Pinças magnéticas para a Medição do Twist and Torque

O objetivo geral deste experimento é medir diretamente as tensões de torção ou mudanças na torção das moléculas de DNA de fita dupla no nível de molécula única. Isso é feito usando dois ensaios no primeiro ensaio chamados pinças magnéticas de órbita livre ou batidas. Uma única molécula de DNA funcionalizada é amarrada entre um grânulo magnético e uma superfície de vidro.

Enquanto um ímã de formato cilíndrico exerce uma força que estica o DNA Nesta configuração, a posição angular dos grânulos é restrita apenas pelo DNA amarrado, não pelo ímã, permitindo a rotação do grânulo, conforme mostrado pela seta vermelha, para relatar mudanças na torção do DNA que as flutuações térmicas rotacionais do grânulo causam. Sua posição XY está em Um anel circular ou rosquinha. A conversão desta posição XY em ângulo de rotação torna possível monitorar as mudanças na torção do DNA amarrado em um segundo ensaio relacionado chamado pinça de torque magnético, ou o ímã lateral MTTA é adicionado ao ímã cilíndrico principal para restringir o movimento angular dos grânulos.

Com esta configuração de ímã, torques externos podem ser aplicados à molécula de DNA amarrada por meio de rotação simples do conjunto magnético, medições do desvio da posição angular dos grânulos após a aplicação de várias voltas em comparação com sua configuração inicial de relaxamento de torção, juntamente com a calibração da rigidez da armadilha magnética que confina os grânulos, O movimento angular torna possível quantificar o acúmulo de torque no DNA. A principal vantagem de usar fonte e MTT em relação às pinças magnéticas convencionais é que podemos medir diretamente o torque e as mudanças na torção dos ácidos nucléicos. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a mecânica do DNA e do RNA, permitindo-nos mapear suas respostas a forças e torques externos.

As implicações dessa técnica se estendem à sondagem das interações do DNA com proteínas. Por exemplo, proteínas responsáveis pelo armazenamento de reparo de DNA ou transcrição A demonstração visual desse método ilustra a facilidade com que uma pinça magnética convencional pode ser modificada para fornecer novas capacidades. A configuração usada para os experimentos a seguir é baseada em uma configuração convencional de pinças magnéticas.

Em seu centro está uma célula de fluxo iluminada por cima por um LED e fotografada através de uma objetiva de microscópio e câmera CCD por baixo. Acima da célula de fluxo há uma cabeça magnética que pode ser movida para cima e para baixo e girada usando motores controlados por computador. As imagens da câmera CCD são analisadas em tempo real por software de visualização de laboratório personalizado para determinar a posição X, Y e Z das esferas de DNA amarradas.

O software de visualização de laboratório personalizado está disponível com os autores mediante solicitação. Depois de preparar uma célula de fluxo com esferas magnéticas amarradas ao DNA, montá-la nas pinças magnéticas convencionais e selecionar uma superfície imobilizada para fazer referência ao grânulo e um grânulo ao qual uma molécula de DNA individual do comprimento adequado é amarrada. A configuração pode ser convertida para o modo de fonte.

Comece desaparafusando manualmente a cabeça do ímã completa que segura o ímã para a configuração de pinça convencional. Substitua-o pela cabeça do ímã que contém um ímã cilíndrico para a fonte. Ao colocar o ímã cilíndrico usado para F na cabeça do ímã, certifique-se de manter a corda de DNA selecionada dentro do campo de visão.

O aspecto mais difícil deste procedimento é alinhar corretamente os ímãs para a geometria da forma. Um bom alinhamento é alcançado movendo sistematicamente os ímãs e testando o alinhamento após cada etapa, o que demonstraremos. Agora, execute um alinhamento de curso do ímã na fonte usando os estágios de posição para mover manualmente os ímãs no software de visualização de laboratório.

Clique no botão de gravação para medir as flutuações ou excursões da posição XY. Os traços gravados são exibidos na tela em tempo real e salvos como arquivos de texto que contêm as informações de posição X, Y, Z. Se as excursões XY seguirem um arco como mostrado aqui, o ímã cilíndrico não estiver alinhado corretamente, continue movendo o ímã cilíndrico na direção apropriada e fazendo medições até que as flutuações XY tracem um padrão circular completo, o que indica que o alinhamento do curso foi alcançado. Próximo.

Se necessário para outros experimentos, execute um alinhamento fino na fonte usando um estágio automatizado de alta resolução para mover a célula de fluxo, alinhando o ímã cilíndrico a cerca de 10 mícrons do cordão. Então, como antes, registre as excursões XY. Continue movendo o palco e registrando excursões até que as flutuações no anel circular sejam quase uniformes.

Para verificar o alinhamento final, use um script MATLAB que está disponível nos autores mediante solicitação para plotar as flutuações em um histograma ou termograma e inspecioná-lo quanto à uniformidade. Para fazer medições de torque de DNA, remova o ímã cilíndrico usado para a fonte e substitua-o por um ímã cilíndrico e um ímã lateral permanente. Para o MTT, certifique-se de que a corda de DNA selecionada permaneça dentro do campo de visão.

Insira o número e a taxa de voltas magnéticas no painel correspondente do software de visualização do laboratório de controle. Aqui. O número de voltas é definido como cinco e a taxa é definida como 0,1 hertz. Isso fará com que os ímãs girem lentamente durante a medição.

Em seguida, no matlab, use um script de rastreamento angular baseado no monitoramento da posição XY, que está disponível no autor mediante solicitação. Um gráfico que exibe as flutuações angulares em função do tempo, theta T aparecerá. Depois que tudo estiver configurado na visualização de laboratório, clique no botão de gravação.

Os traços aparecerão em tempo real como antes. No matlab, use o script MATLAB para produzir gráficos de ângulo T e traçado de altura do cordão Z de T na tela com um ajuste gaussiano ao sinal de ângulo para determinar o desvio padrão das flutuações angulares. Sigma.

Este script determina diretamente a rigidez da armadilha de torção a partir da variação das flutuações angulares. Sigma ao quadrado em radianos. Usando a fórmula mostrada aqui, observe que é típico no MTT atingir uma rigidez de armadilha rotacional de 10 a 1000 pico newton nanômetro por radiano, que é muito menor do que nas pinças magnéticas convencionais.

Aqui, por exemplo, determinamos que a rigidez da armadilha rotacional é de cerca de 52 nanômetros por radiano. A rigidez rotacional das pinças de torque magnético em comparação com as pinças magnéticas convencionais as torna adequadas para medições de torque de molécula única, mas também significa que o torque máximo que pode ser exercido é reduzido. Isso implica que o MTT não pode contrabalançar os torques de arrasto causados pela rotação rápida.

Portanto, deve-se tomar cuidado para não girar muito rápido. Normalmente giramos a taxas de cerca de 0,1 hertz. Em seguida, a corda de DNA é sobrecarregada girando lentamente os ímãs, um determinado número de voltas e, registrando outro traço de flutuações angulares, o número e a taxa de voltas do ímã são novamente inseridos no painel correspondente do software de visualização de laboratório de controle.

Aqui, o número de voltas é definido como 40 e a taxa é definida como 0,1 hertz. Isso fará com que os ímãs girem lentamente durante a medição para determinar o torque acumulado na corda de ácido nucleico. Após N voltas, usamos a fórmula mostrada aqui, onde os colchetes angulares denotam a média e zero.

E N são o ângulo em zero voltas correspondente a uma corda e voltas relaxadas em torção, respectivamente. Repita as etapas em que os ímãs são girados e registre um platô de flutuações angulares conforme necessário para determinar completamente a resposta de toque de uma molécula em uma única corrida de medição. Para medir as mudanças na torção do DNA induzida pela proteína de reparo RAD 51, cuja ligação ao DNA de fita dupla se alonga e se desenrola.

DNA rad 51 foi adicionado a uma molécula de DNA amarrada na fonte. Como mostrado aqui, o cordão traça uma trajetória em espiral. Esse movimento pode ser desacoplado em componentes que descrevem como o DNA se alonga e se desenrola ao longo do tempo.

Para medir o torque armazenado no DNA usando o MTT, a molécula com sistematicamente sobre e sob a ferida e as flutuações angulares foram medidas para cada número de voltas aplicadas. O desvio padrão das flutuações angulares, que relata a rigidez da armadilha angular, deve ser independente do número de voltas aplicadas. Aqui, o desvio padrão é de cerca de nove graus, conforme mostrado aqui.

A média das posições angulares muda sistematicamente com o número de voltas aplicadas usando a rigidez da armadilha angular constante. As mudanças no ângulo médio são convertidas em torque, produzindo o torque armazenado no DNA versus as voltas aplicadas. O registro simultâneo da posição Z dos grânulos produz o comprimento do DNA versus as voltas aplicadas.

Juntas, essas duas curvas produzem a resposta mecânica completa do DNA ao enrolamento superior e inferior. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir, torcer e torcer em moléculas biológicas usando as pinças magnéticas de órbita livre e as pinças de torque magnético para novos ensaios de molécula única aos quais as pinças magnéticas convencionais podem ser facilmente adaptadas. O desenvolvimento dessas técnicas abre caminho para pesquisas no campo da biofísica, por exemplo, para estudar as propriedades de torção do DNA ou RNA e observar processos como compactação e reparo de DNA As técnicas de fonte e MTT podem ser aprimoradas por outros métodos, como detecção de fluorescência, a fim de responder a perguntas adicionais, como determinar a localização específica de uma proteína em um DNA amarrado.