Um método de monitoramento acessível HIV-1 Resistência às Drogas para recursos configurações limitadas

A resistência aos medicamentos contra o HIV tem o potencial de inviabilizar o progresso feito nos esforços para controlar a epidemia de HIV. Portanto, é importante pesquisar e monitorar continuamente a resistência aos medicamentos em pacientes virgens e pacientes que falham na terapia. Infelizmente, a maioria dos métodos atualmente usados é cara para implementar, especialmente no contexto da magnitude da epidemia de HIV na África Subsaariana.

Aqui demonstramos um método de baixo custo e acesso aberto para a genotipagem da resistência aos medicamentos para o HIV. Este protocolo é dividido em quatro etapas. Extração de RNA, a melhor transcrição e sequenciamento por PCR e bioinformática.

H-I-V-R-N-A é extraído usando o kit de RNA viral KaiGen. O método usa colunas para capturar e limpar precipitados. O RNA nesta fase sempre inclui controles positivos e negativos.

Antes de começar, calcule os volumes de cada uma das regiões necessárias. Para o número de amostras que estão sendo processadas, é recomendável sempre adicionar um controle de região. Além dos controles positivos e negativos extraídos, prepare a mistura de primer DNTP adicionando 0,5 microlitros do primer RT 21 e 0,5 microlitros da mistura DNTP a um tubo de PCR estéril limpo de 200 microlitros, seguido brevemente.

Para tributar, prepare a mistura de enzimas adicionando um microlitro do tampão de 10 vezes, um microlitro de 3,1 molar DTT e dois microlitros de 25 milimolares. Cloreto de magnésio ao tubo estéril adiciona 0,5 microlitros de cada uma das enzimas, RNAs out e s script. Três, transcrições reversas para o tubo de mistura de enzimas, seguidas por uma mistura suave.

Mantenha os tubos com misturas de primer dent p e mistura de enzimas em um bloco de código e mova para os estações de RNA do RNA para o tubo de mistura prima DNTP. Após a adição do RNA, vá para a sala de PCR com todos os tubos em um bloco de cartão e refúgio da mistura de RNA primário DNTP e coloque-os em um termociclador de calor. Exclua cinco graus Celsius por cinco minutos e resfrie rapidamente para quatro graus Celsius.

Segure por dois minutos. Pause o termociclador enquanto dois a quatro graus Celsius. Retire os tubos e adicione cinco microlitros da mistura enzimática, mantendo os tubos em uma mistura de bloco de código suavemente, seguida de centrifugação breve e retorno ao termociclador.

Mantenha os tubos a 50 graus Celsius por 60 minutos, seguidos por oito cinco graus Celsius por cinco minutos. Resfrie a 37 graus Celsius. E faça uma pausa assim que atingir essa temperatura.

Retire os tubos do termociclador rapidamente. Adicione cinco microlitros de borda de RNAs aos tubos e retorne o ciclo térmico. Mantenha 37 graus Celsius por 20 minutos e, em seguida, codifique quatro graus Celsius antes de começar.

Calcule os volumes de cada uma das regiões necessárias com o número de amostras que estão sendo processadas e os controles, além dos três controles, positivo, negativo e o reagente. Você também pode adicionar um controle de PCR na primeira e na segunda rodada. As misturas de PCR podem ser preparadas simultaneamente e a segunda mistura principal.

Terceiro, em fontes de grau de crédito negativo até que seja necessário. As misturas podem ser armazenadas por até oito horas. Adicione a água 10 vezes tampão, cloreto de magnésio, DTPs e primers na boca mostrada na tabela.

E vórtice. Adicione 0,1 microlitros de polimerase de platina e misture suavemente os 23 microlitros da mistura principal com os tubos de PCR de 200 microlitros com os tubos da mistura principal em um bloco de cordão. Vá para a sala de PCR.

Adicione dois microlitros do CDNA a 23 microlitros da primeira rodada de mistura principal de PCR. Feche os tubos, coloque as amostras no termociclador e execute o programa de PCR continuado. Estágio de PCR da segunda rodada ou armazene os produtos de PCR da primeira rodada a menos 20 graus Celsius ou mais frios até que seja necessário.

Para PCR de segunda rodada, adicione dois microlitros do produto de PCR de primeira rodada a 23 microlitros da mistura master de PCR de segunda rodada e use o mesmo programa de PCR para avaliar a amplificação de PCR. Realize eletroforese de 1% a 800 volts e 400 palavras por 40 minutos. A amplificação positiva pode ser visualizada como uma base de 1.315 por fragmento.

Não deve haver amplificação nos controlos negativo e reagente em preparação para a reacção de sequenciação. Os produtos de PCR positivos da segunda rodada são limpos. Usando o kit de purificação de PCR de link puro, adicione 80 microlitros de tampão de ligação a 20 microlitros de produto PCR e misture a pipeta.

Adicione a amostra misturada com o buffer de dobra a uma coluna de rotação de link puro em um tubo de coleta. Centrifugar a coluna a 10 000 RCF durante um minuto. Transfira a coluna para um novo tubo de coleta.

Lave a coluna com 650 microlitros de centrífuga tampão de lavagem. A coluna em 10.000 r economiza por um minuto. Transfira a coluna para um novo tubo de coleta.

F a coluna, sua velocidade máxima por dois a três minutos. Coloque uma coluna de centrifugação em um tubo eluciano limpo de 1,7 mililitro. Adicione 40 microlitros de tampão eluciano ao centro da coluna e incube a coluna em temperatura ambiente por um minuto.

Centrifugue a coluna na velocidade máxima por dois a três minutos. O tubo eluciano contém seu produto de PCR purificado pronto para sequenciamento. Descarte a coluna.

Os produtos de PCR são sequenciados usando o kit de terminador big D versão 3.1 e quatro primers para cada amostra para cada um dos primers. Configure as reações de sequenciamento conforme indicado na tabela. Misture suavemente a mistura master invadindo os tubos mais cedo.

Pegou nove microlitros da mistura master para uma placa de roda de 96. Uma placa executará 24 amostras. Você pode usar o layout abaixo, no qual cada coluna acomoda duas amostras e um microlitro da amostra de DNA.

Cubra a placa e misture delicadamente a centrífuga em 3000 RCF por um minuto. Coloque a placa no termociclador e execute o programa de ciclagem onde a PCR termina. Limpe o produto de sequenciamento imediatamente.

Os subprodutos das reações de sequenciamento, bem como o excesso de contaminantes, podem interferir na eletroforese de sequenciamento. Portanto, é importante limpar os produtos de sequenciamento para remover qualquer excesso de premissa e sais e enzimas de terminadores d incorporados antes de carregar as amostras para eletroforese automatizada de sequenciamento de DNA fluorescente. O método usado aqui é um protocolo simples de etanol sódico ASCE para cada reação de sequenciamento produz 50 microlitros de etanol absoluto e cinco microlitros de ácido sódico de três molares.

Usando um multicanal preparado, adicione cinco microlitros de solução de etanol ácido de sódio a cada um. Vede bem os poços com folha adesiva, garantindo que cada poço seja costurado corretamente e vórtice para misturar a centrífuga a 3000 RCF por 20 minutos. Após 20 minutos, remova a tampa e, em um movimento suave, invada a placa em um lenço dianteiro.

Fuge a placa invertida a 150 RC por dois minutos, adicione imediatamente 150 microlitros de etanol de código para não atrasar a adição de etanol nesta etapa, sele com a mesma tampa de folha adesiva e centrífuga de vórtice a 3000 RCF por cinco minutos. Inverta sobre o reparo de quimioterapia dobrado e centrifugue a placa invertida a 150 RCF por um minuto após o local de ificação descoberto em um termociclador e seque-o a 50 graus Celsius. Depois de seco, sele o local com tampas adesivas, embrulhe em papel alumínio e guarde-o a menos 20 graus Celsius e até que esteja pronto para prosseguir com a eletroforese sequencial.

Quando estiver pronto para sequenciar, dissolver a desnaturação da amida e carregar no analisador genético 31 30 para eletroforese. Inicie o gênio do programa. Crie uma pasta de trabalho dentro dos documentos locais para armazenar as sequências.

Importe os arquivos A BF gerados pela máquina de sequenciamento para a pasta de trabalho genial. Usando a ferramenta de importação, o gênio alocará pontuações de qualidade percentuais para cada sequência Sequências abertas importadas com pontuações de qualidade superiores a 70%Ao clicar duas vezes nelas, cada arquivo deve abrir em uma nova janela. O Genius indicará a qualidade de cada posição de nucleotídeo da sequência usando zumbido azul claro.

Quanto mais alta a barra, melhor a qualidade da melhor pontuação. Usando seu er, selecione a seção intermediária da sequência deixando de fora as extremidades. Clique no botão extrair para extrair a região com sequência de alta qualidade.

Selecione todas as quatro sequências extraídas para cada amostra e monte-as em uma sequência de referência anotada. Inspecione a sequência montada para garantir que você esteja no quadro de leitura correto. Se você estiver no quadro de leitura correto, o início da protease do subtipo c deve começar com o seguinte. Amém.

Ácidos P-Q-I-L-W-T. O início do RT começará com o extrato P-I-S-P-I-A da região CONT que cobre o início do 300º cordão RT. Durante esse processo, verifique também se há inserções ou exclusões.

Percorra a sequência de consenso dos contos extraídos, identificando quaisquer ambiguidades e verifique as posições com bases mistas, inspecionando as alturas de simetria de qualidade, o fundo e os ombros das regiões flanqueadoras da base. Selecione a sequência de consenso e clique no botão extrair para criar um arquivo separado da sequência de consenso gerada a partir das quatro premissas e rotulá-lo adequadamente. Exponha a seqüência a uma pasta de armazenamento de backup no computador ou na rede.

Analise as sequências usando o program@hivdb.stanford.edu H HIV V DB. Verifique se há exclusões e em Sessões nos dados do ARI nele. A sequência cobre todos os 99 códigos de protesto na fase 300 códigos RT.

Verifique se há problemas de controle de qualidade destacados em ambos os protestos nas regiões RT, como códigos principais, deslocamentos de quadro, posições ambíguas e resíduos incomuns, além da nova sequência em um banco de dados Sequence local de execuções anteriores. Se a nova sequência for maior que 97% semelhante a qualquer sequência no banco de dados, todos os estágios do protocolo deverão ser revisados. Começando com a análise de sequência, voltando à extração de RNA para garantir que não houvesse mistura ou contaminação.

Se nenhum problema for identificado, sequencie novamente as amostras antigas e novas se as sequências ainda forem maiores que 97% semelhantes. Revise o histórico do paciente para avaliar qualquer ligação epidemiológica entre os pacientes. Esta também é outra ferramenta de qualidade empregada para identificar a contaminação.

Mistura simples ou amostras de pacientes epidemiológicos vinculados. Alinhe todas as sequências do banco de dados usando o programa Cluster W. O Ingenious verifica manualmente o alinhamento em busca de sequências desalinhadas, exclusões e em sessões e edita de acordo.

Construa uma árvore filogenética usando o Genius three builder ou outros construtores de árvores engenhosos. Examine a árvore em busca de amostras com comprimento de ramo curto. Revise as amostras com comprimento de ramificação curto para Possível contaminação.

Faça login no banco de dados REGAR usando um nome de usuário e senha exclusivos no menu suspenso. Em ID do paciente.Selecione começa com o ID do paciente e selecione o paciente cuja sequência deve ser aplaudida no menu. Para selecionar com o botão direito isolado viral nas opções em viral, selecione adicionar.

Insira as datas da amostra, a ID da amostra, a ID da sequência e a data de sequenciamento. Selecione escolher arquivo e navegue até o arquivo mais rápido a ser aplaudido. Após selecionar o arquivo mais rápido a ser aplaudido, clique em aplaudir.

Quando a sequência aplaudida aparecer na caixa CLE, clique no botão ok no canto inferior direito da janela. Verifique se há produtos em rt. Alinhamentos de pote clicando em proteína e selecionando PR ou rt.

Verifique as mutações de resistência a medicamentos usando o padrão de resistência. Isso fornece os perfis de resistência de três algoritmos, A NRS, Stanford, HIV DB e rega db. Clique na guia de relatórios de isolamento viral.

Selecione os algoritmos para a interpretação do genótipo e os modelos de relatórios a serem usados. Depois que o algoritmo e o modelo forem selecionados, clique em genéricos. Baixe o documento RTF gerado.

Abra o documento RTF como um documento do Word. Recite o gráfico do histórico de tratamento após o gráfico, A, a seção Gráfico clínico e interpretação da resistência. Adicione uma descrição do histórico de tratamento do paciente e o perfil de resistência viral.

Além disso, adicione uma descrição da carga viral do paciente e os perfis do CD quatro. Envie o relatório para adicionar o especialista para revisão e recomendações sobre o gerenciamento futuro do paciente. A redução do custo global deste protocolo foi alcançada através de quatro estratégias diferentes.

O primeiro foi reduzir os volumes de reação em quase todos os estágios, permitindo assim um uso mais eficiente dos reagentes, mas ao mesmo tempo mantendo a qualidade da sequência. Em segundo lugar, redução dos primers de sequenciamento. A maioria dos protocolos usa de seis a oito primers para sequenciar a região pobre que cobre o gene da proteína no primeiro terço do gene do transcrito reverso, um conjunto de quatro primers ou selecionados para sequenciar a mesma região sem comprometer a qualidade da sequência final, reduzindo assim o estágio de sequenciamento causado por pelo menos um terço.

Em terceiro lugar, o uso de software e programas de acesso aberto principalmente gratuitos para análise de habilidades e geração de relatórios permitiu uma redução adicional no custo. E, por último, negociação coletiva e parcerias público-privadas. Foi negociado um preço com desconto que permite que os membros da Rede de Tratamento e Resistência da África Austral obtenham taxas com desconto para todos os componentes deste protocolo.

Estes também se preocuparam com um kit para seu acesso.