Cultura ex ovo de galinha

Chick <em>ex ovo</em> Culture

JoVE Science Education
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Chick ex ovo Culture

4.2: Introducing Experimental Agents into the Mouse

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06:48 min

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April 30, 2023

Overview

Uma força da galinha (Gallus gallus domesticus) como um organismo modelo para biologia do desenvolvimento é que o embrião se desenvolve fora da fêmea e é facilmente acessível para manipulação experimental. Muitas técnicas permitem que os cientistas examinem embriões de frango dentro da casca de ovo (em ovo),mas o acesso embrionário pode ser limitado em estágios posteriores de desenvolvimento. Felizmente, os filhotes também podem ser cultivados ex ovo, ou fora da casca de ovo. A maior vantagem para a cultura ex ovo é o maior acesso a tecidos que poderiam ser obstruídos pela casca ou pela orientação do filhote dentro do ovo, especialmente para embriões em estágios posteriores de desenvolvimento.

Existem duas estratégias de princípio para ex-cultura ovo: cultura de gema inteira e cultura explant. Durante toda a cultura da gema, a casca de ovo é rachada e o conteúdo é transferido para um simples vaso habitacional. No entanto, nos métodos de cultura explant, o embrião é extirpado da gema e montado no vaso habitacional para manter a tensão da membrana, o que é importante para o desenvolvimento normal.

Protocolos básicos para técnicas de gema integral e explant serão fornecidos neste vídeo, juntamente com uma discussão sobre os prós e contras de filhotes de cultura fora da concha. Finalmente, serão discutidas aplicações experimentais da cultura ex ovo, demonstrando como essa abordagem é usada para melhorar o acesso ao embrião para microscopia e manipulação genética de embriões em estágio final.

Procedure

O filhote é um organismo modelo versátil para o estudo de caminhos de desenvolvimento, pois a maior parte de seu desenvolvimento ocorre fora da mãe. No entanto, a casca de ovo impede o acesso ao embrião para algumas formas de experimentação. Felizmente, os filhotes podem ser incubados fora da concha, ou “ex ovo“, usando alguns suprimentos de laboratório comumente disponíveis. Neste vídeo, você aprenderá sobre os princípios da cultura ex ovo, procedimentos passo a passo para dois métodos culturais diferentes e aplicações da técnica em estudos de desenvolvimento.

Antes de falar sobre como criar filhotes ex ovo,vamos passar por cima de alguns princípios da técnica. Dentro do ovo, o filhote desenvolve-se em estreita associação com a membrana vitelline em torno da gema. O volume restante é preenchido com albumina, ou clara de ovo, que protege o embrião e serve como fonte de proteína.

A cultura fora da casca pode ser realizada através de toda a cultura da gema, usando todo o conteúdo do ovo em um recipiente simples. Alternativamente, os tecidos embrionários podem ser excisados e cultivados na cultura ex ovo explant. Ambas as técnicas têm vantagens distintas sobre o uso de ovos com janelas.

Primeiro, a janela de embriões de frango em estágio posterior é complicada devido à presença de muitos vasos sanguíneos cruciais, que se desenvolvem dentro das membranas que circundam o filhote. Isso torna o método ex ovo preferível para trabalhar com filhotes em estágios posteriores.

Em segundo lugar, porque eles podem caber dentro de plataformas de imagem, configurações ex ovo cultura são mais favoráveis a imagens de alta resolução.

Além disso, a remoção de embriões da casca expõe um maior número de tecidos para manipulações experimentais como microcirurgia e microinjeção.

Como o filhote conta com a casca de ovo para proteção e minerais essenciais, a sobrevivência do embrião sem essa estrutura requer alguns cuidados extras. Por exemplo, a habitação deve ser projetada para manter um ambiente estéril e úmido, e os nutrientes devem ser fornecidos na forma de albumina ou meio de cultura. Para a cultura de longo prazo, a casca esmagada também é necessária como fonte de cálcio. Além disso, uma vez que a tensão nas membranas que sustentam o embrião é importante para o desenvolvimento normal, a cultura ex ovo bem sucedida depende também de moradias que mantenham a morfologia da membrana normal.

Agora que você sabe o básico, é hora de se acovardar! Para preparar os ovos para a cultura de ovo de gema inteira, comece incubando-os a 37,5 °C até pouco antes do estágio desejado.

Enquanto espera, prepare a casa. Pratos de petri, barcos de pesagem e redes são comumente usados para segurar o conteúdo do ovo. Primeiro, esterilize todos os componentes por tratamento com luz UV ou etanol.

Além disso, prepare uma câmara externa cheia de água estéril para manter a umidade durante a incubação.

Quando os ovos estiverem prontos, coloque-os em uma posição horizontal por alguns minutos para que o embrião suba até o topo. Em seguida, quebre o fundo da casca e transfira cuidadosamente o conteúdo do ovo para a carcaça. Por fim, cubra o vaso habitacional para manter a umidade e coloque a configuração em uma incubadora até que a idade desejada seja alcançada para o processamento a jusante.

Uma estratégia alternativa ex ovo, cultura explant, requer alguns passos adicionais depois de remover o embrião da casca.

Nesta técnica, a membrana vitelline é suavemente separada da gema, carregando o embrião em desenvolvimento com ela.

Em seguida, a membrana é montada para manter a tensão, o que pode ser feito puxando o tecido apertado em torno de um anel de vidro ou por simples adesão ao papel filtro.

Após a montagem, o meio de cultura é adicionado para cobrir o tecido, e o embrião é colocado em uma câmara umidificada.

Os embriões explantados agora podem ser devolvidos a uma incubadora por até 24 horas de desenvolvimento posterior.

Depois de aprender os princípios e métodos da cultura ex ovo, estamos prontos para alguma peça de aves.

ex cultura ovo é particularmente útil quando você precisa alterar a expressão genética em embriões mais antigos. Uma abordagem para isso é a eletroporação, na qual uma corrente elétrica é usada para permeabilizar membranas celulares para a entrega de material genético. Uma vez que os embriões ex-ovo cultivados também são altamente acessíveis para imagens, a absorção de material genético pode ser facilmente validada através de imagens fluorescentes de embriões inteiros.

Imagens em tempo real da dinâmica celular também são possíveis usando a cultura ex ovo. As células cancerígenas humanas podem formar tumores cooptando vasos sanguíneos da membrana corioallantóica do filhote, ou CAM. Após a formação do tumor, partículas fluorescentes podem ser injetadas diretamente na corrente sanguínea e rastreadas em tempo real. O acúmulo de partículas no tecido tumoral pode ser usado como um indicador de angiogênese, ou a formação de novos vasos sanguíneos.

Embora embriões inteiros possam ser cultivados usando técnicas de explant, alguns experimentos exigem que tecidos embrionários sejam dissecados antes da cultura. Por exemplo, o desenvolvimento de tecido neural pode ser extirpado e cultivado em deslizamentos de tampa de vidro. Após um período de incubação, uma população específica de células conhecidas como crista neural pode ser observada migrando para longe do tecido. O tratamento com agentes experimentais e imagens timelapse podem então ser usados para testar fatores que controlam a migração celular.

Você acabou de ver o guia do JoVE para a cultura de ex-ovo. Este vídeo abordou os princípios da cultura ex ovo, os fundamentos dos métodos de gema e explanto, e algumas das maneiras como essas técnicas são usadas em laboratórios hoje em dia. Obrigado por assistir!

Transcript

The chick is a versatile model organism for the study of developmental pathways because most of its development takes place outside of the mother. Nonetheless, the eggshell prevents access to the embryo for some forms of experimentation. Fortunately, chicks can be incubated outside of the shell, or “ex ovo,” using some commonly available lab supplies. In this video, you will learn about the principles of ex ovo culture, step-by-step procedures for two different culture methods, and applications of the technique in developmental studies.

Before talking about how to raise chicks ex ovo, let’s go over some principles of the technique. Within the egg, the chick develops in close association with the vitelline membrane surrounding the yolk. The remaining volume is filled with albumin, or egg white, which protects the embryo and serves as a source of protein.

Culture outside of the shell can be performed via whole yolk culture, using all of the egg contents in a simple container. Alternatively, embryonic tissues can be excised and grown in ex ovo explant culture. Both of these techniques have distinct advantages over the use of windowed eggs.

First, windowing later stage chicken embryos is complicated due the presence of many crucial blood vessels, which develop within the membranes that surround the chick. This makes the ex ovo method preferable for working with chicks at later stages.

Second, because they can fit within imaging rigs, ex ovo culture setups are more amenable to high-resolution imaging.

Furthermore, removing embryos from the shell exposes a greater number of tissues for experimental manipulations like microsurgery and microinjection.

Since the chick relies upon the eggshell for protection and essential minerals, embryo survival without this structure requires some extra care. For instance, housing must be designed to maintain a sterile, humid environment, and nutrients must be provided in the form of albumin or culture medium. For long-term culture, crushed shell is also required as a calcium source. Furthermore, since tension on the membranes supporting the embryo is important for normal development, successful ex ovo culture additionally depends upon housing that maintains normal membrane morphology.

Now that you know the basics, it’s time to chicken out! To prepare eggs for whole yolk ex ovo culture, begin by incubating them at 37.5 °C until just before the desired stage.

While you’re waiting, prepare the housing. Petri dishes, weigh boats, and hammocks are commonly used to hold the egg contents. First, sterilize all components by treatment with UV light or ethanol.

Additionally, prepare an outer chamber filled with sterile water to maintain humidity during incubation.

When the eggs are ready, set them in a horizontal position for a few minutes so the embryo rises to the top. Then crack the bottom of the shell and carefully transfer the egg contents into the housing. Finally, cover the housing vessel to maintain humidity, and place the setup into an incubator until the desired age is reached for downstream processing.

An alternative ex ovo strategy, explant culture, requires a few additional steps after removing the embryo from the shell.

In this technique, the vitelline membrane is gently separated from the yolk, carrying the developing embryo with it.

Then, the membrane is mounted in order to maintain tension, which can be done by pulling the tissue tight around a glass ring or by simple adherence to filter paper.

After mounting, culture medium is added to cover the tissue, and the embryo is placed in a humidified chamber.

The explanted embryos can now be returned to an incubator for up to 24 hours of further development.

After learning the principles and methods of ex ovo culture, we’re ready for some fowl play.

ex ovo culture is particularly useful when you need to alter gene expression in older embryos. One approach to this is electroporation, in which an electric current is used to permeabilize cell membranes for the delivery of genetic material. Since the ex ovo cultured embryos are also highly accessible for imaging, the uptake of genetic material can easily be validated through fluorescent imaging of whole embryos.

Real-time imaging of cell dynamics is also possible using ex ovo culture. Human cancer cells can form tumors by co-opting blood vessels of the chick chorioallantoic membrane, or CAM. After tumor formation, fluorescent particles can be injected directly into to the bloodstream and tracked in real time. Accumulation of particles in tumor tissue can be used as an indicator of angiogenesis, or the formation of new blood vessels.

Although whole embryos can be cultured using explant techniques, some experiments require that embryonic tissues be dissected prior to culture. For example, developing neural tissue can be excised and grown on glass cover slips. After a period of incubation, a specific population of cells known as the neural crest can be observed migrating away from the tissue. Treatment with experimental agents and timelapse imaging can then be used to test factors controlling cell migration.

You’ve just watched JoVE’s guide to chick ex ovo culture. This video covered the principles of ex ovo culture, the basics of whole-yolk and explant methods, and some of the ways these techniques are used in labs today. Thanks for watching!

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