Detecção de Vivo Escherichia coli O157: H7 Células por PMA-qPCR

Um ensaio de qPCR foi desenvolvido para a detecção de Escherichia coli O157: H7 alvo um marcador genético único, Z3276. A qPCR foi combinado com propidium monoazide (PMA) o tratamento para a detecção de células vivas. Este protocolo foi modificado e adaptado a um formato de placa de 96 poços para uma fácil manipulação e consistente de numerosas amostras

O objetivo geral do experimento a seguir é desenvolver um ensaio A-Q-P-C-R que possa ser usado para detecção seletiva de células vivas de e coli oh 1 57 H sete. O quadro de leitura aberto Z 32 76 foi identificado como um marcador genético único que pode ser usado em um ensaio Q PCR R, que é sensível e específico para e coli oh 1 57 H sete após a preparação de misturas de células vivas e mortas. Eles são incubados com monoácido propídio ou agitação PMA permite que o PMA entre nas células mortas, mas não dentro das células vivas.

Em seguida, o DNA é extraído e a QPCR é realizada nas células vivas e mortas tratadas e não tratadas Os resultados são obtidos que mostram que o tratamento com PMA remove eficientemente o DNA das células mortas e, essencialmente, não afeta a amplificação do DNA das células vivas, levando à detecção específica de células vivas e coli oh 1 5 7 H sete. A principal vantagem desta técnica, nossos métodos existentes, como o ensaio QPCR disponível para detecção de e coli oh 1 5 7 H sete, é que este protocolo pode ser usado para detecção seletiva de e coli viva oh um sete H sete células. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de detecção de patógenos food boy, como a superestimação do DNA de células vivas em amostras.

As implicações desta técnica podem se estender à detecção de outros patógenos e ao uso de Z 32 76 como um marcador genético único para e coli, O 1 57. H seven fornece ao ensaio alta sensibilidade e especificidade e potencial para ensaios multiplex. Cultive 10 mililitros de e coli oh 1 5 7 H sete a 37 graus Celsius até a fase exponencial média e divida a cultura em duas alíquotas.

Ferva uma alíquota de células por 10 minutos em banho-maria para as células mortas e deixe a outra alíquota para as células vivas. Verifique se não há células vivas da alíquota morta pelo calor, colocando as células em APLs LB e incubando-as a 37 graus Celsius durante a noite. Enquanto isso, pegue dois mililitros das células vivas e de kilt de calor e ajuste a concentração para 8 milhões de UFC por mililitro com meio LB para criar quatro conjuntos de diluição de células vivas variando de oito UFC por mililitro a 8 milhões de UFC por mililitro para os dois primeiros conjuntos de rótulo de diluição celular.

Um como células vivas tratadas com PMA e o outro como amostra de controle viva não tratada para o terceiro e quarto conjuntos de diluição celular. Adicione 8 milhões de células mortas a cada diluição celular para fazer misturas de células vivas e mortas. O terceiro conjunto de diluído será tratado com PMA e o quarto conjunto de diluído servirá como controle de mistura não tratada em alíquotas de 400 microlitros de células vivas, células mortas e mistura de células vivas e mortas.

Em três microtubos separados, adicione dois microlitros de uma solução estoque de PMA de 10 milimolares a cada célula, alíquota até uma concentração final de 50 micromolares. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante cinco minutos no escuro durante a incubação. Agite cada tubo suavemente algumas vezes, três segundos de cada vez.

Em seguida, adicione 100 microlitros das amostras em uma placa de 96 poços, sele a placa com um filme óptico e coloque a placa no gelo. Coloque a placa a 20 centímetros de uma fonte de luz halógena de 650 watts e exponha a placa à luz por dois minutos. Em seguida, centrifugue o prato a 2.500 queijos por 10 minutos após a centrifugação, descarte delicadamente o snat e escorra cuidadosamente o prato em um pedaço de papel absorvente.

Suspenda novamente os grânulos celulares em 50 microlitros de solução de extração de DNA pipetando para cima e para baixo 20 vezes com um multicanal Pipet man, sele a placa com um filme e ferva por 10 minutos em banho-maria antes da centrifusão a 2.500 Gs por dois minutos. O sobrenadante na placa é o DNA das células tratadas com PMA e está pronto para QPCR. Prepare as misturas de reação QPCR combinando dois x mestre de PCR em tempo real.

Misture o primer dianteiro e o primer reverso e a sonda. Consulte o protocolo de texto para obter detalhes sobre o design do primer e da sonda. Em seguida, transfira a mistura de reação QPCR para poços individuais de uma nova placa de 96 poços.

Para cada uma das células vivas e mortas tratadas e não tratadas, adicione cinco microlitros de amostra de DNA e um volume apropriado de água para atingir um volume final de 50 microlitros. Para o controle sem molde, use cinco microlitros de água para substituir a amostra de DNA. Em seguida, defina as condições de QPCR como 95 graus Celsius por 10 minutos para ativação do TAC man, seguido por 40 ciclos de 95 graus Celsius por 10 segundos para desnaturação e 60 graus Celsius.

Por um minuto de uma extensão ajoelhada, prossiga para realizar QPCR nas células vivas e mortas tratadas e não tratadas. Os efeitos da inibição mediada por PMA da amplificação do DNA de células mortas neste ensaio de QPCR são mostrados aqui usando DNA derivado de diluições de células vivas ou mortas. Os resultados mostraram que as curvas geradas a partir das células vivas tratadas com PMA e sem PMA pareciam lineares e quase idênticas entre si.

Ligeiras diferenças no ciclo de limiar ou no valor de CT foram mostradas entre as células vivas tratadas com PMA e sem PMA, sugerindo que o tratamento com PMA teve pouco efeito na amplificação do DNA das células vivas no QPCR. Por outro lado, uma diferença de 15 valores de CT foi mostrada entre as células mortas tratadas com PMA e sem PMA, demonstrando que o tratamento com PMA suprimiu eficientemente a amplificação do DNA das células mortas. Dois conjuntos de diluição de células vivas foram tratados com PMA ou sem PMA para detectar células vivas a partir de misturas de células vivas mortas.

Os resultados de QPCR demonstraram uma tendência progressiva inversa paralela dos valores de TC em relação ao número de células vivas tratadas para as amostras não tratadas. As células vivas tratadas produziram valores de CT um pouco mais altos do que os de células vivas não tratadas. Uma tendência progressiva inversa semelhante nos valores de CT foi observada com o número real de células vivas nas misturas de células vivas mortas tratadas com PMA.

Além disso, essa tendência de queda dos valores de CT foi observada com o número de células vivas nas misturas, apesar da presença de um milhão de células mortas. Esses resultados mostraram que os valores de CT das misturas de células mortas vivas representavam o DNA apenas das células vivas e que a amplificação do DNA das células mortas foi eficientemente suprimida pelo tratamento com PMA Uma vez dominado. Esta técnica pode ser feita em duas horas se for muito bem executada durante a tentativa.

É importante lembrar deste procedimento para ter uma boa exposição à luz para as amostras tratadas com PM para garantir que o tratamento com PME seja completo e, ao mesmo tempo, para proteger a célula viva nas amostras após este procedimento. Outros métodos, como ensaios de QPCR, podem ser realizados como um ensaio de PCR regular em tempo real.