Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

O objetivo geral deste procedimento é a geração simultânea de culturas de células precursoras neurais como monocamadas aderentes ou neuroesferas da zona subventricular e giro dentado de camundongos adultos individuais. Isso é feito removendo primeiro o cérebro de camundongos adultos individuais. O segundo passo é microdissecar a zona subventricular e as regiões do giro denteado.

Em seguida, o tecido é dissociado em uma única suspensão celular. A etapa final é cultivar as células precursoras como monocamadas aderentes ou neuroesferas. Em última análise, o ensaio da esfera neurosférica e o sistema de cultura de monocamada aderente são ferramentas valiosas para determinar o potencial de proliferação ou diferenciação em células-tronco neurais adultas.

In vitro, Este método nos permite abordar algumas questões muito interessantes no campo da neurogênese adulta. Com ele, podemos olhar para células de animais individuais e compará-las, e isso é de interesse no contexto de observar diferenças individuais ou, por exemplo, diferenças entre transgênicos individuais ou máscaras knockout em comparação com seus controles. Tara Walker, cientista sênior do meu grupo, apresentaria esse método antes da dissecção cerebral.

Prepare as pipetas polidas com javalis médios e pequenos, girando as pipetas de pasto de vidro em uma chama até que as bordas fiquem arredondadas. Em seguida, esterilize-os em uma autoclave. Primeiro, transfira o cérebro para uma placa de Petri de plástico de 10 centímetros contendo PBS.

Coloque uma placa de Petri com o cérebro sob um microscópio de dissecação em baixa ampliação com o cérebro posicionado em sua superfície ventral. Em seguida, use a pinça curva fina para remover os bulbos olfatórios enquanto segura o cerebelo. Em seguida, gire o cérebro para o aspecto dorsal.

Faça um corte coronal no cérebro ao nível do quiasma óptico com um bisturi para microdisectar a SVZ. Coloque a porção rostral do cérebro contra o prato de modo que a superfície coronal cortada fique voltada para cima. Sob uma ampliação maior, remova e descarte o septo.

Em seguida, disseque a SVZ, que é uma fina camada de tecido ao redor do ventrículo, colocando a ponta de uma lâmina da pinça curva fina no canto lateral do ventrículo lateral. Imediatamente abaixo do corpo caloso e da outra lâmina, aproximadamente um milímetro no tecido imediatamente adjacente ao ventrículo. Pressione a pinça em direção à base do prato e em direção ao aspecto ventral do ventrículo para remover um pequeno pedaço triangular de tecido.

Depois disso, coloque a SVZ dissecada em uma placa de Petri no gelo para microdisectar o local DEG, a porção mimada do cérebro na placa de Petri e corte ao longo da fissura longitudinal usando um bisturi sob um microscópio de dissecação. Remova o cerebelo e o corante céfalo. Reoriente o microscópio para que as bordas ao redor do DG fiquem visíveis.

Para remover o dg, insira a ponta de uma agulha de calibre 27 e deslize ao longo da borda entre o DG e a buzina de amém. Em seguida, liberte o DG do tecido circundante usando a pinça fina para dissociação do tecido SVZ. Pique o tecido usando uma lâmina de bisturi por um minuto até que não haja mais pedaços grandes.

Então resus. Suspenda o tecido picado com um mililitro de pré-aquecimento 0,05% de viagens em EDTA. Em seguida, transfira para um tubo de 15 mililitros e incubado por sete minutos em banho-maria ajustado para 37 graus Celsius.

Para interromper a reação enzimática, adicione um mililitro de inibidor de tripsina contendo cisne de DNA e misture o conteúdo sacudindo o tubo. Em seguida, pellet a suspensão por centrifugação a 300 Gs por cinco minutos e uma cicatriz. O sennett depois ressuspende os pellets em um mililitro de meio de crescimento e associado por gly.

Pipetagem para cima e para baixo aproximadamente sete a 10 vezes usando uma pipeta P 1000. Em seguida, adicione o meio de crescimento a um volume total de cinco mililitros e passe a suspensão celular por uma peneira de 40 micrômetros para remover detritos e aglomerados de tecido não associados. Em seguida, centrifugar a 300 Gs durante cinco minutos.

Descarte o supinado e reus. Suspenda o pellet resultante em 200 microlitros de meio de crescimento para dissociação do tecido DG. Pique o tecido usando uma lâmina de bisturi por aproximadamente um minuto até que não haja pedaços grandes.

Em seguida, transfira o tecido picado para a mistura de enzimas PDD pré-aquecidas. Incube por 20 minutos a 37 graus Celsius e misture invertendo o tubo a cada três a cinco minutos. Em seguida, dissocie o tecido mecanicamente pipetando-o para cima e para baixo suavemente 10 vezes usando uma pipeta de pastagem polida a fogo de calibre médio, depois incubado por mais 10 minutos a 37 graus Celsius e misture sacudindo o tubo a cada três a cinco minutos. Além disso.

Dissocie o tecido mecanicamente, pipetando-o para cima e para baixo suavemente 10 vezes usando uma pequena pipeta de pastagem polida a fogo de javali. Em seguida, centrifugar a 130 gs durante cinco minutos. Em seguida, remover o supinato e ressuspender o pellet em um mililitro de solução tampão.

Completar o volume com a solução-tampão até 10 ml. Após centrifugação a 130 GS por cinco minutos. Remova o sobrenadante S e ressuspenda o pellet em cinco mililitros de 20% por chamada.

Em seguida, centrifugue a 450 GS por 15 minutos. Remova o snat e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de buffer. Finalmente, centrifugue a 130 GS por cinco minutos e ressuspenda o pellet em 200 microlitros de meio de crescimento para culturas aderentes, coloque 200 microlitros de células em cada poço de uma placa de 96 poços revestida com PDL Lamin ENC para culturas de esfe, dilua-a com crescimento, médio a 20 mililitros e placa de 200 microlitros por poço sobre uma placa de 96 poços não revestida, em seguida, incube a 37 graus Celsius com 5% de CO2 após seis a 12 os dias contam e medem o diâmetro das neuroesferas usando um gradi IP instalado em um microscópio de luz vertical.

Esta figura mostra que as células precursoras de camundongos adultos podem ser cultivadas como culturas de monocamada aderentes ou como neuroesferas na SVZ e dg. Significativamente mais neuroesferas são geradas a partir da SVZ em comparação com a DG de camundongos individuais e as células precursoras da SVZ e DG também respondem de maneira diferente à despolarização in vitro para confirmar a potenciação a longo prazo. As neuroesferas são mostradas como tendo se expandido por 10 passagens.

As neuroesferas podem ser diferenciadas em neurônios beta três tubulinas positivas, como mostrado em vermelho GFAP positivo astrócitos em verde, O quatro oligodendrócitos positivos em vermelho e mapear dois neurônios AB positivos em vermelho Seguindo este procedimento. Outros métodos, como empacotamento das células ou neuroesferas ao longo de várias gerações ou diferenciação das neuroesferas seguida de análise histológica, podem ser realizados. Isso ajudará a responder a outras perguntas, como multipotencialidade e potencial de longo prazo.