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Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Eletroporação in ovo de embriões de galinha

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JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

In ovo Electroporation of Chicken Embryos

4.10: Mouse Genotyping

4.15: Zebrafish Microinjection Techniques

24,765 Views

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06:57 min

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April 30, 2023

Overview

A eletroporação é uma técnica utilizada em pesquisas biomédicas que permite a manipulação da expressão genética através da entrega de material genético estrangeiro em células. Mais especificamente, na eletroporação ovo é realizada em filhotes em desenvolvimento precoce (Gallus gallus domesticus) contidos dentro de suas cascas de ovos. Neste procedimento, construções de DNA ou knockdown são injetadas pela primeira vez em um tecido alvo. No entanto, o material genético é incapaz de penetrar na membrana plasmática para realizar sua função dentro da célula. Para resolver esse problema, um campo elétrico é aplicado, causando interrupções temporárias na estabilidade da membrana. Este campo elétrico também faz com que os ácidos nucleicos carregados negativamente migrem em direção ao eletrodo carregado positivamente através dos orifícios na membrana plasmática, conduzindo efetivamente o DNA ou a construção de knockdown para dentro da célula. A maior vantagem dessa técnica é que a entrega de material genético pode ser localizada para tipos de células isoladas em pontos de tempo específicos de desenvolvimento. Como resultado, os mecanismos genéticos que regem eventos individuais de desenvolvimento podem ser examinados.

Este vídeo fornece uma visão geral dos princípios por trás na eletroporação de ovo e introduz as ferramentas necessárias para a técnica, incluindo agulhas capilares, eletrodos e um eletroporador. Um protocolo passo-a-passo para a realização do procedimento também é apresentado antes da discussão de alguns exemplos fascinantes de como a técnica é usada para realizar uma variedade de manipulações genéticas em embriões de frango.

Procedure

A eletroporação é uma técnica usada para introduzir material genético estrangeiro nas células. A eletroporação de embriões de filhotes dentro do ovo, ou na eletroporação ovo, é uma ferramenta valiosa para biólogos de desenvolvimento, pois a entrega de material genético pode ser localizada em tecidos específicos e pontos de tempo específicos de desenvolvimento. Este vídeo introduzirá os princípios básicos da eletroporação de ovo, descreverá etapas essenciais do procedimento e discutirá como essa técnica pode ser usada para estudar processos biológicos durante o desenvolvimento.

Para começar, vamos rever os princípios básicos da eletroporação para descobrir como ele pode ser usado para colocar DNA em uma célula.

Primeiro, a microinjeção é usada para entregar o DNA perto de uma célula de interesse. No entanto, o DNA não pode penetrar na membrana plasmática para entrar na célula.

Para resolver esse problema, uma corrente elétrica é aplicada para interromper a estabilidade da membrana, criando poros. Uma segunda consequência deste campo elétrico é a migração do DNA carregado negativamente para o eletrodo positivo. Como resultado, apenas células na lateral do local de injeção mais próximas do eletrodo positivo são transfectadas com o DNA.

Agora que você conhece os princípios básicos, vamos falar sobre como preparar embriões para eletroporação. Se você precisa usar embriões mais velhos que o Hamburger Hamilton estágio 20, é melhor cultivar seus filhotes fora da concha, ou ex ovo, para melhor acesso ao tecido. Este vídeo se concentrará em eletroporações realizadas em embriões precoces que se desenvolvem dentro da concha, ou em ovo.

Para começar, os ovos devem ser incubados em uma incubadora umidificada a 37 °C até atingirem o estágio de desenvolvimento desejado. Enquanto os ovos estão incubando, prepare as ferramentas para injeção e eletroporação. Primeiro, faça agulhas capilares puxando uma tubulação de vidro de 0,5 mm com um puxador de canos. Para abrir a tubulação, coloque-a sob um microscópio e quebre um pequeno pedaço da ponta. Em seguida, prepare a solução de injeção, que deve conter uma diluição adequada do seu construto, bem como um corante para ajudá-lo a visualizar a solução injetada.

Para controlar o movimento do fluido dentro da agulha, anexe-o a uma tubulação bucal alimentada por humanos. Alternativamente, a agulha pode ser carregada em um microinjetor, que fornece pulsos de pressão ajustáveis de ar. Encha a agulha submergindo a ponta na solução de injeção e aplicando pressão negativa.

Além de agulhas, você também precisará de eletrodos. Estes consistem em dois fios expostos fixados juntos por um adaptador. Um par de cabos conecta os eletrodos ao gerador de pulso elétrico, ou eletroporador, que controla a duração do pulso, a frequência e a tensão. Para a operação mãos livres, o eletroporador pode ser ativado por um pedal.

Uma vez que os ovos estejam prontos, corte uma janela na casca, e adicione algumas gotas de solução fisiológica de sal, como Hanks, para evitar que o embrião seque. Sob um microscópio, posicione o ovo de tal forma que o tecido de interesse seja acessível à agulha. Em seguida, fure o embrião com a agulha capilar e entregue a solução aplicando pressão suave.

Agora que injetamos a construção, é hora de realizar a eletroporação. Posicione os eletrodos para que fiquem submersos na solução do Hank e o tecido de interesse esteja centrado entre eles. Para aplicar a corrente elétrica, pressione o pedal do pé e procure bolhas que se formem ao redor dos eletrodos.

Quando a eletroporação estiver completa, remova os eletrodos do embrião e limpe-os com 70% de etanol. Adicione algumas gotas de solução de sal complementadas com antibióticos para evitar infecções, e sele a janela com fita adesiva. Por fim, coloque os ovos de volta na incubadora para o desenvolvimento contínuo antes da análise fenotípica.

Agora que aprendemos tudo sobre a eletroporação de ovo, vamos olhar para alguns exemplos de como os cientistas estão aplicando essa técnica em pesquisas de desenvolvimento.

Para começar, a eletroporação pode ser usada para bloquear a expressão genética por meio da entrega de construções de knockdown. Neste exemplo, as células do tubo neural em desenvolvimento foram eletroporadas com construções de silenciamento genético. Os embriões foram autorizados a desenvolver-se, e então as trajetórias de axônio foram comparadas entre amostras normais e knockdown para avaliar o controle genético da orientação do axônio.

Por outro lado, a eletroporação ovo também pode ser usada para expressar uma proteína em um subconjunto de células, introduzindo um plasmídeo contendo um gene codificador de proteínas e um promotor: uma sequência que liga a polimerase de RNA para iniciar a transcrição. Aqui, os cientistas entregaram um único gene em células do cérebro embrionário. A coloração tecidual para detectar tanto o produto proteico deste gene quanto marcadores de subtipos neurais específicos mostram que o gene eletroporado altera o desenvolvimento neural.

Construções de DNA codificando proteínas fluorescentes também podem ser introduzidas por eletroporação para visualizar células e estruturas durante o desenvolvimento. Isso permite imagens ao vivo de processos complexos, como o desenvolvimento da medula espinhal, dando uma visão da dinâmica dos movimentos celulares ao longo do tempo.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE na eletroporação ovo, uma técnica útil para entregar material genético em filhotes. Este vídeo discutiu os princípios básicos da eletroporação, etapas necessárias para injetar e eletroporar filhotes, e aplicações dessa técnica na pesquisa de desenvolvimento atual. Obrigado por assistir!

Transcript

Electroporation is a technique used to introduce foreign genetic material into cells. Electroporation of chick embryos inside the egg, or in ovo electroporation, is a valuable tool for developmental biologists because the delivery of genetic material can be localized to specific tissues and specific developmental time points. This video will introduce the basic principles of in ovo electroporation, describe essential steps of the procedure, and discuss how this technique can be used to study biological processes during development.

To start, let’s review the basic principles of electroporation to figure out how it can be used to get DNA into a cell.

First, microinjection is used to deliver the DNA in close proximity to a cell of interest. However, the DNA can’t penetrate the plasma membrane to get into the cell.

To solve this problem, an electrical current is applied to disrupt the stability of the membrane, creating pores. A second consequence of this electric field is the migration of the negatively charged DNA towards the positive electrode. As a result, only cells on the side of the injection site closer to the positive electrode become transfected with the DNA.

Now that you know the basic principles, let’s talk about how to prepare embryos for electroporation. If you need to use embryos older than Hamburger Hamilton stage 20, it’s best to culture your chicks outside of the shell, or ex ovo, for improved tissue access. This video will focus on electroporations performed on early embryos developing within the shell, or in ovo.

To begin, eggs should be incubated in a humidified incubator at 37 °C until they have reached the desired developmental stage. While the eggs are incubating, prepare the tools for injection and electroporation. First, make capillary needles by pulling a 0.5 mm glass pipet with a pipet puller. To open the pipet, place it under a microscope and break off a small piece of the tip. Then, prepare the injection solution, which should contain an appropriate dilution of your construct as well as a dye to help you visualize the injected solution.

To control the movement of fluid within the needle, attach it to a human-powered mouth pipet. Alternatively, the needle can be loaded onto a microinjector, which provides adjustable pressure pulses of air. Fill the needle by submerging the tip in the injection solution and applying negative pressure.

In addition to needles, you’ll also need electrodes. These consist of two exposed wires fixed together by an adaptor. A pair of cables connects the electrodes to the electric pulse generator, or electroporator, which controls the pulse duration, frequency, and voltage. For hands free operation, the electroporator can be activated by a foot pedal.

Once the eggs are ready, cut a window in the shell, and add a few drops of physiological salt solution, such as Hanks, to prevent the embryo from drying out. Under a microscope, position the egg such that the tissue of interest is accessible to the needle. Then, pierce the embryo with the capillary needle and deliver the solution by applying gentle pressure.

Now that we’ve injected the construct, it’s time to perform the electroporation. Position the electrodes so that they are submerged in the Hank’s solution and the tissue of interest is centered between them. In order to apply the electrical current, press the foot pedal and look for bubbles forming around the electrodes.

Once the electroporation is complete, remove the electrodes from the embryo and wipe them down with 70% ethanol. Add a few drops of salt solution supplemented with antibiotics to prevent infection, and seal the window with tape. Finally, place the eggs back in the incubator for continued development prior to phenotypic analysis.

Now that we’ve learned all about in ovo electroporation, let’s look at some examples of how scientists are applying this technique in developmental research.

To begin, electroporation can be used to block gene expression by delivery of knockdown constructs. In this example, cells of the developing neural tube were electroporated with gene silencing constructs. The embryos were allowed to develop, and then axon trajectories were compared between normal and knockdown samples to assess the genetic control of axon guidance.

On the flipside, in ovo electroporation can also be used to express a protein in a subset of cells by introducing a plasmid containing a protein-encoding gene and a promoter: a sequence which binds RNA polymerase to initiate transcription. Here, scientists delivered a single gene into cells of the embryonic brain. Tissue staining to detect both the protein product of this gene and markers of specific neural subtypes shows that the electroporated gene alters neural development.

DNA constructs encoding fluorescent proteins can also be introduced by electroporation to visualize cells and structures during development. This allows for live imaging of complex processes, such as spinal cord development, giving insight into the dynamics of cell movements over time.

You’ve just watched JoVE’s introduction to in ovo electroporation, a useful technique for delivering genetic material into chicks. This video discussed the basic principles of electroporation, steps required to inject and electroporate chicks, and applications of this technique in current developmental research. Thanks for watching!

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