In Vivo Imagem Óptico de tumores cerebrais e artrite Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

O objetivo geral deste procedimento é realizar imagens in vivo de 360 graus de um camundongo para determinar o ângulo ideal para a análise de fluorescência. Isso é feito preparando primeiro os modelos animais de tumor cerebral ortotópico, tumor cerebral modificado e artrite. Em seguida, a proteína SAPs C é produzida e as nano vesículas SAP D-O-P-S-C-V-M são preparadas.

Em seguida, as nano vesículas são injetadas na veia da cauda dos animais. Finalmente, imagens de fluorescência e raios-x são tiradas e analisadas. Em última análise, o método M-A-R-O-I é usado para mostrar o ângulo ideal para análise de imagem de fluorescência.

A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a imagem de fluorescência planar 2D, é que o método M-A-O-M-A-R-O-I permite que os investigadores determinem o ângulo ideal para a análise de imagem de fluorescência. As implicações dessa técnica se expandem para a terapia e o diagnóstico de câncer e artrite porque o CEP CS Vesical pode atingir o tumor e o tecido inflamatório. Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Cincinnati e pela Fundação de Pesquisa do Hospital Infantil de Cincinnati para realizar esses estudos e camundongos com tumor cerebral ortotópico.

Um camundongo com tumor cerebral geneticamente modificado e um modelo de camundongo com artrite AKB são usados De acordo com o protocolo de texto, use um sistema de pontuação macroscópica de índice artrítico para avaliar camundongos para artrite da seguinte forma, zero é igual a nenhuma artrite detectável, um é igual a inchaço e / ou vermelhidão da pata, ou um dígito dois é igual a duas articulações envolvidas. Três é igual a três articulações envolvidas e quatro é igual a artrite grave de toda a pata e dedo produzem proteína C SAPs humana recombinante em células de E coli antes de precipitar com etanol e cromatografia líquida de alta eficiência A purificação após liofilização determina a concentração de SAP C seco em peso. Para misturar a proteína SAP C, combine 0,18 miligramas de DOPS e 0,03 miligramas de CVM em um tubo de vidro e use gás nitrogênio para evaporar os solventes lipídicos.

Em seguida, adicione 0,32 miligramas de SAPs de proteína do mar em pó à mistura. Suspenda a mistura seca em um mililitro de tampão PBS e banho, sonicado por 15 minutos. Passe a suspensão por uma coluna Cidex G 25 para remover o corante CVM livre.

As nanopartículas SAP C-D-O-P-S-C-V-M terão máximos de excitação e emissão de 653 nanômetros e 677 nanômetros, respectivamente. Para testar a imagem óptica rotacional multi-ângulo ou o método M-A-R-O-I usando o sistema Mars, após anestesiar um camundongo de um dos modelos de camundongo descritos com flúor 2% ISO, posicione o camundongo em decúbito dorsal no sistema Marte com a coluna voltada para a câmera a partir da tela de visualização da guia do rotador brucker MI, calibre o filme de suporte de 380 graus de Marte. Para posicionar o mouse para administrar SAPs C-D-O-P-S-C-V-M na cauda do mouse, injete 200 microlitros por via intravenosa 24 horas depois e, novamente, sete a nove dias após a injeção, tire imagens de fluorescência e raios-x em incrementos de 10 graus ao longo de um curso de 380 graus, criando uma ligeira sobreposição para garantir que não haja lacunas no conjunto de dados rotacional.

Usando o software de rotação Bruker, sobrepôs imagens fluorescentes sobre imagens de raios-x para localização anatômica. Para analisar as imagens, desenhe uma região retangular de interesse, ou ROI, abrangendo a largura do campo de visão, ou FOV do local da doença para camundongos com tumor cerebral. Use a mesma ROI em cada modelo de tumor e os respectivos camundongos de controle para todos os pontos de tempo usando pontos de referência anatômicos para marcar a posição da ROI após a subtração automática do fundo.

Determine a intensidade média de fluorescência para cada imagem usando o software Brucker MI para converter as imagens de fluorescência em fótons por segundo por milímetro quadrado, plote os valores de fluorescência em função dos ângulos de imagem e aplique como barras de erro. O desvio padrão dos valores médios de fluorescência obtidos de camundongos controle. A imagem de fluorescência de um camundongo portador de tumor ortotópico representativo é mostrada nesta figura.

Demonstramos aqui que a semente de SAPs, nano vesículas DOPS marcadas com um corante vermelho distante, se acumula especificamente em tumores cerebrais ortotópicos e espontâneos de camundongos, bem como em articulações artríticas de camundongos KBXN. O objetivo principal do sistema de Marte é determinar o ângulo ideal de fluorescência para que as medições mais precisas possam ser feitas, como visto aqui. O ângulo de imagem ideal para este animal é de 10 graus.

A posição em que a intensidade do fóton de fluorescência é a maior linha de base as medições foram feitas antes da injeção de SAP C-D-O-P-S-C-V-M, e 24 horas após a injeção os camundongos controle livres de tumor receberam um tratamento semelhante. Esses números mostram dados comparáveis do modelo de camundongo com tumor cerebral geneticamente modificado. As imagens de fluorescência e as medições de fótons foram tiradas no início do estudo, 24 horas e nove dias após a injeção de SAP C-D-O-P-S-C-V-M.

Os gráficos mostram que o ângulo de imagem ideal no tumor animal com tumor mudo 49 é de 20 graus, 24 horas após a injeção, mas muda para 10 graus nove dias após a injeção. Isso sugere que a alteração do sinal fluorescente se correlacionou com alterações morfológicas que provavelmente refletem o crescimento do tumor. Conforme mostrado nesta tabela, o método M-A-R-O-I demonstra claramente que o sinal fluorescente diminui para projeções com rotação crescente para longe do ângulo de imagem ideal.

Nos tumores cerebrais, foi obtida uma diminuição média de 7% no sinal fluorescente. Se a orientação física do animal fosse mais de 10 graus para mais ou para menos deslocada em relação ao ângulo de imagem ideal. Uma diminuição média de 21% no sinal fluorescente foi medida em mais ou menos 20 graus.

Assim, deslocamentos relativamente pequenos do ângulo ideal podem resultar em reduções percentuais significativas do sinal. A utilização da técnica M-A-R-O-I para posicionamento de imagens permitirá que os investigadores produzam dados mais consistentes e confiáveis. O método M-A-R-O-I foi finalmente usado para avaliar o direcionamento das articulações artríticas pelos SAPs C-D-O-P-S-C-V-M 24 horas após a injeção.

Este animal marcou três com três articulações artríticas. Imagens de fluorescência do dedo do pé e tornozelo do camundongo artrítico são mostradas aqui com base em gráficos de medições de fótons correspondentes Em rotações de 10 graus, os ângulos de imagem ideais encontrados para o dedo do pé e tornozelo são 140 graus e 120 graus, respectivamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar e adquirir dados M-A-R-O-I que permitem aos investigadores determinar o ângulo ideal para análise de imagem de fluorescência.