Name: A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T21:00:00.000+00:00
Duration: 24 min 2 s
Description: Aprenda a abordagem ChroP para analisar a composição proteômica de domínios cromatínicos específicos usando imunoprecipitação e espectrometria de massa. Este método revela interações entre modificações de histonas e proteínas associadas.

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Esta pesquisa foi publicada originalmente em Mol Proteômica celulares. Soldi M. e Bonaldi T. A proteômica Investigação de cromatina domínios funcionais revelou novas sinergias entre Distinct Heterochromatin Componentes MCP. 2013; 12: 64-80. © da Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular. Agradecemos Roberta Noberini (Instituto Italiano de Tecnologia e IEO, Itália) para a leitura crítica do manuscrito. Trabalho TB é apoiada por doações da Fundação Harvard Armenise-Programa de Desenvolvimento de Carreira Giovanni, a Associação Italiana para a Pesquisa do Câncer e do Ministério da Saúde italiano. Trabalho MS foi apoiado por uma bolsa FIRC.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Descrevemos recentemente ChroP, uma estratégia para a caracterização quantitativa em grande escala de componentes proteicos de cromatina. ChroP combina duas abordagens complementares utilizados no campo epigenética, chip e MS, lucrar com os seus pontos fortes e superar suas respectivas limitações. CHIP acoplado ao seqüenciamento de profundidade (CHIP-Seq) permite o mapeamento do genoma de modificações de histonas na resolução de alguns nucleossomos 35. Embora vantajosa para a sua sensibilidade, os ensaios à b...

Cromatina é um complexo de nucleoproteína altamente dinâmico, que está envolvido como modelo principal para todos os processos mediados por ADN. O nucleossoma é a unidade básica repetida de cromatina e consiste de um núcleo octamérico proteico contendo duas moléculas de cada histona H2A canónica, H2B, H3 e H4, em torno dos quais 147 pb de ADN são enrolados 1,2. Todas as histonas centrais são estruturados como um domínio globular e uma &quot;cauda&quot; N-terminal flexível que se projeta fora do nucleossomo. Um dos principais mecanismos de regulação da estrutura da cromatina e dinâmica é baseado no covalentes modificações pós-traducionais (PTMs), que ocorrem principalmente no terminal N das histonas 3,4. Modificações de histonas pode funcionar tanto alterando a estrutura de ordem mais elevada da cromatina, alterando os contactos entre as histonas-ADN ou entre nucleossomas, e, assim, controlar a acessibilidade de proteínas de ligação de ADN (mecanismos cis), ou actuando como dockinsites de g para proteínas reguladoras, seja como unidades individuais ou incorporados em complexos multiméricas. Tais proteínas reguladoras podem exercer a sua função de diferentes maneiras: por modulando directamente a expressão do gene (ou seja, proteínas TAF), ou através da alteração do posicionamento nucleossoma (isto é, a remodelação da cromatina complexos) ou por modificação de outros resíduos de histonas (isto é, proteínas com metil-transferase, ou acetil- atividade transferase) (mecanismos de trans) 5. A observação de que o aglomerado distinto padrões PTM cromatina em loci específicos conduziu à elaboração da hipótese de que diferentes modificações em locais distintos podem sinergizar a gerar um código molecular mediando o estado funcional do DNA subjacente. A &quot;hipótese código de histonas&quot; ganhou amplo consenso nos próximos anos, mas a sua verificação experimental foi retido por limitações técnicas 6,7. Proteoma com base em espectrometria de massa (MS) tem emergido como umpoderosa ferramenta para mapear padrões de modificação de histonas e caracterizar proteínas de ligação da cromatina 8. MS detecta uma alteração como uma Δmass específica entre a massa experimental e teórica de um péptido. Ao nível das histonas individuais, MS fornece um método imparcial e abrangente para mapear PTMs, permitindo a detecção de novas modificações e interplays reveladoras entre eles 9-14. Nos últimos anos, um número de estratégias têm sido desenvolvidas para dissecar a composição proteoma da cromatina, incluindo a caracterização de cromossomas mitóticos intactos 15, a identificação de proteínas de ligação solúveis hPTM 16-18 e o isolamento e a análise das regiões de cromatina específicos (isto é, telômeros) 19,20. No entanto, a investigação das sinergias específicas para um local entre PTMs de histonas, variantes e proteínas associadas à cromatina ainda está incompleta. Aqui, descrevemos uma nova abordagem, denominada ChroP (Chro roteomics matin P) 21, que temos desenvolvido para caracterizar de forma eficiente domínios de cromatina funcionalmente distintas. Esta abordagem adapta imunoprecipitação da cromatina (ChIP), um protocolo bem estabelecida utilizada na investigação epigenética, para a análise do proteoma com base no MS eficiente da amostra enriquecida. Nós desenvolvemos dois protocolos diferentes, dependendo do tipo de cromatina usado como entrada e a pergunta dirigida por MS; em particular: 1) CHIP da cromatina nativa unfixed digerido com MNase é empregado para purificar mono-nucleossomos e dissecar os hPTMs co-associando (N-ChroP); 2) ChIP de cromatina reticulado fragmentadas por sonicação é usado em combinação com uma estratégia baseada no interactomics SILAC caracterizar todos cromatina co-enriquecendo proteínas (X-ChroP) de ligação. Nós ilustramos aqui a combinação de N-e X-ChroP para enriquecer e estudando heterochromatin, usando H3K9me3 como isca para as etapas de imunoprecipitação. O uso de ChroP pode ser estendidoestudar tanto regiões distintas sobre cromatina, ou alterações na composição da cromatina dentro da mesma região durante a transição para um estado funcional diferente, abrindo assim o caminho para diversas aplicações em epigenética.

<table><tbody><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>SILAC DMEM</td><td>M-Medical</td><td>FA30E15086</td><td></td></tr><tr><td>Diallisado FBS</td><td>Invitrogen</td><td>26400-044</td><td></td></tr><tr><td>Lisina 0 (12C6 14N2 L-lisina)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>L8662</td><td></td></tr><tr><td>Arginina 0 (12C6 14N4 L-arginina)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A6969</td><td></td></tr><tr><td>Lisina 8 (13C6 15N2 L-lisina)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>68041</td><td></td></tr><tr><td>Arginina 10 (13C6 15N4 L-arginina)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Microcócica</td><td>Roche</td><td>10 107 921 001</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos de coquetel inibidores de protease completos e sem EDTA</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de diálise Spectra / Por 3, 3,5K MWCO, largura plana de 18 mm, comprimento de</td> <td>50 pésKit de</td> purificação PCR QIAquick QIAquick da Spectrumlabs <td>132720</td><td></td></tr><tr><td></td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histona H3 tri-metilado K9-ChIP grau</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>Histona H3 peptídeo tri-metil K9&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab1773</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12%&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Gel Bis-Tris</td>Kit <td>de</td> coloração azul coloidal <td>Invitrogen</td> NP0335BOX <td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>LDS Sample Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Formaldheyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Aceti anidrido-d6</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175641-1G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Formic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida &ge; 99% (HPLC), cristalino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Grau de Sequenciamento Trypsin Modificado, Congelado 100 &mu; g (5 &vezes; 20 &mu; g)</td> <td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Nanospray OD 360&mu; m x ID 75&mu; m, dicas ID 8 &mu; m não revestido Pk 5</td><td>Microcolumn Srl</td><td>FS360-75-8-N-5-C15</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 &micro; m&nbsp; &nbsp; 15% C</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.aq.</td><td></td></tr><tr><td>Disco de extração de carbono, 47 mm</td><td>Agilent Technologies</td><td>12145040</td><td></td></tr><tr><td>Disco de extração de cátions</td><td>Agilent Technologies</td><td>66889-U</td><td></td></tr></tbody></table>

a abordagem chrop combina chip e espectrometria de massa dissecar proteômica paisagens locus específicas da cromatina

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Cromatina é um complexo de nucleoproteína altamente dinâmico feitos de DNA e proteínas que controla vários processos dependentes de DNA. A estrutura da cromatina e a função em regiões específicas é regulada pelo local de enriquecimento de histonas modificações pós-tradução (hPTMs) e variantes, proteínas de ligação da cromatina, incluindo factores de transcrição, e a metilação do DNA. A caracterização proteômica da composição da cromatina em regiões funcionais distintas até agora tem sido dificultada pela falta de protocolos eficientes para enriquecer tais domínios na pureza e quantidade adequada para a posterior análise em profundidade por Espectrometria de Massa (MS). Descrevemos aqui uma estratégia proteômica cromatina recém-concebido, chamado ChroP (Chro roteomics matin P), em que a cromatina imunoprecipitação preparativa é usado para isolar regiões de cromatina distintas cujas características, em termos de hPTMs, variantes e co-associados proteínas não histonic, são analisado através de EM. Nós ilustramos elere a criação de ChroP para o enriquecimento e análise das regiões heterocromáticas transcricionalmente silenciosos, marcado pela presença de tri-metilação da lisina 9 na histona H3. Os resultados obtidos demonstram que o potencial de ChroP no completamente caracterizar o proteoma heterocromatina e provar como uma estratégia de análise poderoso para a compreensão de como os determinantes de proteínas distintas da cromatina interagir e sinergizam para estabelecer configurações estruturais e funcionais específicas para um local.

Imunoprecipitação da cromatina é uma técnica poderosa usada para perfilar a localização de uma proteína ou de uma modificação da histona ao longo do genoma. Em um equivalente proteômica, chip é seguido por proteômica baseados em MS para identificar qualitativa e quantitativamente os hPTMs, variantes de histonas e proteínas de ligação da cromatina que são imuno juntamente com a modificação ou a proteína de interesse, usado como &quot;isca&quot;. Na abordagem de N-ChroP, descrito na Figura 1A, ChIP nativa...

Ao combinar nativa e reticulação da cromatina imunoprecipitação com alta resolução de Espectrometria de Massa, ChroP abordagem permite a dissecar a arquitectura proteómica composto de histonas modificações, variantes e proteínas não-histonic sinergia na cromatina domínios funcionalmente distintos.

A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar a composição proteômica de domínios cromatínicos funcionalmente distintos, a fim de compreender como os diferentes elementos atuam em sinergia para determinar o estado transcripcional. Isso é realizado primeiramente preparando núcleos de células cultivadas e digerindo a cromatina em fragmentos de comprimento ideal por meio de métodos enzimáticos ou mecânicos. O segundo passo consiste em purificar um domínio funcional distinto da cromatina total por imunoprecuperação, utilizando anticorpos direcionados contra uma modificação pós-traducional da histona ou contra uma proteína conhecida por marcar especificamente a região de interesse.Em seguida, as proteínas de cromatina imunopurificadas são separadas por eletroforese SDS-PAGE e digeridas diretamente no gel antes da espectrometria de massa. O próximo passo consiste na análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa em um instrumento de alta resolução. Por fim, os dados brutos de espectrometria de massa são analisados por meio de software específico, seguidos de inspeção manual dos espectros para identificar e quantificar modificações de histonas e proteínas coenri

the-chrop-approach-combines-chip-mass-spectrometry-to-dissect-locus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Cromatina Análise de Interação por Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) é um método...

Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição

Avanços na espectrometria de massa permitiu a análise de alto rendimento de expressão da proteína e da modificação de uma série de tecidos. Combinada com fraccionamento subcelular e modelos de doença, a massa espectrometria quantitativa e bioinformática pode revelar novas propriedades nos sistemas biológicos. O método aqui descrito analisa cromatina proteínas associadas na definição de doença cardíaca e é prontamente aplicável a...

Análise quantitativa de proteomas cromatina na Doença

A identificação de moléculas associadas a regiões genômicas específicas de interesse é necessária para entender os mecanismos de regulação das funções dessas regiões. Este protocolo descreve procedimentos para realizar imunoprecipitação de cromatina mediada por molécula de ligação ao DNA (enChIP) projetada para identificação de proteínas e RNAs associados a uma região genômica específica.

O isolamento de regiões específicas genômico e identificação de moléculas pela Associated enChIP

Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP-sequenciamento da elevado-produção otimizado e pipeline de análises computacionais para a determinação de padrões de estado todo o genoma da cromatina de tecidos de tumor congelado e linhas celulares.

Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor

Este é um método para identificar novas proteínas DNA-interagindo em loci de destino específico, baseando-se na captura de sequência-específicos da cromatina de quitosana para análises subsequentes proteomic. Nenhum conhecimento prévio sobre potenciais proteínas obrigatórias, nem modificações de célula são necessários. Inicialmente desenvolvido para o fermento, a tecnologia agora foi adaptada para células de mamíferos.

Adaptação da hibridação capturar de proteínas da cromatina associada para proteômica para células de mamíferos

Descreveremos um protocolo passo a passo para cromatina em tandem da imunoprecipitação sequenciamento (tChIP-Seq) que permite a análise da modificação do histone todo o genoma de célula tipo-específicas.

TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

CUT&amp;RUN e suas variantes podem ser usadas para determinar a ocupação de proteínas na cromatina. Este protocolo descreve como determinar a localização da proteína na cromatina usando uliCUT&amp;RUN unicelular.

Localização de fator unicelular em Chromatina usando decote de entrada ultra-baixa sob alvos e liberação usando nuclease

Este protocolo descreve o método Capture Hi-C usado para caracterizar a organização 3D de regiões genômicas alvo de tamanho megabaseado em alta resolução, incluindo limites de domínios topologicamente associados (TADs) e interações de cromatina de longo alcance entre elementos regulatórios e outros elementos de sequência de DNA.

Decifrando a organização da cromatina 3D de alta resolução via captura Hi-C

A expressão gênica é regulada por interações de promotores gênicos com elementos regulatórios distais. Aqui, descrevemos como a baixa entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite a identificação dessas interações em tipos celulares raros, que antes eram imensuráveis.

Um fluxo de trabalho integrado para estudar a arquitetura do genoma espaço-temporal centrada no promotor em populações celulares escassas

Apresentamos um protocolo de microscopia de localização de molécula única em três cores (SMLM) que permite o mapeamento reprodutível de eucromatina, heterocromatina e RNAP II para análise espacial. Esse protocolo permite a marcação eficiente de multicor em ambientes nucleares densos, incluindo alvos associados à cromatina, possibilitando detecção simultânea e confiável.

Um Protocolo de Microscopia de Localização de Molécula Única Multirótulo para Investigação da Cromatina em Ambiente Nuclear Denso

Aprenda a abordagem ChroP para analisar a composição proteômica de domínios cromatínicos específicos usando imunoprecipitação e espectrometria de massa. Este método revela interações entre modificações de histonas e proteínas associadas.

A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina

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