Name: A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T21:00:00.000+00:00
Duration: 24 min 2 s
Description: Aprenda a abordagem ChroP para analisar a composição proteômica de domínios cromatínicos específicos usando imunoprecipitação e espectrometria de massa. Este método revela interações entre modificações de histonas e proteínas associadas.

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Esta pesquisa foi publicada originalmente em Mol Proteômica celulares. Soldi M. e Bonaldi T. A proteômica Investigação de cromatina domínios funcionais revelou novas sinergias entre Distinct Heterochromatin Componentes MCP. 2013; 12: 64-80. © da Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular. Agradecemos Roberta Noberini (Instituto Italiano de Tecnologia e IEO, Itália) para a leitura crítica do manuscrito. Trabalho TB é apoiada por doações da Fundação Harvard Armenise-Programa de Desenvolvimento de Carreira Giovanni, a Associação Italiana para a Pesquisa do Câncer e do Ministério da Saúde italiano. Trabalho MS foi apoiado por uma bolsa FIRC.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Descrevemos recentemente ChroP, uma estratégia para a caracterização quantitativa em grande escala de componentes proteicos de cromatina. ChroP combina duas abordagens complementares utilizados no campo epigenética, chip e MS, lucrar com os seus pontos fortes e superar suas respectivas limitações. CHIP acoplado ao seqüenciamento de profundidade (CHIP-Seq) permite o mapeamento do genoma de modificações de histonas na resolução de alguns nucleossomos 35. Embora vantajosa para a sua sensibilidade, os ensaios à b...

Cromatina é um complexo de nucleoproteína altamente dinâmico, que está envolvido como modelo principal para todos os processos mediados por ADN. O nucleossoma é a unidade básica repetida de cromatina e consiste de um núcleo octamérico proteico contendo duas moléculas de cada histona H2A canónica, H2B, H3 e H4, em torno dos quais 147 pb de ADN são enrolados 1,2. Todas as histonas centrais são estruturados como um domínio globular e uma &quot;cauda&quot; N-terminal flexível que se projeta fora do nucleossomo. Um dos principais mecanismos de regulação da estrutura da cromatina e dinâmica é baseado no covalentes modificações pós-traducionais (PTMs), que ocorrem principalmente no terminal N das histonas 3,4. Modificações de histonas pode funcionar tanto alterando a estrutura de ordem mais elevada da cromatina, alterando os contactos entre as histonas-ADN ou entre nucleossomas, e, assim, controlar a acessibilidade de proteínas de ligação de ADN (mecanismos cis), ou actuando como dockinsites de g para proteínas reguladoras, seja como unidades individuais ou incorporados em complexos multiméricas. Tais proteínas reguladoras podem exercer a sua função de diferentes maneiras: por modulando directamente a expressão do gene (ou seja, proteínas TAF), ou através da alteração do posicionamento nucleossoma (isto é, a remodelação da cromatina complexos) ou por modificação de outros resíduos de histonas (isto é, proteínas com metil-transferase, ou acetil- atividade transferase) (mecanismos de trans) 5. A observação de que o aglomerado distinto padrões PTM cromatina em loci específicos conduziu à elaboração da hipótese de que diferentes modificações em locais distintos podem sinergizar a gerar um código molecular mediando o estado funcional do DNA subjacente. A &quot;hipótese código de histonas&quot; ganhou amplo consenso nos próximos anos, mas a sua verificação experimental foi retido por limitações técnicas 6,7. Proteoma com base em espectrometria de massa (MS) tem emergido como umpoderosa ferramenta para mapear padrões de modificação de histonas e caracterizar proteínas de ligação da cromatina 8. MS detecta uma alteração como uma Δmass específica entre a massa experimental e teórica de um péptido. Ao nível das histonas individuais, MS fornece um método imparcial e abrangente para mapear PTMs, permitindo a detecção de novas modificações e interplays reveladoras entre eles 9-14. Nos últimos anos, um número de estratégias têm sido desenvolvidas para dissecar a composição proteoma da cromatina, incluindo a caracterização de cromossomas mitóticos intactos 15, a identificação de proteínas de ligação solúveis hPTM 16-18 e o isolamento e a análise das regiões de cromatina específicos (isto é, telômeros) 19,20. No entanto, a investigação das sinergias específicas para um local entre PTMs de histonas, variantes e proteínas associadas à cromatina ainda está incompleta. Aqui, descrevemos uma nova abordagem, denominada ChroP (Chro roteomics matin P) 21, que temos desenvolvido para caracterizar de forma eficiente domínios de cromatina funcionalmente distintas. Esta abordagem adapta imunoprecipitação da cromatina (ChIP), um protocolo bem estabelecida utilizada na investigação epigenética, para a análise do proteoma com base no MS eficiente da amostra enriquecida. Nós desenvolvemos dois protocolos diferentes, dependendo do tipo de cromatina usado como entrada e a pergunta dirigida por MS; em particular: 1) CHIP da cromatina nativa unfixed digerido com MNase é empregado para purificar mono-nucleossomos e dissecar os hPTMs co-associando (N-ChroP); 2) ChIP de cromatina reticulado fragmentadas por sonicação é usado em combinação com uma estratégia baseada no interactomics SILAC caracterizar todos cromatina co-enriquecendo proteínas (X-ChroP) de ligação. Nós ilustramos aqui a combinação de N-e X-ChroP para enriquecer e estudando heterochromatin, usando H3K9me3 como isca para as etapas de imunoprecipitação. O uso de ChroP pode ser estendidoestudar tanto regiões distintas sobre cromatina, ou alterações na composição da cromatina dentro da mesma região durante a transição para um estado funcional diferente, abrindo assim o caminho para diversas aplicações em epigenética.

<table><tbody><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>SILAC DMEM</td><td>M-Medical</td><td>FA30E15086</td><td></td></tr><tr><td>Diallisado FBS</td><td>Invitrogen</td><td>26400-044</td><td></td></tr><tr><td>Lisina 0 (12C6 14N2 L-lisina)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>L8662</td><td></td></tr><tr><td>Arginina 0 (12C6 14N4 L-arginina)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A6969</td><td></td></tr><tr><td>Lisina 8 (13C6 15N2 L-lisina)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>68041</td><td></td></tr><tr><td>Arginina 10 (13C6 15N4 L-arginina)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Microcócica</td><td>Roche</td><td>10 107 921 001</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos de coquetel inibidores de protease completos e sem EDTA</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de diálise Spectra / Por 3, 3,5K MWCO, largura plana de 18 mm, comprimento de</td> <td>50 pésKit de</td> purificação PCR QIAquick QIAquick da Spectrumlabs <td>132720</td><td></td></tr><tr><td></td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histona H3 tri-metilado K9-ChIP grau</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>Histona H3 peptídeo tri-metil K9&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab1773</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12%&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Gel Bis-Tris</td>Kit <td>de</td> coloração azul coloidal <td>Invitrogen</td> NP0335BOX <td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>LDS Sample Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Formaldheyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Aceti anidrido-d6</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175641-1G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Formic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida &ge; 99% (HPLC), cristalino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Grau de Sequenciamento Trypsin Modificado, Congelado 100 &mu; g (5 &vezes; 20 &mu; g)</td> <td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Nanospray OD 360&mu; m x ID 75&mu; m, dicas ID 8 &mu; m não revestido Pk 5</td><td>Microcolumn Srl</td><td>FS360-75-8-N-5-C15</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 &micro; m&nbsp; &nbsp; 15% C</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.aq.</td><td></td></tr><tr><td>Disco de extração de carbono, 47 mm</td><td>Agilent Technologies</td><td>12145040</td><td></td></tr><tr><td>Disco de extração de cátions</td><td>Agilent Technologies</td><td>66889-U</td><td></td></tr></tbody></table>

a abordagem chrop combina chip e espectrometria de massa dissecar proteômica paisagens locus específicas da cromatina

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Cromatina é um complexo de nucleoproteína altamente dinâmico feitos de DNA e proteínas que controla vários processos dependentes de DNA. A estrutura da cromatina e a função em regiões específicas é regulada pelo local de enriquecimento de histonas modificações pós-tradução (hPTMs) e variantes, proteínas de ligação da cromatina, incluindo factores de transcrição, e a metilação do DNA. A caracterização proteômica da composição da cromatina em regiões funcionais distintas até agora tem sido dificultada pela falta de protocolos eficientes para enriquecer tais domínios na pureza e quantidade adequada para a posterior análise em profundidade por Espectrometria de Massa (MS). Descrevemos aqui uma estratégia proteômica cromatina recém-concebido, chamado ChroP (Chro roteomics matin P), em que a cromatina imunoprecipitação preparativa é usado para isolar regiões de cromatina distintas cujas características, em termos de hPTMs, variantes e co-associados proteínas não histonic, são analisado através de EM. Nós ilustramos elere a criação de ChroP para o enriquecimento e análise das regiões heterocromáticas transcricionalmente silenciosos, marcado pela presença de tri-metilação da lisina 9 na histona H3. Os resultados obtidos demonstram que o potencial de ChroP no completamente caracterizar o proteoma heterocromatina e provar como uma estratégia de análise poderoso para a compreensão de como os determinantes de proteínas distintas da cromatina interagir e sinergizam para estabelecer configurações estruturais e funcionais específicas para um local.

Imunoprecipitação da cromatina é uma técnica poderosa usada para perfilar a localização de uma proteína ou de uma modificação da histona ao longo do genoma. Em um equivalente proteômica, chip é seguido por proteômica baseados em MS para identificar qualitativa e quantitativamente os hPTMs, variantes de histonas e proteínas de ligação da cromatina que são imuno juntamente com a modificação ou a proteína de interesse, usado como &quot;isca&quot;. Na abordagem de N-ChroP, descrito na Figura 1A, ChIP nativa...

Ao combinar nativa e reticulação da cromatina imunoprecipitação com alta resolução de Espectrometria de Massa, ChroP abordagem permite a dissecar a arquitectura proteómica composto de histonas modificações, variantes e proteínas não-histonic sinergia na cromatina domínios funcionalmente distintos.

A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar a composição proteômica de domínios cromatínicos funcionalmente distintos, a fim de compreender como os diferentes elementos atuam em sinergia para determinar o estado transcripcional. Isso é realizado primeiramente preparando núcleos de células cultivadas e digerindo a cromatina em fragmentos de comprimento ideal por meio de métodos enzimáticos ou mecânicos. O segundo passo consiste em purificar um domínio funcional distinto da cromatina total por imunoprecuperação, utilizando anticorpos direcionados contra uma modificação pós-traducional da histona ou contra uma proteína conhecida por marcar especificamente a região de interesse.Em seguida, as proteínas de cromatina imunopurificadas são separadas por eletroforese SDS-PAGE e digeridas diretamente no gel antes da espectrometria de massa. O próximo passo consiste na análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa em um instrumento de alta resolução. Por fim, os dados brutos de espectrometria de massa são analisados por meio de software específico, seguidos de inspeção manual dos espectros para identificar e quantificar modificações de histonas e proteínas coenriquecidas, com base, respectivamente, no cálculo da abundância relativa no material imunoprecipitado em relação à entrada ou na razão SLAC e em experimentos de competição utilizando peptídeos solúveis como competidores da isca. Através do Crop, podemos obter informações sobre as interações entre os padrões e variações de modificações de histonas e as proteínas recrutadas para regiões cromatínicas específicas e as interações nucleares resultantes, que atuam de maneira coordenada.Para definir uma paisagem de cromatina específica com efeito regulatório sobre a expressão gênica, a principal vantagem do crop em relação aos métodos existentes baseados em triagem in vitro para interações solúveis ou modificações histoquímicas, como o ensaio de precipitação, é a possibilidade de investigar a composição de cromatina em locos específicos em condições mais nativas e menos artificiais, utilizando peptídeos de histonas ou modelos de cromatina reconstituídos. A aplicação do crop também pode ser estendida a outros sistemas modelo ou a estudos dependentes do tempo.Por exemplo, podemos usar a cultura em uma linhagem celular que responde a determinada perturbação que desencadeia uma resposta transcricional global. Monica Sodi demonstrará este procedimento. Um pós-doutorado no meu laboratório, Núcleos para o procedimento do chip N são preparados a partir de amostras não marcadas.Células He A S3 utilizam de um a dois vezes 10 à oitava células por experimento. Para colher as células, prepare quatro alíquotas de cinco vezes 10 à sétima células em tubos de 50 mililitros e centrifugue a 340 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Lave as células com PBS gelado, descarte o sobrenadante e ressus.Suspenda cada pellet celular em oito mililitros de tampão de lise e transfira para tubos de 15 mililitros. Incube por 10 minutos a quatro graus Celsius em rotação. Em seguida, despeje cuidadosamente cada lisado celular sobre um colchão de sacarose e centrifugue em rotor de balanço a 3.270 ×g por 20 minutos a quatro graus Celsius para separar os núcleos do citoplasma.Descarte os sobrenatantes e lave os pellets nucleares duas vezes em PBS frio com gelo. No segundo lavagem, use PBS frio. Reúna os núcleos em um único tubo de 50 mililitros após descartar o sobrenatante da segunda lavagem.Resuspenda o pellet nuclear em um mililitro de tampão de digestão. Divida cada amostra em duas alíquotas de 500 microlitros e mantenha em gelo. Adicione a cada alíquota cinco microlitros de MNA, correspondendo a uma concentração final de 0,005 unidades de enzima por microlitro de núcleos.Agite suavemente e incube a 37 graus Celsius por 60 minutos. Adicione EDTA de um milimolar para interromper a reação e mantenha em gelo. Peliculize os núcleos digeridos por centrifugação a 7.800 ×g a quatro graus Celsius por 10 minutos.Transfira os sobrenatantes para dois tubos e armazene a quatro graus Celsius. Esta é a fração S1, que contém a primeira fração solúvel de cromatina composta por mononucleossomos. Resuspenda cuidadosamente os pellets em um mililitro de tampão de diálise e realize a diálise durante a noite a quatro graus Celsius em três litros de tampão de diálise, com agitação suave constante. No dia seguinte, colete o material dialisado e centrifugue a 7.800 ×g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.Transfira o sobrenadante para um novo tubo Eppendorf. Esta é a fração S2, que varia de acordo com os nucleossomos dependendo do grau de digestão da DNase I. Armazene a 4 graus Celsius antes da imunoprecipitação.Verifique a qualidade e a deficiência da digestão de MN a por meio da eletroforese em gel de agarose e inspeção visual da escada de nucleossomos conforme ilustrado neste exemplo; a fração S1 está altamente enriquecida em mononucleossomos, enquanto a fração S2 contém principalmente nucleossomos para imunoprecipitação de cromatina. Primeiro, adicione um volume de tampão de diluição para ChIP à fração S1. Em seguida, adicione o anticorpo contra a modificação pós-traducional da histona ou a proteína de interesse e incube durante a noite em rotação a quatro graus Celsius no dia seguinte.Isole o cromatina utilizando esferas magnéticas acopladas à proteína G. Adicione 100 microlitros de esferas bloqueadas à amostra de cromatina S uma e incube em rotação a quatro graus Celsius durante três horas. Após três horas.Centrifugue a 340 vezes G durante um minuto. Coloque os tubos einor em um suporte magnético para sedimentar as microesferas. Guarde o sobrenadante, que é o fluxo passante contendo nucleossomo não ligado.Adicione tampão de lavagem às esferas e incube por cinco minutos a quatro graus Celsius em rotação antes da centrifugação. Dessa forma, lave as esferas um total de quatro vezes com concentração crescente de sal. Duas lavagens com cloreto de sódio a 75 milimolar, seguidas por uma lavagem com 125 milimolar e outra com 175 milimolar de cloreto de sódio para eluição.O cromatina precipitado com aminoácidos. Incubar as microesferas em 30 microlitros de tampão amostral LDS suplementado com 50 milimolares de dihi. Três etol por cinco minutos a 70 graus Celsius.As proteínas aludidas são subsequentemente separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS para iniciar este procedimento, reticulando as células com formaldeído. Adicione formaldeído 0,75% às células marcadas com SLAC. Misture brevemente e incube por 10 minutos à temperatura ambiente.Fixe o formaldeído adicionando glicina 125 milimolar e incubando por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, divida as células em dois a quatro alíquotas de cerca de cinco vezes 10 à sétima células por alíquota. Enxágue as células três vezes com PBS frio após a última lavagem.Descarte os sobrenadantes e mantenha os pellets; ressuspenda cada pellet celular em 10 mililitros de tampão de lise. Incube por 10 minutos a quatro graus Celsius com rotação; centrifugue a 430 ×g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte os sobrenadantes e mantenha os pellets nucleares.Após lavar os pellets nucleares com o tampão de lavagem Resus, suspender cada pellet nuclear em três mililitros de tampão de incubação para ChIP e manter no gelo para fragmentar a cromatina por sonicação em um bio ruptor refrigerado a 200 watts. Remover 2% da cromatina sonicada e inverter a reticulação por incubação a 65 graus Celsius por um mínimo de uma hora. No tampão de incubação para ChIP.Este é o material de entrada. Posteriormente, o DNA é extraído utilizando um kit de purificação de PCR e a fragmentação da cromatina é avaliada por eletroforese em gel de agarose para imunoprecipitar a cromatina reticulada. Adicione o anticorpo de escolha à cromatina sonificada marcada com leve e pesado.No canal da luz, adicione uma quantidade em excesso do peptídeo solúvel, além da alíquota de anticorpo, às amostras de cadeia leve e pesada, distribuindo cada uma em três tubos microcentrífugos, e incube durante a noite a quatro graus Celsius em rotação. No dia seguinte, adicione 100 microlitros de microesferas magnéticas acopladas à proteína G bloqueadas a cada amostra de cromatina e incube em rotação por três horas a quatro graus Celsius. Centrifugue a 340 ×g por um minuto. Coloque os tubos eppendorf no suporte magnético para sedimentar as microesferas.O sobrenadante é o fluxo que contém nucleossomos não ligados, o qual é guardado para controles subsequentes. Lave as perolas quatro vezes com tampão de lavagem com concentrações crescentes de sal. Duas lavagens com cloreto de sódio a 150 milimolar seguidas por duas lavagens com cloreto de sódio a 300 milimolar.Incube as esferas por 25 minutos a 95 graus Celsius e 30 microlitros de tampão de carga para SDS-PAGE a fim de eluir e desfazer os links cruzados das proteínas imunoprecipitadas. Por fim, reúna os EITs e separe as proteínas por SDS-PAGE antes da espectrometria de massa.As histonas enriquecidas a partir do NIP são digeridas para iniciar este procedimento. Cortam-se fatias do gel correspondentes às bandas de histonas centrais provenientes do gel de acrilamida em gradiente de 4 a 12% BIS CITRIS coradas com kumasi coloidal e, em seguida, descoram-se com acetonitrila a 50% em água destilada desionizada, alternando com acetonitrila a 100% para encolher o gel até que os pedaços de gel estejam completamente descordos. Seque-os em uma centrífuga a vácuo.Adicione anidrido acético na proporção de um para nove volumes por volume em bicarbonato de amônio 1 molar e três microlitros de acetato de sódio como catalisador aos fragmentos de gel. Incube por três horas a 37 graus Celsius com agitação vigorosa. Encolha os fragmentos de gel em acetonitrila 100% e, em seguida, desidrate-os por cerca de cinco minutos em centrífuga a vácuo. Após isso, rehidrate os fragmentos de gel com gelo frio.Solução de tripsina a 100 nanogramas por microlitro em bicarbonato de amônio 50 milimolar durante a noite a 37 graus Celsius. A combinação de modificação química de lisinas utilizando anidrido acético deutério e digestão com tripsina gera um padrão semelhante ao de digestão em gel de histonas, coletando os peptídeos digeridos solúveis em um novo tubo eppendorf e secando os peptídeos por cerca de uma hora. Reconstitua os peptídeos liofilizados em ácido acético 0,5% e ácido trifluoroacético 0,1%, dessale e concentre os peptídeos em uma fase reversa C18 em cartucho de carbono e cromatografia de troca iônica em microcolunas feitas à mão.Carregue 50% dos peptídeos na ponta em forma de sanduíche de carbono C18 e 50% na ponta SCX. Elua os peptídeos das pontas SCX utilizando 5% de hidróxido de amônio, 30% de metanol e das pontas de carbono C18 utilizando 80% de acetonitrila, 0,5% de ácido acético. Por fim, liofilize os peptídeos eluídos e re-suspenda-os em ácido fórmico 0,1% no método nativo de imunoprecipitação de cromatina e abordagem crop. A cromatina é digerida com MNA como primeiro passo para purificar um domínio funcional distinto da cromatina em massa.O painel à esquerda mostra um teste de MNA em pequena escala no qual o DNA é separado em um gel de agarose a 1% após a digestão da cromatina com MNA em diferentes intervalos de tempo. À direita, é mostrada uma digestão de MNA em larga escala. O DNA é separado em um gel de agarose a 1% após 60 minutos de digestão da cromatina com MNA e após a separação da fração S1, contendo mononucleossomos, da fração S2, contendo polinucleossomos.O cromatina digerido e enriquecido em mononucleossomos é incubado com um anticorpo que reconhece uma modificação pós-traducional específica da histona. Por exemplo, a trimetilação da lisina nove na histona H três (K9me3), um marcador de cromatina silenciosa. As proteínas imunopurificadas, bem como a entrada de cromatina, são então separadas por eletroforese SDS-PAGE e a coloração com azul de comassie mostra as histonas centrais H3, H4, H2A e H2B ao redor e abaixo da banda de 17 quilodaltons, com H3 e H2B comigrando. A comparação entre a quantidade de trimetilação da lisina nove em H3 presente no fluxo passante e na entrada indica que cerca de 50% da região de interesse é imunopurificada, excluindo o risco de viés devido ao enriquecimento de uma subpopulação minoritária de cromatina.Este histograma representa a média mais ou menos o erro padrão da média (SEM) de três experimentos independentes para cada modificação. A espectrometria de massas (MS) é então empregada para caracterizar as modificações pós-traducionais coassociadas aos nucleossomos enriquecidos. Todas as modificações pós-traducionais das histonas são verificadas por inspeção manual dos espectros MS correspondentes nesses espectros MS representativos, utilizando fragmentação por dissociação colisional (CID). As séries de íons B e Y permitem a definição da sequência do peptídeo H3.9-17 e a localização da trimetilação no resíduo de lisina 9. A quantificação sem marcador é realizada primeiramente pela construção do cromatograma de íons extraídos (XIC) para cada peptídeo modificado, com base no valor de massa/carga, e pelo cálculo da área sob a curva (AUC) para cada pico.Em seguida, a abundância relativa dos diferentes graus de metilação na lisina nove do peptídeo H três nove a 17 é estimada dividindo-se a AUC de cada peptídeo modificado pela soma das áreas correspondentes a todas as formas não modificadas e modificadas observadas desse peptídeo. Em terceiro lugar, o enriquecimento relativo de cada modificação no material imunoprecipitado é expresso como uma razão log dois entre a abundância relativa de cada metilação no peptídeo imunoprecipitado e a amostra de entrada. A análise do peptídeo H três nove a 17 mostra o enriquecimento das formas dimetilada e trimetilada na lisina nove, com a correspondente diminuição das formas não modificada e monometilada.Com esses resultados como controle positivo para a especificidade do anticorpo, a associação ou o esgotamento de todas as demais modificações pode ser avaliado tanto no nível intramolecular no mesmo H três quanto no nível intermolecular em outras histonas enriquecidas em coen no mesmo nucleossomo. Este mapa térmico representativo resume o enriquecimento de todas as H ptms associadas a cos identificadas nas histonas H três, H quatro e H dois A. Cada linha corresponde a uma modificação distinta e ND indica modificações não detectadas para triagem de todas as proteínas. A associação coexistente dentro do chip de heterocromatina de cromatina reticulada e fragmentada por sonicação é utilizada em combinação com marcação por isótopos estáveis de aminoácidos em cultura celular ou lac.Primeiro, a eficiência da marcação é avaliada calculando a incorporação de lisina pesada e arginina pesada nas proteínas. Para uma quantificação precisa das proteínas, é necessária uma incorporação superior a 95% para ambos os aminoácidos pesados, como observado aqui, sendo a mediana da distribuição de densidade de peptídeos de lisina e arginina igual a 0,974 e 0,964, respectivamente. Segundo, a proporção entre peptídeo solúvel e anticorpo deve ser otimizada.Esta figura mostra um espectro de massas ampliado no valor correspondente da relação massa/carga da trimetilação da lisina nove com carga dupla positiva (K9me3) no peptídeo H3 9-17, tanto para as formas leve e pesada nas amostras de entrada e imunoprecipitadas com OCTR. Enquanto na entrada as intensidades dos peptídeos pesado e leve são próximas a um, no chip SLAC direcional a intensidade do peptídeo leve é muito menor do que a do peptídeo pesado, indicando assim uma competição eficiente.Um resultado representativo de uma eletroforese SDS-PAGE de cromatina marcada com isótopos leve L e pesado H, usada como entrada e material co-imunoprecipitado (ChIP), é mostrado aqui. A faixa correspondente ao material ChIP foi cortada em 10 fatias, enquanto apenas duas fatias da entrada foram analisadas. Para a análise de incorporação, os experimentos de competição SLAC são tipicamente realizados em duplicata, em formatos chamados direto e reverso, nos quais a competição com o peptídeo solúvel em excesso é alternada das amostras de cromatina pesada H para as amostras leve L.Este espectro completo representativo mostra o par SLAC correspondente a peptídeos das proteínas HP um e macro dois A, com uma razão de proteína pesada para leve maior que um. No experimento direto, refletido por uma razão menor que um na réplica reversa, demonstra-se o enriquecimento específico dessas proteínas em proteínas de heterocromatina, cuja intensidade nas formas pesada e leve é semelhante tanto no experimento direto quanto no reverso, produzindo uma razão constante próxima a um, sendo classificadas como fundo. A intersecção dos experimentos X chipp direto e reverso leva à identificação de 635 proteínas presentes em ambos os experimentos e quantificadas com pelo menos duas contagens de razão.O gráfico log dois das suas razões entre pesado e leve representa o chamado cromossomo hetero. As linhas pontilhadas vermelhas neste gráfico de dispersão representam os 40% e 30% superiores das razões proteicas. Como indicado, os interatores genuínos de lisina nove trimetilada são claramente identificados como as proteínas presentes nos 40% superiores das distribuições de razão proteica.Aqui, as distribuições das proporções proteicas dos experimentos de entrada com corte direto e reverso de X são mostradas em preto, azul e laranja, respectivamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar a cromatina para E e corte final para processar as proteínas previamente imunoprecipitadas antes da análise por espectrometria de massas, como identificar e quantificar modificações de histonas em espectros de massas e como definir uma interação específica com base nas suas proporções proteicas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Cromatina Análise de Interação por Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) é um método...

Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição

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Análise quantitativa de proteomas cromatina na Doença

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O isolamento de regiões específicas genômico e identificação de moléculas pela Associated enChIP

Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP-sequenciamento da elevado-produção otimizado e pipeline de análises computacionais para a determinação de padrões de estado todo o genoma da cromatina de tecidos de tumor congelado e linhas celulares.

Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor

Este é um método para identificar novas proteínas DNA-interagindo em loci de destino específico, baseando-se na captura de sequência-específicos da cromatina de quitosana para análises subsequentes proteomic. Nenhum conhecimento prévio sobre potenciais proteínas obrigatórias, nem modificações de célula são necessários. Inicialmente desenvolvido para o fermento, a tecnologia agora foi adaptada para células de mamíferos.

Adaptação da hibridação capturar de proteínas da cromatina associada para proteômica para células de mamíferos

Descreveremos um protocolo passo a passo para cromatina em tandem da imunoprecipitação sequenciamento (tChIP-Seq) que permite a análise da modificação do histone todo o genoma de célula tipo-específicas.

TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

CUT&amp;RUN e suas variantes podem ser usadas para determinar a ocupação de proteínas na cromatina. Este protocolo descreve como determinar a localização da proteína na cromatina usando uliCUT&amp;RUN unicelular.

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Decifrando a organização da cromatina 3D de alta resolução via captura Hi-C

A expressão gênica é regulada por interações de promotores gênicos com elementos regulatórios distais. Aqui, descrevemos como a baixa entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite a identificação dessas interações em tipos celulares raros, que antes eram imensuráveis.

Um fluxo de trabalho integrado para estudar a arquitetura do genoma espaço-temporal centrada no promotor em populações celulares escassas

Apresentamos um protocolo de microscopia de localização de molécula única em três cores (SMLM) que permite o mapeamento reprodutível de eucromatina, heterocromatina e RNAP II para análise espacial. Esse protocolo permite a marcação eficiente de multicor em ambientes nucleares densos, incluindo alvos associados à cromatina, possibilitando detecção simultânea e confiável.

Um Protocolo de Microscopia de Localização de Molécula Única Multirótulo para Investigação da Cromatina em Ambiente Nuclear Denso

Aprenda a abordagem ChroP para analisar a composição proteômica de domínios cromatínicos específicos usando imunoprecipitação e espectrometria de massa. Este método revela interações entre modificações de histonas e proteínas associadas.

A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina

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