Name: Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-07T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Aprenda a cultivar neuroesferas de glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para estudos pré-clínicos. Este método preserva as características moleculares do tumor original e permite testes terapêuticos em modelos animais relevantes.

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Este trabalho foi financiado pelo Centro de Tumores Cerebrais Hermelin, Hospital Henry Ford.

1. Suspensão celular única do espécime glioblastoma cirúrgico fresco para a cultura da neurosfera
<ol><li>Com consentimento por escrito dos pacientes e de acordo com as diretrizes institucionais, colete amostras de tumores para cultura celular imediatamente após a cirurgia de ressecção de glioma de alto grau.</li>
	<li>Confirme o diagnóstico da amostra de tumor pela histopatologia. Transporte imediatamente o espécime da sala de operação para a capa de cultura de tecido de fluxo laminar, para processamento dentro de 1 hora da cirurgia. NOTA: Para cirurgias em um local remoto, corte a amostra de tumor em fragmentos menores e coloque em um tubo contendo DMEM/F12 (mantenha no gelo). O tumor pode ser processado várias horas após a cirurgia.</li>
	<li>Começando com 200-500 mg de tecido (ótimo), pique a amostra do tumor usando uma lâmina de bisturi, e transfira para um tubo de 15 ml contendo 10 ml de ml de meio livre de soro DMEM/F12. Misture invertendo várias vezes, deixe que os pedaços tumorais sedimentem por gravidade, removam o meio e repitam conforme necessário.</li>
	<li>Prepare a solução de dissociação de tecido enzimático e stop solution fresco.<ol>
<li>Solução de Dissociação de Tecidos Enzimáticos: 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA, 2,5 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) solução de cálcio e magnésio, 2,5 ml Solução de estoque de colagenase IV (2.000 U/ml em HBSS com cálcio e magnésio).</li>
		<li>Solução stop: solução inibidora de trypsin de 5 ml, 5 ml DMEM/F12, 2 μl de 5.000 U/ml DNAse I (fabricada em HBSS sem cálcio e magnésio).</li>
	</ol></li>
	<li>Remova o meio e adicione solução de dissociação de tecido enzimático à amostra de tumor picado, utilizando 2 ml para cada tecido de 0,5 g. Misture suavemente invertendo.</li>
	<li>Incubar o tecido em solução a 37 °C em uma incubadora de cultura tecidual em rotação por 30 minutos.</li>
	<li>Triturar com uma pipeta de 2 ml e parar a digestão ou retornar à incubadora para outra incubação de 15-30 min, dependendo do nível de digestão.</li>
	<li>Pare a digestão adicionando 2 volumes de Stop Solution e triturar mecanicamente com uma pipeta sorológica de 5 ml.</li>
	<li>Filtre o material não digerido através de um coador de células de 40 μm. Pelota as células a 800 x g para 5 min na temperatura da sala, seguida pela lavagem de 3x em 10 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Resuspense a última pelota celular em 5 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Camada lenta da suspensão celular acima de 5 ml de Linfolito-M e pelota a 1.300 x g por 20 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfira a camada de interface contendo as células nucleadas para um tubo de 15 ml contendo 10 ml de DMEM/F12.</li>
	<li>Pelota as células a 800 x g por 5 min a temperatura ambiente. Repita a lavagem com DMEM/F12 2x a mais.</li>
	<li>Criopreserve as células únicas resultantes para uso posterior, reutilizando a pelota no Meio de Congelamento de Células de Recuperação, aliquoting em criovias, congelamento lento e armazenamento em nitrogênio líquido.</li>
	<li>Para a cultura, resuspenque as células em Neurosphere Medium suplementada com Fatores de Crescimento (NMGF), e placa em densidade relativamente baixa (<1 x 105 células/ml) em um frasco regular de cultura tecidual T25 sob condições padrão, 5% CO2, 37 °C, incubadora de cultura tecidificada(Figura 1A).<ol>
<li>Prepare o NMGF usando a seguinte receita<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="384">
<colgroup>
<col>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;width:188px;">Por 500 ml de DMEM/F12</td>
					<td style="width:79px;"></td>
					<td style="width:117px;"></td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Solução de estoque</td>
					<td>volume</td>
					<td>concentração final</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Suplemento N2 (10x)</td>
					<td>5 ml</td>
					<td>1x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Solução de estoque BSA de 250 mg/ml</td>
					<td>1 ml</td>
					<td>0,5 mg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Reagente gentamicina de 10 mg/ml</td>
					<td>1,25 ml</td>
					<td>25 μg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100x antibiótico/antimíctico</td>
					<td>2,5 ml</td>
					<td>0,5x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td>100 mg/ml bFGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100 mg/ml EGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
</tbody>
</table>
</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira neuroesferas que se formam ao longo de 1-3 semanas(Figuras 1B-E) para frascos frescos, para separar de células e detritos anexados. Realize alterações parciais na mídia a cada 3-4 dias. NOTA: Se dissociar o tumor de xenoenxerto ortotópico usando o protocolo acima, as etapas 1.11-1.13 podem ser omitidas.</li>
</ol>2. Manutenção da Cultura da Neurofera glioblastoma e aplicações a jusante
<ol><li>
Dissociação: Monitore as culturas da neurosfera e realize alterações médias parciais a cada 3-4 dias. Quando a maioria das neuroesferas multicelulares no frasco atingir 100 μm de diâmetro, dissocia-se em uma única suspensão celular:<ol>
<li>Transfira o meio contendo as neurosferas para um tubo de 15 ml, sedimento gravitacional as neuroesferas por cerca de 5 minutos, remova o meio e resuspenda a pelota celular em 10 ml de DPBS sem cálcio e magnésio.</li>
		<li>Misture e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente, como as células sedimentam por gravidade.</li>
		<li>Remova 7-8 ml de DPBS e dissociar as neurosferas mecanicamente com uma pipeta sorológica pré-enlatado.</li>
		<li>Pelota as células dissociadas a 800 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passagem: Resuspenque as células dissociadas (etapa 2.1.) no NMGF e divida no número necessário de frascos (1:3) e incuba em condições padrão. Neuroesferas secundárias se formarão, e devem ser posteriormente dissociadas para a formação de esferas terciárias.</li>
	<li>
Avaliação da auto-renovaçãoa longo prazo : Repita o procedimento de dissociação até que a cultura da neurosfera atinja pelo menos 10 passagens, o equivalente a um mínimo de 2 meses de cultura.</li>
	<li>
Congelamento: Para criopreservar as neurosferas, dissociar as neurosferas (passo 2.1.) e resuspensar a pelota celular no Meio de Congelamento celular de recuperação, alíquota em criovial, congelamento lento e armazenar em nitrogênio líquido.<ol>
<li>Para cultivar células da neurosfera a partir de um estoque congelado: descongelar as células a 37 °C e transferir imediatamente para um tubo de 15 ml contendo 10 ml DMEM/F12. Misture o tubo suavemente e gire as células a 800 x g por 5 min a 4 °C. Lave a pelota celular mais uma vez e resuspenja as células em NMGF e transfira para um frasco de cultura tecidual T25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Suspensão celular para implante intracraniano em camundongos imunocomprometidos:<ol>
<li>Dissociar as neuroesferas (passo 2.1.) e resuspensar a pelota celular em DPBS livre de cálcio e magnésio. Conte células viáveis usando um hemócito e exclusão azul trypan.</li>
		<li>Calcule o número de células necessárias para o implante, tipicamente 3 x 105 células/rato, transfira o número desejado de células para um frasco e pelota as células a 1.000 x g.</li>
		<li>Resuspenque a pelota celular em um volume apropriado para implante (5 μl/mouse) tocando suavemente o tubo de microcentrifuge. Coloque a suspensão da célula no gelo e use dentro de 2 horas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Protocolo Alternativo para Culturing Tumorigenic Glioblastoma Cells (para os casos em que a cultura da neurosfera falha)
<ol><li>Suplemente o meio NMGF com soro bovino fetal a uma concentração final de 2% FBS/NMGF.</li>
	<li>
Começando com células na cultura NMGF: Colher células viáveis do frasco NMGF(Figura 1F),resuspend em 2% FBS/NMGF e placa em densidade relativamente baixa (<1 x 105 células/ml) em um frasco regular de cultura tecidual T25, e cultura em condições padrão, 5% CO2, 37 °C, incubadora de cultura tecidificada(Figura 1G).</li>
	<li>
Começando com células nunca cultivadas congeladas (passo 1.14.): Descongelar as células, lavar em meio e placa sem soro em 2% FBS/NMGF e cultura como descrito na etapa 3.2. A cultura no NMGF por 3 dias antes de transferir células viáveis para 2% FBS/NMGF é uma alternativa para pré-selecionar células diferenciadas.</li>
</ol>4. Análise morfológica e molecular das neuroesferas por imunohistoquímica
<ol><li>Cultue as neuroesferas até que a maioria dos esferoides multicelulares flutuantes atinjam 100 μm de diâmetro.</li>
	<li>Remova os frascos de cultura da incubadora e pelota imediatamente as neurosferas, remova o meio e adicione 10 ml de DPBS sem perturbar a pelota. Remova o DPBS, resuspend em formalina tamponada 10% neutra e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Pelota os esferoides, resuspense em 30% etanol e incuba por 30-45 min.</li>
	<li>Substitua 30% de etanol por 50% de etanol, incuba por 15 min e substitua por 50% de etanol fresco, incubar mais 30 min.</li>
	<li>Repita (passo 4,4.) com 70% de etanol.</li>
	<li>Substitua por 95% de etanol duas mudanças de 10-20 min cada, e repita com etanol absoluto até que os esferoides sejam brancos brilhantes e condensados.</li>
	<li>Faça um pequeno cone de papel filtro do papel da lente e coloque-o em um pequeno funil em um béquer. Molhe o papel da lente com álcool absoluto.</li>
	<li>Solte ligeiramente a pelota com etanol fresco 100%, despeje o excesso de etanol e despeje os esferoides através do cone de papel da lente, certificando-se de que eles vão para a ponta do cone. Enxágüe o tubo com etanol absoluto adicional e despeje todos os esferoides restantes através do cone de papel da lente.</li>
	<li>Retire o cone de papel do funil e mova cuidadosamente os esferoides para a parte inferior do cone. Dobre o papel em um quadrado e certifique-se de que os esferoides estejam o mais bem incluídos possível.</li>
	<li>Transfira as neuroesferas embaladas para um e transfira para um processador automático de tecido.</li>
	<li>Programe o processador automático de tecido da seguinte forma: etanol absoluto, 10 min, xileno, 15 min (2x), parafina, 10 min (4x).</li>
	<li>Remova o do processador e coloque-o na parte aquecida de um sistema de incorporação de parafina. Certifique-se de que toda a superfície está livre de fragmentos, poeira ou outros detritos e sifão para fora toda a parafina dos poços de aquecimento fórceps. Asseps livres de parafina quente e adicione uma pequena quantidade de parafina a um molde de base aquecido.</li>
	<li>Abra o, remova o pacote e coloque-o na parte aquecida do sistema de incorporação. Abra cuidadosamente o cone de papel até que os esferoides estejam visíveis. Reúna o máximo possível do material com fórceps pré-armados e transfira para a parafina líquida no molde base.</li>
	<li>Repita o necessário para recuperar o maior número possível de esferoides. Raspe suavemente o papel de tecido com uma lâmina de barbear limpa pré-armada que foi limpa com etanol para coletar quaisquer esferoides residuais sem colocar qualquer papel no bloco.</li>
	<li>Quebre cuidadosamente qualquer aglomerado esferoide com fórceps quentes. Mova os esferoides para longe dos cantos em uma camada central uniforme. Mova o molde base para a área de resfriamento para fixar os esferoides no lugar, adicione o, encha lentamente com parafina e esfrie bem.</li>
	<li>O bloco de parafina da neurosfera pode ser usado para secção normal e imunohistoquímica.</li>
</ol>

<ol><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).</li>
<li>Ignatova, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cortical+glial+tumors+contain+neural+stem-like+cells+expressing+astroglial+and+neuronal+markers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro.</a> Glia. 39, 193-206 (2002).</li>
<li>Galli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444, 756-760 (2006).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li>
<li>Beier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%28%2B%29+and+CD133%28-%29+glioblastoma-derived+cancer+stem+cells+show+differential+growth+characteristics+and+molecular+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles.</a> Cancer Res. 67, 4010-4015 (2007).</li>
<li>Joo, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+biological+implications+of+CD133-positive+and+CD133-negative+cells+in+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Clinical and biological implications of CD133-positive and CD133-negative cells in glioblastomas.</a> Lab. Invest. 88, 808-815 (2008).</li>
<li>Son, M. J., Woolard, K., Nam, D. H., Lee, J., Fine, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSEA-1+is+an+enrichment+marker+for+tumor-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+cell%22%5BJournal%5D)">SSEA-1 is an enrichment marker for tumor-initiating cells in human glioblastoma.</a> Cell Stem cell. 4, 440-452 (2009).</li>
<li>deCarvalho, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliosarcoma+stem+cells+undergo+glial+and+mesenchymal+differentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo.</a> Stem Cells. 28, 181-190 (2010).</li>
<li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+glioblastoma+multiforme+tumor+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Laks, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+Formation+Is+an+Independent+Predictor+of+Clinical+Outcome+in+Malignant+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Neurosphere Formation Is an Independent Predictor of Clinical Outcome in Malignant Glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li>
<li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumour+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Brain tumour stem cells.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 425-436 (2006).</li>
<li>Gunther, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma-derived+stem+cell-enriched+cultures+form+distinct+subgroups+according+to+molecular+and+phenotypic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria.</a> Oncogene. 27 (20), 2897-2909 (2007).</li>
<li>Fael Al-Mayhani, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+derivation+and+propagation+of+glioblastoma+cell+lines+that+conserves+the+molecular+profile+of+their+original+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient method for derivation and propagation of glioblastoma cell lines that conserves the molecular profile of their original tumours.</a> J. Neurosci. Methods. 176, 192-199 (2009).</li>
<li>Pollard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+cell%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li>
<li>Leder, K., Holland, E. C., Michor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+implications+of+plasticity+of+the+cancer+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The therapeutic implications of plasticity of the cancer stem cell phenotype.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Pietras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+tumor+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in tumor heterogeneity.</a> Adv. Cancer Res. 112, 255-281 (2011).</li>
<li>Lomonaco, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+autophagy+by+gamma-radiation+contributes+to+the+radioresistance+of+glioma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells.</a> Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A dissociação adequada das células tumorais enzimáticas é um passo crítico neste protocolo. O tecido deve ser picado bem antes da incubação na solução de dissociação celular a 37 °C em rotação, por um mínimo de 30 min, quando o tecido deve ser triturado mecanicamente e a extensão da dissociação verificada. Dependendo do grau de coesão tecidual, a incubação pode ser estendida por mais 15-30 minutos, conforme necessário para completar a dissociação em células únicas. A incubação na solução de dissociação por mais de 1 hora não é recomendada devido à diminuição da viabilidade celular. Embora a quantidade ideal de tecido inicial seja de 200-500 mgs, este protocolo levou a culturas neuroferas bem sucedidas de apenas 50 mg de tecido tumoral.
O NMGF sem soro é um meio seletivo, e uma porcentagem de células neoplásicas que compõem a maior parte do tumor, bem como as células hospedeiras, não sobreviverão, enquanto outras se ligarão à cultura tecidual tratada após o revestimento. É fundamental que as neurosferas que se formarão ao longo de 1-3 semanas (Figuras 1B-E) sejam transferidas para frascos frescos, para separar-se das células tumorais e detritos diferenciados.
Células GBM enzimáticamente dissociadas e nunca cultivadas (passo 1.10) podem ser criopreservadas como fonte de backup das células para a cultura em mídia alternativa, caso a cultura da neurosfera falhe. Conseguimos com sucesso culturas da neurosfera a partir de tais estoques congelados, bem como células monocamadas crescendo em 2% FBS/NMGF.
Conceitualmente, "célula-tronco do câncer" é um trabalho em andamento e este campo emergente se beneficiará de esclarecimentos adicionais, uma vez que as implicações clínicas são consideráveis, particularmente na geração de heterogeneidade tumoral, plasticidade e resistência à terapia19,20. Além de serem vitais para a geração de modelos animais GBM específicos do paciente, as culturas da neurosfera também são valiosas para estudos in vitro, como alteração na sinalização celular e expressão genética em resposta a fatores de crescimento, hipóxia e agentes farmacológicos11,21. Optamos por utilizar seções transversais de neuroesferas fixas e parafinas, preservando a arquitetura 3D, para estudar a expressão proteica e modificações pós-translacionais por imunohistoquímica11,devido à localização subcelular superior em relação ao método mais comum de rotulagem e imagem de toda a esfera.
Foi demonstrado que nem todas as células dentro das neurosferas derivadas do cérebro adulto são células-tronco22. Da mesma forma, as neuroesferas cultivadas a partir de tumores GBM provavelmente não são clonais, devido à presença de células progenitoras de câncer mais diferenciadas e auto-agregação, conhecida por ocorrer em altas densidades celulares23, o que é considerado uma limitação desse método por alguns. Para favorecer o enriquecimento de células-tronco auto-renovadoraes de longo prazo, em oposição a apenas progenitores que podem crescer transitoriamente como neuroesferas22, as neurosferas primárias são dissociadas para formação da neurosfera secundária, e ainda mais transitadas por um mínimo de 10 passagens, aproximadamente equivalente a 2 meses em cultura contínua, o que é uma indicação de uma população enriquecida em células-tronco22. Em nossa experiência, as culturas da neurosfera GBM que atingem essa marca podem continuar a ser expandidas como neuroesferas indefinidamente. O grau do tumor importa, uma vez que obtivemos culturas bem sucedidas de GBMs e astrócitos anaplásticos, grau IV e III da OMS, respectivamente, mas não de gliomas de menor grau.
O método mais prevalente de cultivar células de glioblastoma, em meio de crescimento tradicional suplementado com 10% de FBS, leva a considerável divergência genômica e fenotípica dos tumores originais 4. Por outro lado, as culturas da neurosfera são uma fonte estável e de longo prazo de células que apresentam fenótipo de células-tronco cancerosas4. O método da neurosfera tornou-se cada vez mais popular para o enriquecimento do CSC em culturas de longo prazo para modelos de xenoenxerto de rato ortotópico, apesar de não ter sido bem sucedido para todas as amostras de astrocitoma de alto grau, o que representa a principal fraqueza deste método. Estudos para entender como as características moleculares dos tumores parentais podem afetar a formação da neurosfera estão em andamento. A exploração de métodos alternativos práticos para a cultura de gliomas de alto grau, seguidas de ampla validação, dadas as vantagens importantes de ter modelos GBM específicos do paciente, à medida que avançamos para uma era de medicina personalizada, alimentada pela acessibilidade de informações "omics" e aumento do número de potenciais terapias-alvo.

Glioblastoma (GBM), um astrocitoma grau IV da OMS, é o tumor cerebral primário mais prevalente e agressivo. Diversos fenótipos de desenvolvimento são adotados por células tumorais GBM, incluindo células que apresentam características de "células-tronco cancerosas", como a expressão de marcadores de células-tronco neurais (NSC), a auto-renovação a longo prazo e o potencial de dar origem a células mais diferenciadas expressando marcadores astrócitos e formando a maior parte do tumor1-3. Embora ainda seja necessário esclarecimento sobre a identidade molecular do CSC e as implicações clínicas, o foco do presente trabalho está na definição operacional de CSC: autoconexão de longo prazo in vitro e a capacidade de diferenciar e reproduzir o tumor original após implantação ortotópica em roedores imunocomprometidos.
As células glioblastoma têm sido cultivadas por décadas em meio tradicional contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e várias altas passagens comercialmente disponíveis linhas celulares GBM cultivadas são tumorigênicas em roedores imunocomprometidos, mas há considerável divergência genômica e molecular do tumor original4, limitando seu uso como modelos clinicamente relevantes. Mais recentemente, foram identificadas células com fenótipo stem/progenitor responsivo ao EGF e bFGF nos GBMs2. Posteriormente, as amostras de tumorES GBM dissociadas foram cultivadas em um meio livre de soro3, originalmente formulado para a seleção e expansão de células-tronco neurais do cérebro adulto mamífero5. Essas condições culturais dificultam o crescimento da maioria das populações de células tumorais não inoplásticas e mais diferenciadas, ao mesmo tempo em que favorecem o crescimento de células-tronco e progenitoras como esferoides multicelulares flutuantes, ou neurosferas3,imitando o comportamento das células-tronco neurais de mamíferos adultos5. Comparação abrangente lado a lado das células GBM primárias cultivadas em ambos os meios da neurosfera suplementadas com fatores de crescimento (NMGF) ou no meio de crescimento tradicional complementadas com 10% de FBS, revelou que as neurosferas GBM eram tumorigênicas, apresentavam potencial de diferenciação multilineagem e preservavam o genótipo do tumor original, em contraste com as culturas de 10% de FBS que não eram tumorigênicas em passagens baixas e divergiram consideravelmente dos tumores originais nas passagens tardias4.
Também foi proposto o isolamento do CSC de tumores GBM dissociados por triagem celular com base na expressão do marcador CSC putativo CD133 também foi proposto6,7, mas outros trabalhos indicaram que o fenótipo CSC não está definitivamente associado à expressão de tais marcadores8-10, diminuindo o entusiasmo inicial para essa estratégia, enquanto novos marcadores ainda estão sendo testados10. A indisponibilidade até o momento de um conjunto validado de marcadores que definem csc, juntamente com o objetivo de amplificação em larga escala dessas células para estudos pré-clínicos, torna o uso de classificação celular impraticável para culturas rotineiras enriquecidas com CSC. Células GBM selecionadas pela capacidade de crescer como neurosferas no NMGF invariavelmente expressam marcadores de células-tronco neurais. Observamos que Sox2 e nestin são onipresentemente expressos em culturas da neurosfera, enquanto a proteína CD133 está presente em um subconjunto das neuroesferas GBM (dados inéditos e referência11).
Vários laboratórios estão buscando culturas neuroferas a partir de tumores glioblastoma usando a mesma abordagem geral de dissociação enzimática e cultivo em meio livre de soro suplementado com fatores de crescimento3,4,11-14, enquanto outros colegas relataram tentativas de cultivar culturas neuroferas de longo prazo a partir de amostras de GBM sem sucesso. O método geral de dissociação enzimática e cultura neurosfera de gliomas de alto grau apresentados aqui é semelhante ao que foi descrito nas publicações acima. Otimizamos o protocolo com base em nossa experiência de dissociar e culminar mais de 100 amostras gbm. A eficiência da obtenção de culturas neuroferas de longo prazo a partir de amostras de GBM frescas aplicando o protocolo aqui apresentado é superior a 40%, semelhante aos poucos relatórios que mostram dados de eficiência3,15, levando à exploração de protocolos alternativos como células de cultivo contínua ou intermitente em meio livre de soro na presença de EGF e bFGF como monocamadas em superfícies revestidas com proteína ECM16,17. As culturas da neurosfera ainda são a abordagem mais validada e cada vez mais popular para preservar os tumores GBM características moleculares e potencial tumorigênico3,4,11-14, portanto nossa abordagem é tentar culturas neuroferas primeiro, enquanto testa concomitantemente métodos alternativos para a cultura de células GBM que não conseguem formar neuroesferas auto-renovadores de longo prazo(Figura 1),para aumentar a representação de tumores GBM que podem ser usados em modelos animais. Aqui apresentamos um protocolo para a cultura de neuroesferas de GBMs. Para as células que não conseguem formar neurosferas, mostramos uma simples modificação no meio de crescimento, como a primeira tentativa de cultivar células tumorigênicas da nonneurosphere formando GBMs, com resultados promissores e ainda passando por ampla validação.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina - EDTA 0,05%</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solução salina balanceada, livre de cálcio e magnésio</td><td>Life Technologies</td><td>14170-120</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solução salina balanceada, com cálcio e magnésio&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase Tipo 4</td><td>Worthington</td><td>5004188</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T7659</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>N2 Suplemento (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino, grau de cultura celular</td><td>Sigma</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Solução de reagentes de gentamicina</td><td>Life Technologies</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico / Antimicótico</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Humano Recombinante FGF-básico</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Humano Recombinante EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Linfólito-Rato</td><td>Cedarlane Laboratories Ltd.</td><td>CL5031</td><td></td></tr><tr><td>Congelamento de Cultura de Células de Recuperação Médio</td><td>Life</td> Technologies <td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Células Estéril, 40 &mu; m</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; s Fosfato-Ferido salino (DPBS), nenhum cálcio e nenhum magnésio</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Mancha azul de tripano, 0,4%</td> <td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Formalina tamponada neutra</td><td>Protocolo</td><td>245-684</td><td></td></tr><tr><td>de tecido</td><td>Histoplex Thermo Scientific</td><td>22-146-426</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Miltenyi BioTec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp; Suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut D-MEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Stem Pro Neural Supplement&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida</td><td>A1058-01</td><td></td></tr></tbody></table>

otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3d

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Os glioblastomas, a forma mais comum e agressiva do astrocitoma, são refratários à terapia, e molecularmente heterogêneos. A capacidade de estabelecer culturas celulares que preservem o perfil genômico dos tumores parentais, para uso em modelos in vitro e in vivo específicos do paciente, tem o potencial de revolucionar o desenvolvimento pré-clínico de novos tratamentos para glioblastoma adaptados às características moleculares de cada tumor.
Começando com novos tumores de astrocitoma de alto grau dissociados em células únicas, usamos o ensaio da neurosfera como um método de enriquecimento para células que apresentam fenótipo de células-tronco cancerosas, incluindo expressão de marcadores de células-tronco neurais, auto-renovação de longo prazo in vitro,e a capacidade de formar tumores de xenoenxerto ortotópico. Este método foi previamente proposto, e agora está em uso por vários investigadores. Com base em nossa experiência de dissociar e culminar 125 espécimes de glioblastoma, chegamos ao protocolo detalhado que apresentamos aqui, adequado para a cultura da neurosfera de rotina de astrocitomas de alto grau e expansão em larga escala de células tumorigênicas para estudos pré-clínicos. Relatamos a eficiência de culturas de longo prazo bem sucedidas usando este protocolo e sugerimos alternativas acessíveis para cultivar células dissociadas de glioblastoma que não crescem como neurosferas. Também descrevemos em detalhes um protocolo para preservar a arquitetura 3D das neuroferas para a imunohistoquímica. Culturas celulares enriquecidas em CSCs, capazes de gerar modelos ortotópicos de xenoenxerto que preservam as assinaturas moleculares e a heterogeneidade dos GBMs, estão se tornando cada vez mais populares para o estudo da biologia dos GBMs e para o melhor desenho de testes pré-clínicos de terapias potenciais.

Aplicamos o protocolo descrito acima para dissociar e cultivar 125 amostras de glioblastoma cirúrgico fresco(Figura 1),88 recém-diagnosticados e 37 tumores recorrentes(Tabela 2),com consentimento aprovado pelo paciente e sob diretrizes institucionais. A eficiência do protocolo para o estabelecimento de culturas neuroferas de longo prazo foi de 41,6%, e semelhante para tumores recém-diagnosticados e tumores recorrentes(Tabela 2). Para algumas amostras de GBM, as neurosferas formam-se nos primeiros dias(Figuras 1B e 1C),enquanto para outras é necessário tempo de cultivo mais longo(Figuras 1D e 1E).
A eficiência da formação da neurosfera não dependia exclusivamente do nível de necrose no tecido, conforme exemplificado pelos resultados de um tumor recém-diagnosticado com alta densidade celular (GBM1) e um tumor recorrente e necrosado (GBM2) processado de acordo com os Protocolos 1 e 2, ambos produzindo culturas neuroferas(Figura 2).
Testar o potencial tumorigênico de cada cultura neurofera em camundongos imunocomprometidos é a validação crucial dessa abordagem para o enriquecimento dos CSCs. Utilizando um protocolo semelhante ao descrito anteriormente18,neuroferas GBM1 e GBM2 foram implantados no cérebro de camundongos imunocomprometidos, sob diretrizes institucionais e de cuidados com animais do IACUC. Os tumores de xenoenxerto apresentam características morfológicas de GBMs, como invasão ao parênquimo cerebral e necrose(Figura 2).
O GBM3 foi dissociado (Figura 1A) e cultivado em meio neurosfera(Figuras 1D e 1E), e em 2% FBS/NMGF (Figuras 1D, 1G e 1H). As células monocamadas cultivadas em 2% FBS/NMGF e células neurosferas cultivadas em NMGF foram dissociadas e o mesmo número de células foram implantadas em camundongos nus, utilizando o mesmo procedimento da Figura 2. Não foram observadas diferenças na sobrevida, dinâmica de crescimento do tumor ou morfologia entre os dois métodos de culturapré-implantação ( Figuras 3A-C). As características de crescimento tumoral não mudam até a última passagem testada, P20 para neurosferas e P10 para 2% FBS/NMGF. Enquanto os marcadores de células-tronco neurais, incluindo o Sox2, são regulados na maioria das células GBM primárias cultivadas em 10% FBS 3,4,11, NMGF suplementado com 2% FBS permite a retenção da expressão Sox2(Figura 3D).
As neuroesferas foram processadas de acordo com o Protocolo 4, e rotuladas com H&E (Figura 4A),anticorpo anti-Sox2, mostrando localização nuclear(Figura 4B),e anticorpo EGFR, localização da membrana celular(Figura 4C). Este protocolo foi aplicado para acessar alterações dependentes de estímulos na expressão de nestin, GFAP e no marcador de proliferação Ki6711.
Mesa 2. Eficiência de derivar culturas de neurofera auto-renovador a longo prazo de GBMs.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Patologia</td>
			<td>n</td>
			<td>Porcentagem de amostras que produzem neuroesferas autoconexantes de longo prazo (n)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastoma - não tratada, primeira cirurgia</td>
			<td>88</td>
			<td>42.0% (37)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastoma - recorrente</td>
			<td>37</td>
			<td>40.5% (15)</td>
		</tr>
<tr>
<td>total</td>
			<td>125</td>
			<td>41.6% (52)</td>
		</tr>
</tbody></table><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1.jpg"> Figura 1. Cultura celular a partir de amostras cirúrgicas de glioblastoma frescos. Tumores frescos são enzimaticamente dissociados em células únicas. A interface celular nucleada do meio de separação de densidade é então banhada em NMGF. Neuroesferas dissociadas são banhadas em NMGF, e tipicamente 1 dia após o revestimento há células mortas, detritos, células únicas anexadas e células divisórias ocasionais em suspensão(A). A formação da neurosfera é mais rápida para alguns casos(B,C)e mais lenta para outros(D,E). Todas as neurosferas são dissociadas e remarcadas por pelo menos 10 passagens, 41,6% GBMs produzem neuroesferas auto-renovados a longo prazo. Células dissociadas GBM viáveis que não crescem como neurosferas (F) podem ser transferidas para condições alternativas de cultura, por exemplo 2% FBS/NMGF(G,H). Barra (A),100 μm, aplica-se a todas as imagens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" target="_blank"> Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2.jpg"> Figura 2. Geração de neurosfera e xenoenxertos ortotópicos de camundongos gbm. Uma amostra de tumor que apresentava alta densidade celular (GBM1) e um tumor com alto teor necrosado (GBM2) foram dissociadas e neuroferas cultivadas por 10 passagens de acordo com os Protocolos 1 e 2. Camundongos imunocompromoizados foram implantados com 3 x 105 células da neurosfera dissociadas e sacrificados quando moribundos. Os cérebros de camundongos foram formados fixos e parafina incorporada para a coloração de H&E e detecção imunohistoquímica de marcadores humanos, mitocôndrias humanas (hMit) ou principal classe histocompatibilidade I subunit HLA-A (MHC-I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" target="_blank"> Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3.jpg"> Figura 3. Crescimento de tumores semelhantes em camundongos implantados intracranianamente com células GBM3 cultivadas como neurosferas em NMGF ou como monocamadas em 2% FBS/NMGF. (A) As curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier para GBM3 cultivadas como neurosferas em NMGF ou monocamadas em 2%FBS/NMGF (ambas as passagens <10) não mostram diferença na sobrevivência (n=10, p=0,7174, teste de log-rank). (B) O crescimento tumoral monitorado por imagem de bioluminescência ao vivo (BLI) não mostra diferença significativa na dinâmica de crescimento do tumor entre os dois grupos. (C) A morfologia tumoral é indistinguível para xenergraftos de 4 GBM3, 2 cultivados em NMGF e 2 cultivados em 2% FBS/NMGF. Mancha MHC-I como descrito para a Figura 2. Escala, 600 μm. (D) Mancha ocidental mostrando a expressão sox2 fabricante de células-tronco retida em culturas 2% FBS/NMGF usadas para iniciar os tumores de xenoenxerto(A-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" target="_blank"> Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4.jpg"> Figura 4. Análise da expressão proteica em seções da neurosfera por imunohistoquímica. As culturas da neurosfera foram fixadas em formalina e parafinas incorporadas como descrito no Procedimento 4, e manchadas com H&E(A),anticorpo anti-Sox2(B)e anticorpo anti-EGFR(C). O substrato DAB foi usado para visualizar(B,C). Bar, 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>

Protocolo para propagação de amostras cirúrgicas de glioma de alto grau dissociadas em meio neuroesfera livre de soro para selecionar para células com fenótipo de células-tronco cancerosas. Para espécimes que não crescem como neurosferas, um protocolo alternativo é sugerido. Uma técnica de incorporação de parafina para manter a arquitetura da neurosfera 3D para imunocytoquímica é descrita.

Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver neuroesferas de rotina, cultivar astrocitomas de alto grau e expandir em larga escala células tumorais para estudos pré-clínicos. Isso é realizado primeiramente dissociando agudamente espécimes tumorais frescos e separando as células individuais das hemácias e detritos. Na segunda etapa, as células tumorais são cultivadas em meio de neuroesferas suplementado com fatores de crescimento até que neuroesferas sejam observadas.Neurosferas podem ser cultivadas para experimentos in vivo e caracterização molecular ou formalmente fixadas e embutidas em parafina para caracterização imunológica. Em última análise, pode-se avaliar a formação ortotópica de tumor com autorrenovação de longo prazo e o perfil molecular das culturas de neurosferas. A principal vantagem em relação aos métodos existentes, como culturas de soro a 10% FBS de longo prazo, é que esta técnica preserva as características moleculares e genéticas do tumor original.Este método viabiliza o estabelecimento de um banco de tumores vivos para a geração de culturas celulares de glioblastoma específicas do paciente e modelos animais para pesquisas clinicamente relevantes. As implicações desse modelo para testes terapêuticos em pacientes com glioma maligno são evidentes. O modelo representa de forma mais fiel o tumor primário e permite testes terapêuticos em um ambiente pré-clínico.Embora este método possa fornecer informações sobre gliomas de alto grau, ele também pode ser aplicado a outros tumores humanos e animais. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois ele exige técnicas estéreis adequadas, cuidado e múltiplas etapas para favorecer a viabilidade celular de longo prazo. Tivemos inicialmente a ideia do método de histologia 3D devido à localização subcelular superior de proteínas marcadas e das seções em relação aos métodos mais comuns de marcação e imagem de neuroesferas inteiras ou dissociação das células.A demonstração visual deste método de histologia é essencial, pois as etapas de fixação, clareamento, processamento e inclusão são difíceis de aprender. É necessário ter cuidado para garantir que todas as neuroesferas sejam adequadamente expostas aos reagentes e processadas de maneira uniforme, obtendo o melhor pellet possível para análise da morfologia e imuno-histoquímica. Comece com 200 a 500 miligramas de amostra tumoral e use uma lâmina de bisturi para picar o tecido.Transfira os fragmentos para um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio e, em seguida, inverta a suspensão várias vezes para misturar a solução tecidual. Deixe os fragmentos tumorais sedimentarem por gravidade e remova o meio. Continue lavando os detritos dos fragmentos tumorais até que o meio não esteja mais turvo.Em seguida, remova o meio. Adicione dois mililitros de solução enzimática de dissociação tecidual por 0,5 gramas de amostra tumoral mista e misture suavemente a solução por inversão. Incube a solução tecidual a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos sob rotação.Após 30 minutos, pipete a suspensão com uma pipeta de dois mililitros. Quando o tumor estiver digerido em uma suspensão predominantemente de células isoladas, interrompa as enzimas com dois volumes da solução de parada e misture a suspensão celular com uma pipeta serológica de cinco mililitros. Em seguida, filtre qualquer material não digerido através de um filtro celular de 40 micrômetros e centrifugue as células por cinco minutos a 800 ×g e temperatura ambiente.Em seguida, após três lavagens em 10 mililitros de meio, ressuspenda o pellet celular final em cinco mililitros de meio. Deposite lentamente esta suspensão celular sobre cinco mililitros de Lympho Light M e, então, separe as populações celulares por 20 minutos a 1300 × g e temperatura ambiente. Agora, colete a camada de interface contendo as células nucleadas em um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio.Em seguida, ressuspenda as células em meio para neuroesferas suplementado com fatores de crescimento e plaque-as em densidade inferior a um vezes 10 à quinta células por mililitro. Em frascos de cultura de tecidos T 25 irregulares a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, em um incubador de cultura de tecidos umidificado.Transfira as neuroesferas flutuantes que se formam ao longo de uma a três semanas para um frasco fresco, separando-as das células aderidas e dos detritos. Para analisar as neuroesferas por imuno-histoquímica, primeiro centrifugue as neuroesferas, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Remova o sobrenadante e adicione 10 mililitros de DPBS ao tubo.Em seguida, remova o DPBS, re suspenda o pellet em formalina tamponada neutra a 10% e incube as células por 20 minutos à temperatura ambiente. Após centrifugar novamente os esteroides, re suspenda-os em uma série de incubações com etanol. Após a segunda incubação com etanol a 95%, re suspenda o PHE com etanol absoluto até que as células fiquem brilhantes, brancas e condensadas.Em seguida, faça um pequeno cone com papel de lente. Coloque-o em um funil pequeno dentro de um béquer e umedeça o papel de lente com álcool absoluto. Afrouxe ligeiramente o pellet com etanol fresco a 100% e, em seguida, decante o excesso de álcool.Despeje as esferas através do cone de papel filtro, certificando-se de que elas atinjam a ponta, e enxágue o tubo com etanol absoluto adicional. Despeje qualquer esteroide remanescente através do cone de papel filtro e, em seguida, remova o cone do funil. Dobre então o papel filtro em formato quadrado, garantindo que os esteroides fiquem o mais bem fechados possível, e transfira o pacote de neuroesferas para um cassete.Agora coloque o cassete em um processador automático de tecidos e execute o processamento. Em seguida, remova o cassete e coloque-o na parte aquecida de um sistema de inclusão em parafina. Após confirmar que a superfície está livre de fragmentos, poeira ou outros detritos, aspire toda a parafina das pinças nos poços de aquecimento.Em seguida, aqueça um par limpo de pin&ccedil;as livres de parafina e adicione uma pequena quantidade de parafina a um molde-base aquecido. Agora, remova o envelope da cassete e coloque-o na parte aquecida do sistema de inclus&atilde;o. Abra cuidadosamente o papel at&eacute; que as esferas fiquem vis&iacute;veis.Use a pin&ccedil;a pr&eacute;-aquecida para recolher o m&aacute;ximo poss&iacute;vel do material e, em seguida, transfira os esferoides para a parafina l&iacute;quida no molde-base. Quebre cuidadosamente quaisquer aglomerados e mova o esteroide para longe dos cantos, formando uma camada central uniforme. Transfira o molde-base para a &aacute;rea de resfriamento para fixar o esteroide no lugar.Por fim, adicione a cápsula e preencha-a lentamente com parafina. Após a cápsula ter resfriado completamente, o bloco de parafina contendo a neuroesfera pode ser seccionado para imuno-histoquímica conforme descrito na tabela. A eficiência deste protocolo para o estabelecimento de culturas de neuroesferas de longo prazo a partir de 88 tumores recém-diagnosticados e 37 tumores recorrentes, totalizando 125 amostras, foi de 41,6%, sendo semelhante para tumores recém-diagnosticados e tumores recorrentes.Para algumas das amostras de glioblastoma, neuroesferas se formaram nos primeiros dias, enquanto para outras foi necessário um tempo maior de cultivo. A eficiência da formação de neuroesferas não dependia exclusivamente do grau de necrose no tecido, como exemplificado pelos resultados obtidos a partir de um tumor recém-diagnosticado com alta densidade celular e de um tumor recorrente e necrótico, ambos processados conforme acabamos de demonstrar e que geraram neuroesferas para testar o potencial tumorigênico de cada neuroesfera. O cultivo em camundongos imunocomprometidos é uma validação essencial dessa abordagem para o enriquecimento de células-tronco cancerígenas.Neste experimento, dois cultivos diferentes de neuroesferas de glioblastoma foram implantados nos cérebros de camundongos imunocomprometidos. Os tumores xenotransplantados apresentaram características morfológicas de glioblastomas, como invasão no parênquima cerebral e necrose. Neste experimento, células que não formaram neuroesferas foram cultivadas em meio para neuroesferas suplementado com 2% de FBS, avaliando a formação tumoral dessas células em meio alternativo.Em comparação com glioblastoma, foram avaliadas culturas de neuroesferas xenotransplantadas em camundongos nu. Não foram observadas diferenças na sobrevida, dinâmica de crescimento tumoral ou morfologia entre os dois métodos de cultura pré-implante.Embora marcadores de células-tronco neurais, incluindo SOX2, sejam desregulados negativamente na maioria das células de glioblastoma primárias cultivadas em meio contendo 10% de soro bovino fetal (FBS), as células de glioblastoma cultivadas em meio para neuroesferas suplementado com 2% de FBS mantêm a expressão de SOX2 após o processamento conforme acabou de ser demonstrado. Neste experimento, as neuroesferas foram marcadas com o anticorpo h e e antiox2 para demonstrar a localização nuclear e com o anticorpo contra fator de crescimento epidérmico para ilustrar a localização na membrana celular. Como as imagens resultantes ilustram, o método demonstrado otimiza a análise da expressão proteica e das modificações pós-traducionais, mantendo ao mesmo tempo a arquitetura tridimensional das neuroesferas. Uma vez dominada, essa técnica de dissociação tecidual pode ser realizada em aproximadamente duas horas, se executada corretamente. Ao tentar o procedimento, é importante lembrar que o intervalo de tempo entre a cirurgia e a dissociação, bem como a composição molecular heterogênea dos gliomas de alto grau, pode afetar o resultado após este procedimento.Outros métodos, como a implantação intracraniana, podem ser realizados para recapitular o tumor original em modelos animais. Essa técnica está revolucionando a neuro-oncologia, permitindo testes pré-clínicos em um ambiente clinicamente relevante. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como desenvolver e manter neuroesferas de longo prazo, bem como de como produzir neuroesferas fixadas em parafina para análise molecular.Não se esqueça de que trabalhar com tecido humano pode ser extremamente perigoso, e precauções como proteção pessoal e o uso de agentes compatíveis e potencialmente perigosos devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Gliomas malignos constituem um grupo heterogêneo de neoplasias gliais altamente infiltrativas com características clínicas e moleculares distintas. Xenograftos ortotópicos primários recapitulam as características histopatológicas e moleculares de subtipos de glioma malignos em modelos animais pré-clínicos.

Glioma Xenoenxertos Ortotópicos Primários Recapitulam crescimento infiltrativo e isocitar mutação desidrogenase I

Nós estabelecemos um modelo de glioblastoma ortotópico cortical em camundongos para microscopia de dois fótons intravital que recapitula as restrições biofísicas normalmente no jogo durante o crescimento do tumor. Uma janela de vidro crônica substituir o crânio acima do tumor permite o acompanhamento da progressão do tumor ao longo do tempo por meio de microscopia de dois fótons.

Um Glioblastoma Rato modelo ortotópico Manter restrições Cérebro parênquima físicas e Adequado para intravital dois fótons Microscopia

Xenoenxertos derivados de pacientes de glioblastoma multiforme podem ser miniaturizados em microtumores vivos usando o sistema de cultura de biogel humano 3D. Este ensaio tumoral 3D semelhante ao in vivo é adequado para testes de resposta a medicamentos e perfis moleculares, incluindo análise cinômica.

Geração de Microtumors Usando 3D Biogel Humano Sistema de Cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para Kinomic Profiling e Testes resposta à droga

Neurospheres crescidos como 3D culturas constituem uma poderosa ferramenta para estudar a biologia de glioma. Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar a imuno-histoquímica, mantendo a estrutura 3D de glioma neurospheres através da incorporação de parafina. Esse método permite a caracterização das propriedades de glioma neurosphere como stemness e diferenciação neural.

Avaliação de biomarcadores em Glioma por imuno-histoquímica na parafina Glioma 3D Neurosphere culturas

A microdissecção a laser (LMD) é uma técnica sensível e altamente reprodutível que pode ser usada para descobrir caminhos que mediam a heterogeneidade e invasão do glioma. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar áreas discretas do tecido glioma usando LMD a laser seguido de análise transcritiva.

Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão

Aqui, descrevemos um ensaio de invasão fácil de usar para glioblastoma. Este ensaio é adequado para células-tronco de glioblastoma. Uma macro Fiji para fácil quantificação de invasão, migração e proliferação também é descrita.

Um modelo esferóide 3D para glioblastoma

Apresentamos uma nova abordagem para microscopia de dois fótons da liberação tumoral de nanopartículas de óxido de ferro marcadas fluorescente para glioblastoma em um modelo de camundongo.

Microscopia Intravital de Dois Fótons de Glioblastoma em Modelo Murino

IDH1-mutante gliomas difusos de baixo grau são tumores raros e difíceis de cultivar. Apresentamos um método simples de explante não enzimático que preserva a expressão da proteína mutante IDH1 e sustenta as culturas por meses. É importante ressaltar que essa técnica funciona com tumores criopreservados, oferecendo um recurso valioso para a pesquisa de gliomas.

Um protocolo para culturas de explante de gliomas difusos de baixo grau com mutação IDH1

O objetivo desse protocolo é fornecer aos pesquisadores uma técnica altamente reprodutível para implantações intracranianas.

Implantação intracraniana estereotáxica de linhagens celulares de xenoenxerto derivadas de Glioblastoma em Pacientes

Uma técnica cirúrgica para implante de transmissores de telemetria disponíveis comercialmente utilizado para a medição contínua de biopotencial (um ECG), freqüência cardíaca, temperatura corporal e atividade locomotora em ratos movimentando-se livremente é mostrado. Recomendações e protocolos para cuidados pós-operatórios e alívio da dor, melhorar a recuperação, bem estar e taxa de sobrevivência também são apresentados.

Implantação de Transmissores de radiotelemetria Cedendo Dados sobre ECG, freqüência cardíaca, temperatura corporal e atividade em camundongos de laboratório de movimento livre

Aprenda a cultivar neuroesferas de glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para estudos pré-clínicos. Este método preserva as características moleculares do tumor original e permite testes terapêuticos em modelos animais relevantes.

Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D (Vídeo) | JoVE Journal

Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D

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