Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver neurosferas de rotina, cultura de astrocitomas de alto grau e expansão em larga escala de células tumorogênicas para estudos pré-clínicos. Isso é feito primeiro dissociando agudamente as amostras de tumores frescos e separando as células individuais dos glóbulos vermelhos e detritos. Na segunda etapa, as células tumorais são cultivadas em neuroesferas, meio suplementado com fatores de crescimento até que as neuroesferas sejam observadas.

As neuroesferas podem ser cultivadas para experimentos in vivo e caracterização molecular ou formais e fixadas e incorporadas em parafina para caracterização imunológica. Em última análise, a formação de tumor ortotópico de auto-renovação a longo prazo e o perfil molecular das culturas da esfera neurológica podem ser avaliados. A principal vantagem sobre os métodos existentes, como as culturas de soro de longo prazo a 10% FBS, é que essa técnica preserva as características moleculares e genéticas do tumor original.

Este método possibilita o estabelecimento de um banco de tumores vivos para a geração de culturas de células de glioblastoma específicas do paciente e modelos animais para pesquisas clinicamente relevantes. As implicações desse modelo para testes terapêuticos em pacientes com glioma maligno são óbvias. O modelo representa mais de perto o tumor primário e permite testes terapêuticos em um ambiente pré-clínico.

Embora esse método possa fornecer informações sobre gliomas de alto grau, ele também pode ser aplicado a outros tumores humanos e animais. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois requer técnicas e cuidados estéreis adequados e várias etapas para favorecer a viabilidade celular a longo prazo. Tivemos a ideia do método de histologia 3D pela primeira vez por causa da localização subcelular superior das proteínas marcadas e das seções em relação aos métodos mais comuns de marcação e imagem de todas as neuroesferas ou dissociação das células.

A demonstração visual deste método histológico é crítica, pois as etapas de fixação, limpeza, processamento e incorporação são difíceis de aprender. É necessário cuidado para garantir que todas as neuroesferas sejam adequadamente expostas aos reagentes e processadas uniformemente, fornecendo o melhor pellet disponível para morfologia e imuno-histoquímica. Começando com 200 a 500 miligramas de amostra de tumor, use uma lâmina de bisturi para picar o tecido.

Transfira as peças para um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio e, em seguida, inverta a suspensão várias vezes para misturar a solução de tecido. Deixe os pedaços do tumor sedimentarem por gravidade e depois remova o meio. Continue a lavar os detritos dos pedaços do tumor até que o meio não seja mais turido.

Em seguida, remova o meio. Adicione dois mililitros de solução enzimática de dissociação tecidual por 0,5 gramas de amostra de tumor misto e misture suavemente a solução por inversão. Incubar a solução de tecido a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos sob rotação.

Após 30 minutos, triture a suspensão com uma pipeta de dois mililitros. Quando o tumor for digerido em uma suspensão de célula única, pare as enzimas com dois volumes de solução de parada e misture a suspensão celular com uma pipeta sorológica de cinco mililitros. Agora filtre qualquer material não digerido através de um filtro de células de 40 micrômetros e peletize as células por cinco minutos a 800 vezes G e temperatura ambiente.

Em seguida, após três lavagens em 10 mililitros de meio, resus, suspenda o pellet celular final em cinco mililitros de meio. Lentamente, coloque essa suspensão celular em camadas sobre cinco mililitros de linfoluz M e, em seguida, separe as populações de células por 20 minutos a 1300 vezes G e temperatura ambiente. Agora colete a camada de interface contendo as células nucleadas em um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de mídia.

Em seguida, ressuspenda as células em meio neurosfera suplementado com fatores de crescimento e coloque-as em menos de uma vez 10 elevado a quinta células por mililitro. Em frasco de cultura de tecidos T 25 irregular a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em uma incubadora de cultura de tecidos umidificados.

Transfira as neuroesferas flutuantes que se formam ao longo de uma a três semanas para um frasco fresco para separá-las das células e detritos anexados. Para analisar as neuroesferas por imuno-histoquímica, primeiro propulsão as neuroesferas e, em seguida, tomando cuidado para não perturbar a pastilha. Remova o sobrenadante e adicione 10 mililitros de DPBS ao tubo.

Em seguida, remova o DPBS, suspenda novamente o pellet em forma tamponada a 10% neutra e incube as células por 20 minutos à temperatura ambiente. Depois de peletizar os esteróides novamente, suspenda-os novamente em uma série de incubações de etanol. Após a segunda incubação de etanol a 95%, ressuspenda o PHE com etanol absoluto até que as células estejam brilhantes, brancas e condensadas.

Em seguida, faça um pequeno cone de papel para lentes. Coloque-o em um pequeno funil dentro de um copo e molhe o papel da lente com álcool absoluto. Afrouxe ligeiramente o pellet com 100% de etanol fresco e, em seguida, despeje o excesso de álcool.

Despeje as esferas através do cone de papel da lente, certificando-se de que elas vão até a ponta e enxágue o tubo com etanol absoluto adicional. Despeje qualquer esteróide restante através do cone de papel da lente e, em seguida, remova o cone do funil. Em seguida, dobre o papel da lente em um quadrado, certificando-se de que os esteróides estejam o mais bem fechados possível, e transfira as neuroesferas do pacote para um.

Agora coloque o em um processador automático de lenços de papel e execute o processador. Em seguida, remova o e coloque-o na parte aquecida de um sistema de embutir parafina. Depois de confirmar que a superfície está livre de fragmentos, poeira ou outros detritos, sifão toda a parafina da pinça nos poços de aquecimento.

Em seguida, aqueça um par limpo de pinças sem parafina e adicione uma pequena quantidade de parafina a um molde de base aquecido. Agora remova o pacote do e coloque-o na parte aquecida do sistema de incorporação. Abra cuidadosamente o papel até que o espeto fique visível.

Use a pinça de pré-aquecimento para coletar o máximo possível do material e, em seguida, transfira os esferóides para a parafina líquida no molde de base. Quebre cuidadosamente todos os aglomerados e mova o esteróide para longe dos cantos em uma camada central uniforme. Mova o molde de base para a área de resfriamento para prender o esteróide no lugar.

Por fim, adicione o e encha-o lentamente com parafina. Uma vez que o tenha esfriado completamente, o bloco de parafina da esfera neurológica pode ser seccionado para imuno-histoquímica, conforme descrito na tabela. A eficiência deste protocolo para estabelecer culturas de neuroesferas de longo prazo de 88 tumores recém-diagnosticados e 37 recorrentes foi de 41,6% Semelhante tanto para tumores recém-diagnosticados quanto para tumores recorrentes.

Para algumas das amostras de glioblastoma, as neuroesferas se formaram nos primeiros dias, enquanto para outras foi necessário um tempo de cultura mais longo. A eficiência da formação da neuroesfera não dependia exclusivamente do nível de necrose no tecido, como exemplificado pelos resultados de um tumor recém-diagnosticado com alta densidade celular e um tumor recorrente e necrótico, ambos processados como acabamos de demonstrar e produzindo neuroesferas testando o potencial tumorogênico de cada neuroesfera. A cultura em camundongos imunocomprometidos é uma validação crucial dessa abordagem para o enriquecimento de células-tronco cancerígenas.

Neste experimento, duas culturas diferentes de neuroesferas de glioblastoma foram implantadas no cérebro de camundongos imunocomprometidos. Os tumores de xenoenxerto apresentaram características morfológicas de glioblastomas, como invasão cerebral, parênquima e necrose. Neste experimento, células que não formaram neuroesferas foram cultivadas em meio neurosfera suplementado com 2% de FBS, a formação tumoral dessas células de meios alternativos.

Em comparação com o glioblastoma, foram avaliadas culturas de neuroesferas de xenoenxerto em receptores de camundongos nus. Sem diferenças na sobrevivência. A dinâmica ou morfologia do crescimento tumoral foi observada entre os dois métodos de cultura pré-plantio.

Enquanto os marcadores de células-tronco neurais, incluindo SOX dois, são regulados negativamente na maioria das células de glioblastoma primário cultivadas em células de glioblastoma 10% FBS cultivadas em meio neuroesferas, suplementadas com 2% FBS retêm a expressão de SOX dois após o processamento, conforme demonstrado. E neste experimento, as neuroesferas foram marcadas com anticorpos h e e antiox dois para demonstrar a localização nuclear e anticorpo do fator de crescimento epidérmico para ilustrar a localização da membrana celular. Como as imagens resultantes ilustram, o método demonstrado otimiza a análise da expressão proteica e modificações pós-traducionais, mantendo a arquitetura 3D das neuroesferas Uma vez dominada, esta técnica de dissociação tecidual pode ser feita em aproximadamente duas horas se realizada corretamente Ao tentar o procedimento, é importante lembrar que o intervalo de tempo entre a cirurgia e a associação, bem como a composição molecular heterogênea de gliomas de alto grau podem afetar o resultado Após este procedimento.

Outros métodos, como o implante intracraniano, podem ser realizados para recapitular o tumor original em modelos animais. Essa técnica está revolucionando a neuro-oncologia, permitindo testes pré-clínicos em um ambiente clinicamente relevante. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver e manter neuroesferas de longo prazo, bem como produzir neuroesferas formais e fixas embebidas em parafina para análise molecular.

Não se esqueça de que trabalhar com tecido humano pode ser extremamente perigoso, e precauções como proteção individual, agentes compatíveis e potencialmente perigosos devem sempre ser usados durante a realização deste procedimento.