Name: In Vivo Imagem Óptico de tumores cerebrais e artrite Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a usar o sistema MAROI para imagem óptica in vivo de tumores cerebrais e artrite em camundongos com nanovesículas fluorescentes SAPC-DOPS. Este método determina o ângulo ideal para análise de fluorescência.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH / NCI Grants Número 1R01CA158372-01 (para Qi) e New Drug Estado Chave Projeto Grant Número 009ZX09102-205 (para Qi). Escrevendo assistência foi prestada pelo Dr. Judy Racadio, e foi financiado pela Universidade de Cincinnati Departamento de Hematologia e Oncologia. Vontz Núcleo de Imagem Lab (VCIL) na Faculdade de Medicina da Universidade de Cincinnati.

Declaração de ética do uso de animais. Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use, da Universidade de Cincinnati (Número IACUC Protocolo: 11-05-05-02) e Fundação do Cincinnati Children Research Hospital (Bem-Estar Animal Número Assurance A3108-01). Todos os experimentos envolvendo ratos seguiu as orientações de cuidados de animais da Universidade de Cincinnati e Fundação de Pesquisa do Hospital Infantil de Cincinnati. 1. Prepare Modelos Animais Nota: Três diferentes modelos animais descritos abaixo foram usados ​​nos nossos estudos anteriores: <ol><li> Ortotópico de tumor no cérebro do rato: Use ratinhos nu / nu atimicos fêmea que foram injectados por via intracraniana com células U87-ΔEGFR-Luc humanos. Estes ratos desenvolver um tumor agressivo, mostrando características típicas de glioblastoma humano. </li><li> Modelos de cérebro de rato tumor geneticamente modificados 13: Raça Mut3 (GFAP-Cre; Nf1loxP / +; Trp53-/ +) camundongos machos com Trp53loxP/loxP; Fêmeas PtenloxP / loxP para gerar camundongos Mut6 (GFAP-Cre; Nf1loxP / +; Trp53-/loxP; PtenloxP / +). Manter camundongos Mut3 em B6CBAF1 / J tensão por meio de cruzamento camundongos machos Mut3 com camundongos B6CBAF1 fêmea / J. Genótipo os ratos entre P9 e P12 e confirmar os genótipos após a colheita seus tecidos. </li><li> Artrite K / BxN: ratos Use C57Bl/6J que foram administrados por via intraperitoneal com 150 mL soros de camundongos F1 KRN x NOD. Estes ratinhos desenvolvem artrite de 24 a 48 horas após a injecção de soro. Imagiologia de ratinhos artríticos é realizada no dia 7 após a administração de soro, um ponto de tempo em que os ratos apresentam artrite macroscópica evidente. Ratos devem ser avaliados com base nos critérios definidos na próxima etapa. <ol><li> Avaliação de ratinhos para a artrite macroscópica utilizando um sistema de pontuação do índice de artrite macroscópica como se segue: 0 = nenhuma artrite detectável, 1 = inchaço e / ou vermelhidão da pata ou de um dígito, 2 = duas articulações envolvidas, 3 = três articulações envolvived, e 4 = artrite grave de toda a pata e dígito. O sistema de pontuação artrítica é usado para determinar o número de articulações afectadas e a gravidade da artrite nas patas do rato. Até mesmo os ratos com a maior pontuação possível artrite raramente mostram sinais de imobilidade. No entanto, a artrite é 3x/semana monitorado e camundongos com dor excessiva (como imobilidade severa de patas inchadas que inibe consumo de alimentos e água) são sacrificados. </li><li> Nota: Os fluidos injectados IV na veia da cauda do rato foram mantidas a esterilidade durante todo o experimento. ,, Seringas descartáveis ​​estéreis limpas e frascos são utilizados para a preparação e administração da solução de estudo. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de fluorescência marcado SAPC-DOPS nanovesículas <ol><li> SAPC produção de proteína: proteína recombinante SAPC com sequência exata SAPC humano foi produzido em E. células de E. coli, como descrito anteriormente com modificações 4.SAPC foi precipitado com etanol, seguido por purificação cromatografia líquida de alto desempenho. Após liofilização, SAPC seco foi usado e a sua concentração foi determinada pelo seu peso. </li><li> Misturar a proteína SAPC como anteriormente descrito 7,10,11. Mistura DOPS (0,18 mg) e CVM (0,03 mg) em um tubo de vidro e usar gás de azoto para evaporar solventes lipídicos. </li><li> Adicionar SAPC proteína em pó (0,32 mg) à mistura, a suspensão da mistura seca, em 1 ml de tampão PBS e banho de sonicação durante cerca de 15 minutos, como anteriormente descrito 7,10,11. Em seguida, passar a suspensão através de uma coluna de Sephadex G25 (PD-10) para remover o corante CVM livre. Excitação e máximos de emissões do produto final, ou seja, nanovesículas SAPC-DOPS-CVM, são 653 nm e 677 nm, respectivamente. </li></ol> 3. Imagem <ol><li> Use tumor cerebral e modelos de artrite de ratinho (descrito acima no Passo 1) para testar o sistema de Maroi. Anestesiar ratos para efectuar com 2% de isoflurano. 1-2% de isoflurano é maintainada por a duração do procedimento de imagiologia. O ar quente é continuamente e suavemente entregue para a câmara de imagiologia para a duração das imagens. Uma pequena gota de lágrimas artificiais estéril pomada é aplicada a cada olho do rato, de modo a cobrir e lubrificar o olho. Coloque ratinhos no sistema MARS posicionando os ratos numa posição supina com a sua coluna, inicialmente dirigido para a câmara (Figura 1). Calibre o filme apoio ° MARS 380 e posicione o mouse usando o software de rotação no separador protocolo Bruker MI. Obtenção de imagens da linha de base de ratinhos antes da administração SAPC-DOPS-CVM da maneira descrita abaixo. </li><li> Injetar 200 mL de SAPC-DOPS-CVM por via intravenosa na veia da cauda do rato. Administrar com ratinhos de controlo e ratos portadores de tumores cerebrais ou artríticas. </li><li> Camundongos Imagem 24 hr pós injeção e novamente em 7-9 dias após a injeção, tomando de fluorescência (25 seg tempo de exposição) e de raios-X (10 seg tempo de exposição) imagos em 10 ° incrementos ao longo de um curso de 380 °, criando uma ligeira sobreposição para garantir que não haja lacunas no conjunto de dados de rotação. Usando o software Bruker MI, sobrepor fluorescente para imagens de raios-X para a localização anatômica. </li></ol> 4. Image Analysis <ol><li> Desenhar um ROI rectangular abrangendo a largura do campo de visão (FOV) do local da doença (tumor e artrite). O ROI deve ser grande o suficiente para manter a função da doença dentro do FOV que o animal se move ao longo da rotação de 380 °. Para os ratos com tumor cerebral (modelos ortotópicos e transgênicas), use o mesmo ROI retangular em cada modelo de tumor e suas três (3) camundongos respectivo controle para todos os momentos (basal, 24 hr, e 9 dias). O posicionamento do ROI retangular para cada rato é preservada sobre todos os pontos temporais, utilizando marcos anatômicos em correspondentes imagens de raios-X de cada animal. O marco (s) anatômica identificada no modelo de tumor também deve ser usado para place ROIs retangulares idênticas em seus respectivos controles de cada modelo. Marcos anatômicos identificados nas imagens de raios-X que permitem a colocação de ROI consistente incluem a base do crânio e da face posterior do arco zigomático. Eles são visualizados na direita e à esquerda lateral do crânio na imagem póstero-anterior (PA). </li><li> Depois de fundo automática subtração, determinar a intensidade de fluorescência média para cada imagem. Converta as imagens de fluorescência para fótons / s / mm 2, utilizando software de imagem Bruker MI. Plotar os valores de fluorescência em função dos ângulos de imagem, e aplicar como erro impede o desvio-padrão dos valores médios de fluorescência obtidas de camundongos de controle usando Excel ou outro software gráfico. </li></ol>

<ol><li>Pizzonia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+animal+rotation+imaging+system+%28Mars%29+for+in+vivo+detection+of+intraperitoneal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multimodality animal rotation imaging system (Mars) for in vivo detection of intraperitoneal tumors.</a> Am J Reprod Immunol. 67, 84-90 (2012).</li>
<li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+depth+of+cellular+imaging+in+the+intact+lung+using+far-red+and+near-infrared+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biomed+Imaging%22%5BJournal%5D)">Increased depth of cellular imaging in the intact lung using far-red and near-infrared fluorescent probes.</a> Int J Biomed Imaging. , (2006).</li>
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<li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+can+recognize+SapC-DOPS+to+stimulate+macrophages+to+express+several+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 can recognize SapC-DOPS to stimulate macrophages to express several cytokines.</a> Inflamm Res. 60, 153-161 (2011).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saposin+C+coupled+lipid+nanovesicles+specifically+target+arthritic+mouse+joints+for+optical+imaging+of+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Saposin C coupled lipid nanovesicles specifically target arthritic mouse joints for optical imaging of disease severity.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
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<li>Wojton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+delivery+of+SapC-DOPS+has+antiangiogenic+and+antitumor+effects+against+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Systemic delivery of SapC-DOPS has antiangiogenic and antitumor effects against glioblastoma.</a> Mol Ther. 21, 1517-1525 (2013).</li>
<li>Kwon, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+haploinsufficiency+accelerates+formation+of+high-grade+astrocytomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Pten haploinsufficiency accelerates formation of high-grade astrocytomas.</a> Cancer Res. 68, 3286-3294 (2008).</li>
</ol>

Não há nada a divulgar.

A determinação exata da localização e magnitude de tumores sólidos e focos inflamatórios em doenças reumáticas é fundamental para implementar o tratamento adequado e acompanhamento da progressão da doença ou remissão. Enquanto valiosas, as estratégias atuais de imagem (raios-X; ressonância magnética, ultrassom; tomografia computadorizada de raios-X) fornecer avaliações incompletas do estado da doença. Por exemplo, lesões articulares artrite é comumente avaliada por raios-X, que fornece informações sobre a estrutura óssea, mas não sobre a inflamação dos tecidos moles e destruição, característica dos estágios iniciais da doença. O método aqui apresentado Maroi combina as vantagens de ambos os raios-X e exames de imagem de tecidos moles sofisticadas (por exemplo, ressonância magnética ou ultra-som) em uma plataforma integrada, não-invasivo e mais simples que também permite um mapeamento completo 3D e reconstrução do tecido doente ou órgão pequenos animais, como ratos. Este método tira vantagem da afinidade selectiva of SAPC-DOPS nanovesículas de resíduos fosfatidilserina expostas, que são abundantes nas membranas de câncer e células inflamatórias. O determinante desta ligação é SAPC, uma proteína lisossómica fusogénico com uma forte afinidade para fosfolípidos aniónicos tais como fosfatidilserina 7,10,11. Quando conjugado com uma sonda fluorescente (CVM), sistemicamente injetado SAPC-DOPS pode ser atribuída a tumor e locais artríticas por imagem de fluorescência. As limitações deste método estão relacionadas com a sua sensibilidade, que atualmente restringe o seu uso a imagem de pequenos animais, como ratos. Como com outros métodos de imagem, o sinal fluorescente óptima para relação de ruído está restringida pelo tamanho do tumor ou a extensão da artrite, e pode ser comprometida quando imagiologia de tecidos ou órgãos com elevado efeito de fundo (autofluorescência), tais como as orelhas (imagiologia cerebral), intestinos / fezes (imagiologia abdominal) e patas (imagem dos membros posteriores). A este respeito, verificou-se que um corante vermelho distante como CVM próvides melhor separação resolução espectral e no vivo configuração em que as outras sondas fluorescentes na faixa visível. Outras armadilhas incluem o potencial de movimentação do animal durante o exame, tanto enquanto anestesiado e post mortem (rigor mortis). Posicionamento dos membros posteriores, particularmente, é muitas vezes difícil de estabilizar para evitar o movimento durante a rotação. Em seu estado atual, a técnica também é demorado, com tempos de varredura, enquanto 60 min necessário para completar uma rotação completa e adquirir imagens de alta qualidade. O método Maroi apresenta um número de vantagens sobre os outros métodos de imagem. A capacidade de um tecido doente de imagem a partir de 38 (ou mais) diferentes ângulos permite a visualização de fluorescência que pode ser impedida quando se avalia que a partir de um único plano; esta é útil em estudos com animais, porque pode ajudar a minimizar o número de falsos negativos que resultam de imagiologia em ângulos apropriados. Por Sobrecargade raios-X ying e imagens de fluorescência, uma localização anatómica precisa do local doente pode ser determinada. Finalmente, a possibilidade de ao vivo (in vivo) de imagem permite estudos longitudinais para ser executada.

Imagem animal inteiro tornou-se uma ferramenta poderosa no estudo da fisiopatologia animal. Entre os sistemas de imagem atuais, o MS FX PRO permite aos pesquisadores com precisão visualize fluorescente etiquetado (ou luminescente) compostos e / ou tecidos em ratos vivos, e, simultaneamente, obter imagens de raios-X. Com o sistema de rotação de animais recentemente introduzido várias modal (MARS) uma rotação completa e automatizada do mouse é alcançado, a fim de capturar tanto fluorescente / luminescentes e imagens de raios-X em ângulos específicos 1. A aquisição de imagens pode ser programado de tal forma que série de imagens sequenciais podem ser capturados em, ângulos incrementais específicos tão pequenas como 1 °. Isto permite que se identificar a orientação óptima do animal, isto é. aquele em que a distância entre o sinal fluorescente / luminescente gerado internamente e dispositivo de detecção do sistema é o mais curto. Este, por sua vez, facilita o reposicionamento preciso do animal para imagiologia subsequente sissions durante estudos longitudinais. Neste relatório, nós descrevemos a implementação de um sistema multi-ângulo de rotação de imagem óptica (Maroi) para in vivo a quantificação da intensidade marcador fluorescente. A análise da curva de sinal Maroi pode ser utilizado em estudos longitudinais para correlação directa de distribuição de sinal de fluorescência para mapear precisamente sítios doentes ou processos biológicos de interesse. Este sistema foi utilizado para monitorizar a absorção de marcação fluorescente nanovesículas SAPC-DOPS por tumores ortotópicos e espontâneos, bem como por focos de artrite, em ratos vivos; forneceu conjuntos de dados multi-espectrais e multimodais derivados de cobertura de rotação completa dos animais. Entre as numerosas sondas fluorescentes atualmente disponíveis para imagem in vivo, aqueles que emitem nas regiões do infravermelho próximo e vermelho-extremo do espectro conferir o menor interferência com a pele e os tecidos, e fornecer os mais altos res de penetração e de imagemlução. Usamos CellVue Maroon (CVM) 2,3, um vinculador célula fluorescente vermelha distante (Ex 647/Em 667), para rotular SAPC-DOPS (SAPC-DOPS-CVM) 4-12.

<table><tbody><tr><td>Águia Modificada Dulbecco's Medium Gibco</td><td>(Grand Island, NY)</td><td>11965</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>16000077</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Hyclone (Logan, Utah)</td><td>SV30010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dioleoylphosphatidylserine</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)</td><td>840035C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CellVue Maroon</td><td>Molecular Targeting Technologies, Inc. (Exton, PA)</td><td>C-1001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sephadex G25 coluna PD-10</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, (Piscataway, NJ)</td><td>17-0851-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Novo Padrão Estereotáxico para Ratos e Camundongos</td><td>Harvard Apparatus (Holliston, MA)</td><td>726335</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bransonic Ultrasonic Cleaners Modelo 1510</td><td>Branson Ultrasonics (Danbury, CT)</td><td>CPN-952-118</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema FX multiespectral</td><td>Bruker Corporation (Billerica, MA)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dispositivo de Imagem Óptica Rotacional Multi-ângulo</td><td>Bruker Corporation (Billerica, MA)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vivo imagem Óptico de tumores cerebrais e artrite usando fluorescente sapc-dops nanovesículas

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

Descreve-se um sistema (Maroi) para o monitoramento in vivo de processos fisiopatológicos marcadas com um marcador fluorescente multi-ângulo de rotação de imagem óptica. Modelos do rato (tumores e artrite cérebro) foram utilizados para avaliar a utilidade deste método. Saposina C (SAPC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesículas marcados com CellVue Maroon (CVM) fluorophore foram administrados por via intravenosa. Os animais foram, em seguida, colocado no suporte de rotação (MARS) do sistema de imagem in vivo. As imagens foram adquiridas em 10 ° etapas mais de 380 °. A região rectangular de interesse (ROI), foi colocada a toda a largura da imagem completa no local da doença modelo. Dentro do ROI, e para cada imagem, a intensidade de fluorescência média foi calculada após subtração de fundo. Nos modelos de ratos estudados, os nanovesículas marcados foram retomadas em ambos os tumores cerebrais ortotópico e transgênicas, e nos sites artríticas (dedos dos pés e tornozelos). Análise da curva de multi ângulo image ROIs determinado ângulo com o sinal mais elevado. Assim, o ângulo ideal para imagiologia de cada local da doença foi caracterizada. O método Maroi aplicada a imagem de compostos fluorescentes é uma ferramenta não invasiva, econômico, e preciso para in vivo análise quantitativa dos estados de doença nos modelos descritos no mouse.

Nós demonstramos aqui que nanovesículas SAPC-DOPS marcadas com um corante vermelho-distante (CVM) acumular especificamente em tumores do cérebro do rato ortotópico e espontâneos, bem como nas articulações artríticas de ratinhos K / bxn. Imagens de fluorescência / raios-X em série adquiridos a partir de uma ROI colocado sobre cada local da doença durante rotações completas dos ratos foram submetidos a análise da curva de Maroi, que revelou o ângulo de imagem ideal, com a maior intensidade de fluorescência. O objectivo principal para o uso do sistema MARS é para determinar o ângulo óptimo de fluorescência de modo a que as medições mais precisas podem ser obtidas. Os resultados representativos de três experimentos com ratos com tumores cerebrais ou artrite são mostrados. Utilizando SAPC-DOPS-CVM e o sistema MARS (Figura 1), a melhor imagem possível ângulo de observação do tumor ou devido a inflamação da artrite foi determinada. As imagens de fluorescência, seguindo-se uma aquisição de raios-X, foi adquirida a cada 10 °durante uma rotação de 380 ° do mouse. Imagens de fluorescência foram sobrepostos nas imagens de raios-X correspondentes para visualização da imagem e geração de filme de rotação. Os resultados do modelo de tumor cerebral ortotópica são demonstradas na Figura 2. A imagem de fluorescência de um rato portador de tumor ortotópico representante (Ortho1) é mostrado na Figura 2A. O ângulo de imagem ideal para este animal é de 10 °, a posição em que a intensidade de fluorescência de fotões é a maior (Figura 2B). As medidas foram feitas antes da injeção com SAPC-DOPS-CVM (baseline) e 24 horas após a injeção. Os ratos de controlo (tumor livre) receberam um tratamento similar. A Figura 3 mostra dados comparáveis ​​a partir do modelo de ratinho de tumor cerebral por engenharia genética. As imagens de fluorescência e as medições de fotões foram tomadas antes da injecção com SAPC-DOPS-CVM (linha de base) e 24 h (Figuras 3A e &lt;forte&gt; 3B) e 9 dias (Figura 3C) após a injecção. Estes gráficos mostram que o ângulo de imagem ideal no animal portador de tumor (Tumor Mut49) é de 20 ° 24 hr pós injeção, mas muda para 10 ° 9 dias pós-injeção. Isto sugere que a alteração de sinal de fluorescência correlacionada com alterações morfológicas, provavelmente refletindo o crescimento do tumor. Como mostrado na Tabela 1, o método Maroi demonstra claramente que o sinal fluorescente diminui por projecções em aumento da rotação fora do ângulo de imagem óptima. Nos tumores do cérebro, uma diminuição média de 7% no sinal de fluorescência foi obtida se a orientação física do animal foi 10 ± compensados ​​a partir do ângulo de imagem óptima °. Uma redução média de 21% no sinal fluorescente foi medida em ± 20 °. Assim, relativamente pequenos deslocamentos do ângulo ideal pode resultar em atenuação do sinal significativo. Utilizando a técnica de Maroi para o posicionamento da imagem permitirá que investigators para produzir dados mais consistentes e confiáveis. O método Maroi foi finalmente usada para avaliar o direccionamento das articulações artríticas de SAPC-DOPS-CVM 24 horas após a injecção de SAPC-DOPS-CVM. Este animal marcou 3 com três articulações artríticas. Imagens de fluorescência do dedo do pé e tornozelo do rato com artrite são apresentados nas Figuras 4A e 4B. Medições de fótons correspondentes a 10 ° intervalos de rotação são representados graficamente nas Figuras 4C e 4D. Os ângulos de imagem ideais encontrados para o dedo do pé e tornozelo são 140 ° e 120 °, respectivamente. Em resumo, a combinação do sistema Maroi com fluorescentes nanovesículas SAPC-DOPS representa uma estratégia não invasiva, precisa e altamente sensível para imagens em tempo real, que permite estudos quantitativos de tumor e progressão da artrite em animais de pequeno porte. A possibilidade de aquisição de um conjunto de dados de 360 ​​° de imagem multimodal improv consideravelmenteanálise e interpretação dos dados es, em comparação com o que é alcançável através de técnicas individuais de imagem de ângulo. <img alt="Tabela 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187table1.jpg" width="600px" /> Tabela 1. Ângulos de imagem ideal para cada modelo do rato. As diferenças entre o ângulo de fluorescência fóton máxima (FLR ângulo ideal) eo ângulo anatômica normal (raio-X) podem ser vistos. Quando estes dois ângulos tornado cada vez mais diferentes, o sinal medido muda significativamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1.jpg" width="600px"/&gt; Figura 1. Multi-ângulo de rotação do dispositivo de imagem óptica (Maroi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2.jpg" width="600px" /> Fluorescência sinal vs ângulo Figura 2. Imagem em um modelo de camundongo ortotópico tumor cerebral. (A). Imagem do sinal de pico de fluorescência, com o ângulo de imagem ideal de 10 °. A caixa azul mostra o ROI para quantificar os fótons emitidos. (B). Gráfico do ângulo de imagem contra emissão de fóton. O rato-bearing tumor ortotópico representante (Ortho1) é representada graficamente contra valores de fluorescência média entre ROIs idêntico em três ratos não tumorais. As medidas foram realizadas no início do estudo (antes da injeção) e pós 24 horas injection. As barras de erro representam o desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3.jpg" width="600px" /> Sinal de fluorescência Figura 3. Vs ângulo de imagem em um tumor cerebral espontânea de um modelo de camundongo geneticamente modificado. (A). Imagem do sinal fluorescente pico de ROI 1 (top box azul) no ângulo de imagem ideal de 20 °. (B) e (C). Gráficos do ângulo de imagem contra emissão de fóton de ROI 1. Valores de um representante do rato portador de tumor cerebral espontânea, Tumor-Mut 49, são representados graficamente em relação aos valores médios de três ratos não tumorais. As medidas foram realizadas no início do estudo (antes da injeção) e 24 horas (B) e 9 dias (C) após a injeção. Erro b<html> ars representam Desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4.jpg" width="600px" /> Fluorescência sinal vs ângulo Figura 4. Imagem em um rato com artrite do dedo do pé e tornozelo. (A) e (B). Imagens que mostram o sinal de pico fluorescente para os dedos dos pés (a) e tornozelo (B), dentro dos ROIs mostrados na caixa vermelha. (C). Gráfico do ângulo versus média emissão de fóton para o dedo do pé. Emissão de fóton Peak pode ser visto em um ângulo de 140 ° (D) Gráfico de ângulo versus média emissão de fóton para o tornozelo..; intensidade máxima ocorre com um ângulo de 120 °.target = &quot;_blank&quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada.

Descreve-se um sistema (Maroi) para in vivo quantificação de um marcador fluorescente entregue por saposina C (SAPC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesículas multi-ângulo de rotação de imagem óptica. Utilizando modelos de ratinho de cancro e artrite, é mostrado como a análise da curva de sinal Maroi pode ser utilizado para o mapeamento preciso e caracterização biológica de processos de doença.

In Vivo Imagem Óptico de tumores cerebrais e artrite Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma imagem in vivo de 360 graus em um camundongo para determinar o ângulo ideal para análise de fluorescência. Isso é realizado primeiramente preparando os modelos animais de tumor cerebral ortotópico, tumor cerebral geneticamente modificado e artrite. Em seguida, a proteína C SAPs é produzida e as nano vesículas SAP D-O-P-S-C-V-M são preparadas.Em seguida, as nano vesículas são injetadas na veia da cauda dos animais. Por fim, são obtidas e analisadas imagens de fluorescência e de raios X. Em última instância, o método M-A-R-O-I é utilizado para mostrar o ângulo ideal para a análise de imagem por fluorescência.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a imagem de fluorescência planar 2D, é que o método M-A-O-M-A-R-O-I permite aos pesquisadores determinar o ângulo ideal para a análise de imagem de fluorescência. As implicações dessa inovação técnica estendem-se para a terapia e o diagnóstico de câncer e artrite, porque o CEP CS Vesical pode direcionar-se ao tecido tumoral e inflamatório. Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Cincinnati e pela Fundação de Pesquisa do Hospital Pediátrico de Cincinnati para realização desses estudos e do modelo de tumor cerebral ortotópico em camundongo.Um camundongo geneticamente modificado com tumor cerebral e um modelo de camundongo de artrite A-K-B-X-N são utilizados. De acordo com o protocolo descrito, utilize um sistema de pontuação macroscópica por índice de artrite para avaliar os camundongos quanto à artrite da seguinte forma: zero equivale à ausência de artrite detectável; um equivale a inchaço e/ou vermelhidão da pata ou de um dígito; dois equivale à participação de duas articulações; três equivale à participação de três articulações; e quatro equivale à artrite grave em toda a pata e dígito. Produza a proteína recombinante humana SAPs C em células de E. coli antes de precipitá-la com etanol e purificá-la por cromatografia líquida de alta eficiência; após liofilização, determine a concentração da SAP C seca por peso. Para preparar a mistura da proteína SAP C, combine 0,18 miligramas de DOPS e 0,03 miligramas de CVM em um tubo de vidro e use gás nitrogênio para evaporar os solventes lipídicos.Em seguida, adicione 0,32 miligramas de pó de proteína marinha SAPs à mistura. Suspenda a mistura seca em um mililitro de tampão PBS e sonique em banho por 15 minutos. Passe a suspensão por uma coluna Cidex G 25 para remover o corante CVM livre.As nanopartículas SAP C-D-O-P-S-C-V-M apresentarão máximos de excitação e emissão de 653 nanômetros e 677 nanômetros, respectivamente. Para testar o método de imagem óptica rotacional multiangular ou M-A-R-O-I utilizando o sistema Mars, após anestesiar um camundongo de um dos modelos de camundongo descritos com 2% de isoflurano, posicione o animal em posição supina no sistema Mars, com a coluna vertebral voltada para a câmera a partir da tela de visualização da aba rotador MI da Brucker, e calibre o suporte de filme de 380 graus do Mars. Para posicionar o camundongo e administrar os SAPs C-D-O-P-S-C-V-M na cauda do animal, injete 200 microlitros por via intravenosa 24 horas depois e, novamente, de sete a nove dias após a injeção, obtenha imagens de fluorescência e de raios X em incrementos de 10 graus ao longo de um percurso de 380 graus, criando uma leve sobreposição para garantir que não haja lacunas no conjunto de dados rotacionais.Utilizando o software de rotação da Bruker, sobreponha imagens fluorescentes sobre imagens de raios X para localização anatômica. Para analisar as imagens, desenhe uma região de interesse retangular, ou ROI, abrangendo a largura do campo de visão, ou FOV, do local da doença em camundongos com tumor cerebral. Utilize a mesma ROI em cada modelo de tumor e nos camundongos controles respectivos em todos os pontos temporais, usando marcos anatômicos para marcar a posição da ROI após subtração automática de fundo.Determine a intensidade média da fluorescência para cada imagem utilizando o software MI da Brucker para converter as imagens de fluorescência em fótons por segundo por milímetro quadrado, plote os valores de fluorescência em função dos ângulos de imagem e aplique como barras de erro. O desvio padrão dos valores médios de fluorescência obtidos de camundongos controle. A imagem de fluorescência de um camundongo representativo portador de tumor ortotópico é mostrada nesta figura.Demonstramos aqui que SAPs, nano vesículas de DOPS marcadas com um corante no infravermelho distante, se acumulam especificamente em tumores cerebrais ortotópicos e espontâneos em camundongos, bem como nas articulações artríticas de camundongos KBXN. O objetivo principal do sistema Mars é determinar o ângulo ótimo de fluorescência para que as medições mais precisas possam ser realizadas, conforme mostrado aqui. O ângulo de imagem ideal para este animal é de 10 graus.A posição na qual a intensidade do fóton fluorescente é máxima foi determinada; medições de linha de base foram realizadas antes da injeção de SAP C-D-O-P-S-C-V-M, e 24 horas após a injeção, camundongos controles livres de tumor receberam um tratamento semelhante. Essas figuras mostram dados comparáveis do modelo de camundongo com tumor cerebral geneticamente modificado. As imagens de fluorescência e as medições de fótons foram realizadas na linha de base, 24 horas e nove dias após a injeção de SAP C-D-O-P-S-C-V-M.Os gráficos mostram que o ângulo ideal de imagem no animal portador de tumor mute 49 é de 20 graus, 24 horas após a injeção, mas muda para 10 graus nove dias após a injeção. Isso sugere que a alteração no sinal fluorescente está correlacionada com mudanças morfológicas, provavelmente refletindo o crescimento tumoral. Conforme mostrado nesta tabela, o método M-A-R-O-I demonstra claramente que o sinal fluorescente diminui para projeções com rotação crescente em relação ao ângulo ideal de imagem.Em tumores cerebrais, obteve-se uma diminuição média de 7% no sinal fluorescente se a orientação física do animal estiver deslocada em mais de mais ou menos 10 graus em relação ao ângulo ideal de imagem. Foi medida uma diminuição média de 21% no sinal fluorescente a mais ou menos 20 graus.Assim, desvios relativamente pequenos em relação ao ângulo ideal podem resultar em diminuições percentuais significativas do sinal. A utilização da técnica M-A-R-O-I para o posicionamento da imagem permitirá aos pesquisadores produzir dados mais consistentes e confiáveis. O método M-A-R-O-I foi finalmente utilizado para avaliar o direcionamento das articulações artríticas por SAPs C-D-O-P-S-C-V-M 24 horas após a injeção.Este animal obteve pontuação três com três articulações artríticas. Imagens de fluorescência dos dedos e tornozelos do camundongo artrítico são apresentadas aqui com base nos gráficos das medições correspondentes de fótons. Em rotações de 10 graus, os ângulos ideais de imagem encontrados para o dedo e o tornozelo são respectivamente 140 graus e 120 graus. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar e adquirir dados M-A-R-O-I que permitem aos pesquisadores determinar o ângulo ideal para análise de imagem de fluorescência.

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