão asas. O estudo de discos imagináveis levou a importantes descobertas em Drosophila, como o papel dos genes homeobox na formação de padrões.

A coleta de larvas é mais simples do que a coleta de embriões, pois não requer a transferência de moscas para habitação especial.

Larvas individuais podem ser removidas com pinças ou uma espátula. Ao coletar um grande número de larvas em estágio inicial, você pode empregar um método alternativo de coleta usando uma solução de sacarose, que é mais densa do que as larvas e faz com que elas flutuem.

Adicione a solução de sacarose ao frasco, que flutua larvas até o topo. Desaloja a comida colocando o frasco em um rotador. Em seguida, remova larvas com uma escova ou pipeta e colher para experimentos.

Agora que cobrimos técnicas de coleta e colheita de embriões e larvas, agora vamos ver como aplicá-las à experimentação.

Como são móveis, as larvas de Drosophila podem ser usadas para experimentos comportamentais.

Aqui você vê um “ensaio rastejante”, que é usado para avaliar o comportamento locomotor de Drosophila em condições específicas. O ensaio rastejante mede a distância que a larva percorre, a fim de observar os efeitos de uma droga na função motora. As larvas coletadas estão imersas em uma solução de sacarose drogada que está prevista para interferir com a motilidade.

Microinjeção é um procedimento para criar moscas de frutas geneticamente modificadas, conhecidas como mutantes transgênicos, inserindo material genético personalizado na forma de um plasmídeo de DNA circular.

Esses embriões são descorioados por enrolar fisicamente em fita dupla face para que os produtos químicos não os danifiquem. Embriões podem então ser injetados com plasmídeos que codificam proteínas, como tubulina, fundidas com proteínas fluorescentes de repórteres, como a GFP. Experimentos podem então ser realizados para visualizar processos celulares como mitose de linhas de mosca transgênicas estabelecidas.

Embriões podem ser usados para visualizar a presença de transcrições através da hibridização fluorescente in situ.

Neste experimento, embriões inteiros são observados para a presença de uma transcrição mRNA desejada via microscopia de fluorescência. Os embriões são fixados usando uma solução bifásica que deschorionatos e, portanto, prepara o embrião para coloração. Os embriões nus estão na camada inferior. Após a coloração imunofluorescente, a presença da proteína desejada pode ser vista usando microscopia de fluorescência.

Você acabou de assistir o vídeo de colheita e preparação de embriões e larvas do JoVE. Revisamos a coleta, colheita e preparação de embriões e larvas e algumas aplicações importantes aplicadas aos organismos em estágio inicial. Obrigado por assistir!

Transcript

Drosophila melanogaster embryos and larvae are easy to manipulate and their development is guided by mechanisms that exist in other organisms, including mammals. Learning to harvest and prepare embryos and larvae is a preliminary step in many experimental processes from behavioral to developmental biology. This video will cover the standard methods for collecting and harvesting Drosophila embryos and larvae, essential procedures in the use of this versatile model organism.

The study of the Drosophila embryo has provided great insight into the manner by which genes regulate development, from the mRNA that is expressed as a gradient in the oocyte, to the genes that form the anterior-to-posterior segmented body plan. Some of these genes, like the homeobox genes are highly conserved between this insect and mammals.

The hearty nature of Drosophila embryos allows them to withstand exposure to harsh environments and chemicals, which makes them extremely practical to study.

After fertilization one female fly can lay up to 100 embryos per day, which will hatch into larvae after 12-15 hours.

In order to manipulate Drosophila embryos, they must first be collected.

Embryos are collected in egg-laying chambers often referred to as “egg-laying cups”.

To assemble the laying cup, first poke holes or cut out part of a container and cover it with porous material to allow for ventilation. Then obtain an apple or grape juice agar plate, streak it with yeast paste, and scratch the plates in the center. The presence of yeast paste will induce egg laying.

Quickly add flies to the egg-laying chamber, invert the chamber so the plate is at the bottom, and allow it to incubate. After the desired incubation time invert the egg chamber and bang it on the bench top a few times. The flies fall to the bottom and are briefly disoriented. Quickly replace the old agar plate with the fresh plate layered with the yeast paste. To acquire the best-aged embryos change the plates every 1-3 hours.

Plates will have hundreds of embryos, especially near the scratches and yeast.

20 flies of each sex should produce 100-200 embryos per hour. Now the embryos can be harvested.

The tools needed for embryo harvesting are a strainer or sieve, which can vary greatly in size and complexity, a paintbrush, and distilled water.

First, loosen embryos by immersing the plate with distilled water, gently brushing the surface with a paintbrush. Next, filter out liquid by pouring the mixture into the sieve. Rinse the embryos with water.

Rinsing is often followed by dechorionation — the removal of the hard outer membrane of the embryo, or chorion.

Dechorionation can be done manually via a dissection of the embryo out of the chorionic sheath. Alternatively, embryos can be placed into 50% bleach. It takes 2-10 minutes for the chorion to dissolve, as noted by the disappearance of the dorsal appendages. Rinse thoroughly with distilled water to make sure the naked embryo is undamaged by bleach. Dechorionation is a prerequisite to techniques like microinjection and live cell imaging.

Now that you have gotten a sense of embryo biology, collection, and harvesting, let’s move on to the next stage in the Drosophila life cycle: larvae.

Drosophila larvae have three “instar,” or molting, stages. The first instar lasts one day, the second another day, and the third two more days. First and second instar larvae are found in the food of the vial 1-3 days after setting up a cross. On the 4th day, third instar larvae migrate up, or “wander” up the sides of the container, where they will ultimately form cocoons called pupae.

Larvae are often used for experimentation because of their imaginal discs. Imaginal discs are partially developed organs that are known to become whole parts of the adult fly. For example, an imaginal eye disc will become an adult eye, antennal discs will become antennae, and imaginal wing discs will become wings. The study of imaginal discs has led to important discoveries in Drosophila, such as the role of homeobox genes in pattern formation.

Larvae collection is simpler than embryo collection, because it does not require the transfer of flies into special housing.

Individual larva can be removed with tweezers or a spatula. When collecting a large number of early stage larvae you can employ an alternative collection method using a sucrose solution, which is more dense than the larvae and causes them to float.

Add sucrose solution to the vial, which buoys larvae to the top. Dislodge the food by placing the vial on a rotator. Then remove larvae with a brush or pipette and harvest for experiments.

Now that we’ve covered collection and harvesting techniques for embryos and larvae, now let’s see how to apply them to experimentation.

Since they are mobile, Drosophila larvae can be used for behavioral experiments.

Here you see a “crawling assay”, which is used to evaluate Drosophila locomotor behavior under specific conditions. The crawling assay measures the distance the larva travels, in order to observe the effects of a drug on motor function. Collected larvae are immersed in a drugged sucrose solution that is predicted to interfere with motility.

Microinjection is a procedure for creating genetically modified fruit flies, known as transgenic mutants, by inserting customized genetic material in the form of a circular DNA plasmid.

These embryos are dechorionated by physically rolling them on double-sided tape so chemicals won’t damage them. Embryos can then be injected with plasmids that encode proteins, like tubulin, fused with fluorescent reporter proteins, like GFP. Experiments can then be performed to visualize cellular processes like mitosis from established transgenic fly lines.

Embryos can be used to visualize the presence of transcripts through fluorescent in situ hybridization.

In this experiment, whole embryos are observed for the presence of a desired mRNA transcript via fluorescence microscopy. The embryos are fixed using a biphasic solution that dechorionates, and therefore prepares the embryo for staining. The naked embryos are on the bottom layer. After immunofluorescent staining, the presence of the desired protein can be seen using fluorescence microscopy.

You’ve just watched JoVE’s embryo and larva harvesting and preparation video. We reviewed the collection, harvesting, and preparation of embryos and larvae and some important applications applied to the early stage organisms. Thanks for watching!

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