A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar a composição proteômica de domínios de cromatina funcionalmente distintos, a fim de entender como os diferentes elementos se sinergizam para determinar o estado transcricional. Oito. Isso é feito primeiro preparando núcleos de células cultivadas e digerindo a cromatina em fragmentos de comprimento ideal por meios enzimáticos ou mecânicos. O segundo passo é purificar um domínio funcional distinto da cromatina em massa por imunoprecipitação usando anticorpos de isca contra uma modificação pós-traducional de histona ou uma proteína conhecida por marcar especificamente a região de interesse.

Em seguida, as proteínas imunopurificadas da cromatina são separadas por página SDS e ingeridas antes da espectrometria de massa. A etapa seguinte é a análise por espectrometria de massa por cromatografia líquida em um instrumento de alta resolução. Em última análise, os dados brutos de espectrometria de massa são analisados por software ad hoc, seguido de inspeção manual dos espectros para identificar e quantificar modificações de histonas e proteínas de enriquecimento de coen com base, respectivamente, no cálculo da abundância relativa em material imunoprecipitado em relação à entrada ou na razão SLAC e experimentos de competição usando peptídeo solúvel como competidor da isca Através da cultura, Podemos obter informações sobre as interações entre o padrão de modificação histo e a variância e alcançar as regiões específicas da cromatina e a interação nuclear recrutada por elas, que agem de maneira concertada.

Para definir uma paisagem específica da cromatina com efeito regulatório na expressão gênica, a principal vantagem da cultura sobre o método existente baseado na triagem in vitro para interação solúvel ou modificação histo, como puxar para baixo. O uso de peptídeos de histonas ou moldes de cromatina reconstituídos é a possibilidade de investigar a composição da cromatina específica do locus em condições mais nativas e menos artificiais. A aplicação da cultura também pode ser estendida a outro sistema modelo ou em estudo dependente do tempo.

Por exemplo, podemos usar a cultura em uma linha celular que responde a certas perturbações que provocam uma resposta transcricional global. Demonstrando este procedimento estará Monica Sodi. Um pós-doutorado em meu laboratório Núcleos para o procedimento do chip N são preparados a partir de não rotulados.

As células A S3 usam uma a duas vezes 10 elevado a oitavo por experimento. Para colher células, faça quatro alíquotas de cinco vezes 10 elevado a sete células em tubos de 50 mililitros e centrifugue a 340 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Lave as células com PBS gelado, descarte o sobrenadante e resus.

Suspenda cada pellet celular em oito mililitros, lise, tampão e transfira em tubos de 15 mililitros. Incube por 10 minutos a quatro graus Celsius em uma roda giratória. Em seguida, despeje cuidadosamente cada lisado celular em uma almofada de sacarose e centrifugue em um rotor giratório a 3.270 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius para separar os núcleos do citoplasma.

Rejeitar os sobrenadantes e lavar os pellets nucleares duas vezes no gelo. PBS frio na segunda lavagem. Agrupar os núcleos num tubo de 50 mililitros depois de eliminar o sobrenadante da segunda lavagem.

Ressuspenda um pellet nuclear em um mililitro de tampão de digestão. Divida cada amostra em duas alíquotas de 500 microlitros e mantenha no gelo. Adicionar a cada alíquota cinco microlitros de MNA correspondentes a uma concentração final de 0,005 unidades de enzima por microlitro de núcleo.

Misture delicadamente e incube a 37 graus Celsius por 60 minutos. Adicione um EDTA milimolar para interromper a reação e mantenha no gelo. Pulverize os núcleos digeridos por centrifugação a 7.800 vezes G a quatro graus Celsius por 10 minutos.

Transfira os sobrenadantes para dois tubos e armazene a quatro graus Celsius. Esta é a fração S um que contém a primeira fração solúvel de cromatina compreendendo zonas mononucleo, ressuspende cuidadosamente os pellets em um mililitro de diálise, tampão e dialisa durante a noite a quatro graus Celsius em três litros de tampão de diálise com agitação suave constante no dia seguinte. Colete o material dialisado e centrifugue a 7.800 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Transfira o super natin para um novo tubo einor. Esta é a fração S dois, que cora para os nucleossomos tta dependendo da extensão da digestão de M a. Armazene a quatro graus Celsius antes da imunoprecipitação.

Verifique a qualidade e a deficiência da digestão do MN a por eletroforese em gel de aros e inspeção visual da escada dos nucleossomos, conforme ilustrado neste exemplo, a fração S um é altamente enriquecida em zonas mononucleo, enquanto a fração S dois contém principalmente nucleossomo para imunoprecipitação da cromatina. Juntar primeiro um volume de tampão de diluição de aparas à fracção S um. Em seguida, adicione o anticorpo contra a modificação pós-traducional da histona ou proteína de interesse e incube durante a noite em uma roda giratória a quatro graus Celsius no dia seguinte.

Isole a cromatina usando esferas magnéticas acopladas à proteína G. Adicione 100 microlitros de grânulos bloqueados à amostra de cromatina S one e incube em uma roda giratória a quatro graus Celsius por três horas. Depois de três horas.

Centrifugar a 340 vezes G durante um minuto. Coloque os tubos einor em um rack magnético para pellet as contas. Salve o sobrenadante, que é o fluxo através do nucleossomo não ligado.

Adicione tampão de lavagem aos grânulos e incube por cinco minutos a quatro graus Celsius em uma roda giratória antes da centrifugação. Desta forma, lave as contas um total de quatro vezes com o aumento da concentração de sal. Duas lavagens a 75 milimolares de cloreto de sódio, seguidas de uma lavagem a 125 milimolares e outra a 175 milimolares de cloreto de sódio para eluir.

O amino precipitou a cromatina. Incube as esferas em 30 microlitros de tampão de amostra LDS suplementado com 50 milimolares dihi. Três etol por cinco minutos a 70 graus Celsius.

As proteínas aludidas são posteriormente separadas pela página SDS para iniciar este procedimento, reticular as células com formaldeído. Adicione 0,75% de formaldeído às células marcadas com SLAC. Misture brevemente e incube por 10 minutos em temperatura ambiente.

Aponte o formaldeído adicionando glicina 125 milimolar e incubando por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, divida as células em duas a quatro alíquotas de cerca de cinco vezes 10 elevado a sete células por alíquota. Enxágue as células três vezes com PBS gelado após a última lavagem.

Descarte os sobrenadantes e mantenha os pellets ressuspendendo cada pellet celular em 10 mililitros de tampão de lise. Incubar durante 10 minutos a quatro graus Celsius com centrifugação rotativa a 430 vezes G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Rejeitar os sobrenadantes e guardar os grânulos nucleares.

Depois de lavar os pellets nucleares com tampão de lavagem Resus, suspenda cada pellet nuclear em três mililitros de tampão de incubação de cavacos e mantenha no gelo para fragmentar o sonicado de cromatina em uma bioruptura resfriada a 200 watts. Remova 2% da cromatina sonicada e reverta a reticulação por incubação a 65 graus Celsius por no mínimo uma hora. No tampão de incubação de chips.

Este é o material de entrada. Posteriormente, o DNA é extraído usando um kit de purificação por PCR e a fragmentação da cromatina é avaliada por eletroférese em gel aros para imunoprecipitar a cromatina reticulada. Adicione o anticorpo de escolha à cromatina sonicada marcada leve e pesada.

No canal leve, adicione uma dobra em excesso do peptídeo solúvel, além da alíquota de anticorpo, amostras leves e pesadas a três tubos de microcentrífuga cada e incube durante a noite a quatro graus Celsius em uma roda giratória no dia seguinte, adicione 100 microlitros de esferas magnéticas acopladas à proteína G bloqueada a cada amostra de cromatina e incube em uma roda giratória por três horas a quatro graus Celsius. Centrifugue a 340 vezes G Durante um minuto. Coloque os tubos einor no rack magnético para pellet as contas.

O sobrenadante é o fluxo através do qual contém nucleossomos não ligados, que é guardado para controles subsequentes. Lave os grânulos quatro vezes em tampão de lavagem com concentrações crescentes de sal. Duas lavagens a cloreto de sódio a 150 milimolares seguidas de duas lavagens a 300 milimolares de cloreto de sódio.

Incube as esferas por 25 minutos a 95 graus Celsius e 30 microlitros de página SDS. Carregando o tampão da amostra para eluir e reticular as proteínas imunoprecipitadas. Por fim, agrupe os EITs e separe as proteínas por página SDS antes da espectrometria de massa.

As histonas enriquecidas com NIP são digeridas para iniciar este procedimento. As fatias de gel correspondentes às bandas de histonas centrais do gel de gradiente de acrilamida coloidal corado com kumasi de quatro a 12% BIS CITRIS são cortadas e, em seguida, coradas com 50% de acetil nitrilo e água destilada deionizada alternando com 100% de aceto nitrilo para encolher o gel quando as peças de gel estiverem completamente manchadas. Seque-os em uma centrífuga a vácuo.

Adicione D seis anidrido acético de um a nove volumes por volume em um bicarbonato de amônio molar e três microlitros de acetato de sódio como catalisador às peças de gel. Incubar por três horas a 37 graus Celsius com forte agitação. Encolha os pedaços de gel em 100% de acetil nitrilo e desidrate-os por cerca de cinco minutos em uma centrífuga a vácuo, em seguida, reidratar os pedaços de gel com gelo frio.

100 nanogramas por microlitro de solução de tentina em bicarbonato de amônio a 50 milimolares durante a noite a 37 graus Celsius. A combinação de modificação química de lisinas usando digestão deuterada, anidrido acético e tripsina gera um padrão de digestão de histona semelhante ao RC em gel coleta peptídeos digeridos solúveis em um novo tubo einor e seca os peptídeos por cerca de uma hora. Ressuspenda peptídeos liofilizados em ácido acético 0,5% 0,1% Tri Fluor, ácido acético dessalinize e concentre peptídeos em um sanduíche de carbono de fase C 18 invertida e cromatografia de troca iônica em micro colunas artesanais.

Carregue 50% dos peptídeos na ponta do estágio sanduíche de carbono C 18 e 50% na ponta do estágio SCX Eluva peptídeos das pontas SCX usando hidróxido de amônio 5%, 30% de metanol e das pontas de carbono C 18 usando 80% de aceto nitrilo, 0,5% de ácido acético. Por fim, liofiliza, os peptídeos iludidos e res os suspendem em ácido fórmico a 0,1% na imunoprecipitação da cromatina nativa e na abordagem da cultura. A cromatina é digerida com MNA como um primeiro passo para purificar um domínio funcional distinto da cromatina em massa.

O painel à esquerda mostra um teste de MNA em pequena escala no qual o DNA é resolvido em um gel de 1% de aros após a digestão da cromatina com MNA em diferentes lapsos de tempo. Uma digestão MNA em grande escala é mostrada à direita. O DNA é resolvido em um gel de 1% de aros após 60 minutos de digestão da cromatina de MNAs e após a separação da fração S um contendo zonas mononucleosas e da fração S dois contendo polinucleossomos.

A cromatina digerida e rica em mononucleossomos é incubada com um anticorpo que reconhece uma modificação pós-traducional específica de sua ona. Por exemplo, trimetilação de lisina nove na histona H três K nove ME três, um marcador de cromatina silenciosa. As proteínas imunopurificadas, bem como a entrada da cromatina, são então separadas por página SDS e a coloração coloidal de kumasi mostra histonas centrais H três, H quatro, H dois A e H dois B ao redor e abaixo da banda de 17 kilodalton com H três e H dois B co migrando a comparação entre a quantidade de trimm metilado glicina nove em H três presente no fluxo e entrada indica que cerca de 50% de A região de interesse é imunopurificada, excluindo o risco de viés devido ao enriquecimento de uma subpopulação menor de cromatina.

Este histograma representa a média mais menos SEM de três experimentos independentes para cada modificação espectrometria de massa MS é então empregada para caracterizar as modificações pós-traducionais associadas aos nucleossomos enriquecidos. Todas as modificações pós-traducionais de histonas são verificadas por inspeção manual dos espectros ms ms correspondentes neste espectro Ms m Ms representativo usando fragmentação CID. As séries de íons B e Y permitem a definição da sequência do peptídeo H três, nove a 17, e a localização da trimetilação no resíduo de lisina nove, a quantificação sem marcação é obtida construindo primeiro o cromatograma de íons extraído ou XIC para cada um correspondente a cada peptídeo modificado com base no valor da carga de massa e calculando a área sob a curva ou um UC para cada pico.

Em seguida, a abundância relativa dos diferentes graus de metilação na lisina nove no peptídeo H três nove a 17 é estimada dividindo-se o A UC de cada peptídeo modificado pela soma das áreas correspondentes a todas as formas observadas não modificadas e modificadas desse peptídeo. Em terceiro lugar, o enriquecimento relativo de cada modificação no material lascado é expresso como uma razão logarítmica entre a abundância relativa de cada metilação no peptídeo lascado sobre a entrada. A análise do peptídeo H três nove a 17 mostra o enriquecimento de D e TRIMM metilado lisina nove com a correspondente depleção das formas não modificada e monometil

Com esses resultados como controle positivo para a especificidade do anticorpo, a associação de cos ou depleção de todas as outras modificações pode ser avaliada tanto no nível intramolecular no mesmo H três quanto no nível intermolecular em outras histonas enriquecidas com Coen dentro do mesmo nucleossomo. Este mapa de calor representativo resume o enriquecimento de todos os cos associados a H ptms identificados na histona H três, H quatro e H dois A. Cada linha corresponde a uma modificação diferente e ND indica modificações não detectadas para rastrear todas as proteínas. A associação de co dentro do chip de heterocromatina da cromatina reticulada fragmentada por sonicação é usada em combinação com a marcação de isótopos estáveis por aminoácidos em cultura de células ou lac.

Primeiro, a eficiência de marcação é avaliada calculando a incorporação de lisina pesada e arginina pesada em proteínas. Para uma quantificação precisa de proteínas, é necessária uma incorporação superior a 95% para ambos os aminoácidos pesados, conforme observado aqui, a mediana da distribuição da densidade do peptídeo de lisina e arginina é igual a 0,974 e 0,964, respectivamente. Em segundo lugar, a proporção de peptídeo solúvel para anticorpo deve ser otimizada.

Esta figura mostra um espectro de massa ampliado no valor de carga de massa correspondente dos dois mais carga trimm metilado lisina nove K nove ME três no H três nove a 17 peptídeo, tanto para formas leves quanto pesadas em entrada e octr lascado. Durante a entrada, as intensidades do peptídeo pesado e leve são próximas a uma no chip SLAC dianteiro. A intensidade do peptídeo leve é muito menor do que a do contraparte pesado, indicando assim uma competição eficiente.

Um resultado representativo da página SDS de entrada de cromatina marcada com L leve e H pesado e chip de material precipitado com co amino é mostrado aqui. A pista correspondente ao material lascado foi cortada em 10 fatias, enquanto apenas duas fatias de entrada foram analisadas. Para análise de teste de incorporação, os experimentos de competição slac são normalmente realizados em duplicata, nos chamados formatos direto e reverso, onde a competição com o excesso de peptídeo solúvel é trocada das amostras de cromatina H pesada para L leve.

Este espectro completo representativo mostra o par SLAC correspondente aos peptídeos das proteínas HP um e macro dois A, uma proporção de proteína pesada para leve maior que um. No experimento direto espelhado por uma proporção menor que um na réplica reversa, demonstrar o enriquecimento específico dessas proteínas em proteínas heterocromatinas cuja intensidade nas formas pesada e leve são semelhantes nos experimentos direto e reverso produzem uma razão constante próxima a um e são classificadas como de fundo. A interseção dos experimentos X chipp direto e reverso leva à identificação de 635 proteínas presentes em ambos os experimentos e quantificadas com pelo menos duas contagens de razão.

O gráfico log dois de suas proporções pesadas para leves representa o chamado cromossomo hetero. As linhas pontilhadas vermelhas neste gráfico de dispersão representam os 40% e 30% principais das proporções de proteína. Conforme indicado, os interagentes genuínos de lisina metilada trimm nove são inequivocamente identificados como as proteínas presentes nos 40% superiores das distribuições de proporção de proteínas.

Aqui, as distribuições de proporção de proteínas de experimentos de entrada para frente e para trás são mostradas em preto, azul e laranja, respectivamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como preparar a cromatina para E e a cultura final para processar as proteínas monoprecipitadas antes da análise por espectrometria de massa. Como identificar e quantificar a modificação de histões em espectros de massa e como definir uma interação específica em suas proporções de proteínas.