Combinado In vivo Optical e μCT imagem para monitorar infecções, inflamações, and Bone Anatomy em uma infecção Orthopaedic Implant em Ratos

O objetivo geral deste procedimento é modelar e visualizar um modelo de camundongo de infiltração bacteriana de uma haste femoral ortopédica. Isso é feito primeiro implantando cirurgicamente um fio de kirschner de titânio de grau médico no fêmur de um camundongo EGFP. Na segunda etapa, o implante é inoculado com bactérias bioluminescentes.

Em seguida, o sinal bioluminescente é quantificado por imagens ópticas sequenciais in vivo e o implante é visualizado por micro imagens de TC. Em última análise, a quantificação dos sinais bioluminescentes permite o monitoramento da carga bacteriana ao longo do curso da infecção e a microtomografia computadorizada permite a visualização das alterações na qualidade e nas dimensões do osso que ocorrem durante a infecção. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a técnica cirúrgica não é muito indulgente.

Em particular, implantes colocados assimetricamente podem fraturar o fêmur, criando maior dor para o animal e pontos de dados não confiáveis. Este modelo de camundongo pode fornecer um valioso sistema de modelo pré-clínico para avaliar as respostas e mecanismos imunológicos protetores na artrite séptica, osteomielite e osteólise periprotética e danos ósseos, todos os quais são características de infecções de implantes ortopédicos em humanos. Vou agora demonstrar os procedimentos cirúrgicos com a ajuda do Dr. Yew Wang, um especialista em pesquisa, e Jonathan Ian, um técnico de laboratório em nosso laboratório em condições estéreis.

O uso do EPI adequado confirma a sedação de uma lixívia macho anestesiada de 12 semanas, camundongo EGFP pela pinça do dedo do pé, depois raspou o joelho operatório seguido de três esfoliações alternadas com álcool 70% e Betadine. Em seguida, faça uma incisão na linha média na pele que cobre a articulação do joelho direito, estendendo a incisão para que o mecanismo extensor possa ser bem definido. Em seguida, execute uma artrotomia medial para patelar e use uma pinça de suplemento para subluxar o mecanismo extensor do tendão patelar do quadríceps lateralmente.

Uma vez que a incisura intercondilar do fêmur esteja à vista, use uma agulha de calibre 25 seguida de uma agulha de calibre 23 para alargar manualmente o canal intramedular, tomando cuidado para permanecer paralelo à diáfise femoral. Para evitar alargamento assimétrico e possível fratura do fêmur, use um suporte de pino para empurrar manualmente um fio de kirschner de titânio de grau médico de 0,8 milímetro de diâmetro em uma direção retrógrada para o canal intramedular. Use cortadores de pinos para cortar a extremidade do fio de modo que ele se estenda aproximadamente um milímetro no espaço da articulação do joelho.

Agora use uma micropipeta para dispensar dois microlitros de um vezes 10 elevado à terceira UFC de S aureus Zen 29 bioluminescente na ponta do implante dentro do espaço articular do joelho. Em seguida, use uma pinça para reduzir o complexo quadríceps patelar de volta à linha média e feche o tecido subcutâneo sobrejacente e a pele com suturas subcuticulares absorvíveis. Para criar imagens do animal em 2D.

Primeiro coloque o lado ventral dos camundongos para cima na câmara de imagem de um sistema de imagem in vivo de animal inteiro óptico de espectro IVUS. Em seguida, confirme se a luminescente está marcada e se a abertura está selecionada como filtro de emissão e selecione o campo de visão C igual a 13 centímetros. Em seguida, role o tempo de exposição para baixo até que o automático seja exibido na janela para escolher a exposição automática e clique em adquirir para capturar a imagem bioluminescente para realizar imagens fluorescentes sequenciais in vivo.

Marque a caixa ao lado de fluorescente e escolha os filtros de excitação de 465 nanômetros e emissão de 520 nanômetros. Em seguida, role o tempo de exposição para baixo até automático. Novamente, selecione o campo de visão C e clique em adquirir para capturar a imagem de fluorescência para quantificar os sinais bioluminescentes in vivo como o fluxo total em uma região de interesse ou ROI usando o software de imagem viva.

Primeiro, expanda a seção de ferramentas ROI da paleta de ferramentas. Em seguida, selecione o ícone de círculo e o número de ROIs que correspondem ao número de animais sujeitos no campo de visão e redimensione as ROIs para abranger toda a área do padrão de difusão bioluminescente coletado. Em seguida, selecione Medir ROIs nas ferramentas de ROI e escolha as guias todos e copiar para copiar e, posteriormente, colar os valores de ROI em uma planilha.

Em seguida, na guia Ferramentas de ROI da paleta de ferramentas, nomeie a série de ROIs e clique em salvar. Em seguida, quantificar o sinal fluorescente in vivo de volta na janela do software de imagem viva. Ative a imagem fluorescente clicando nessa janela.

Expanda as ferramentas de ROI na paleta de ferramentas e selecione a série de ROI recém-salva no menu suspenso e clique em carregar. Em seguida, clique em medir ROIs novamente para abrir a janela de medição de ROI e copie os valores em uma planilha para aquisição de imagens de micro CT. Comece inserindo a tampa do furo grande e o braço adaptador para o ônibus de imagem no instrumento.

Coloque um mouse EGFP de piolhos anestesiados no vaivém de imagem do mouse e, em seguida, insira o vaivém de imagem no braço adaptador. Empurre o braço no furo e feche a porta. Agora abra o software CT na parte superior do painel de aquisição.

Selecione a opção predefinida Campo de visão padrão dinâmico de 60 milímetros na lista suspensa para selecionar automaticamente os parâmetros de aquisição otimizados, incluindo as seleções de tensão e corrente no painel de controle. Selecione o botão I para ativar o modo ao vivo e use os controles X e yxi para mover o assunto para a posição de pórtico de zero e 90 graus para centralizar o animal na janela de captura X. Em seguida, clique no botão I para desativar o modo ao vivo e clique no botão de tomografia computadorizada para adquirir uma imagem de varredura dinâmica com o campo de visão de 60 milímetros.

Em seguida, exporte a imagem adquirida em formato DICOM e salve-a para acesso posterior para aquisição de imagem óptica 3D. Primeiro, remova a placa de metal sólida da superfície do instrumento e insira a placa de transporte de imagem com um recorte para aceitar o transporte. Transfira a lançadeira de imagem do mouse da micro CT para a placa de recorte e encaixe-a no lugar.

Em seguida, na imagem viva no painel de controle de aquisição, selecione o assistente de imagem, escolha bioluminescência, delicie-se e selecione o repórter de bactérias no menu suspenso. A emissão apropriada para o modelo será escolhida automaticamente neste caso, 500 a 620 nanômetros. Em seguida, selecione Avançar e designe o assunto da imagem, pois as configurações automáticas do mouse serão selecionadas, permitindo que a exposição automática maximize a qualidade do sinal, evitando a saturação campo de visão será definido como C igual a 13 centímetros.

Clique em concluir. A janela de sequência do painel de aquisição será preenchida automaticamente com a sequência de encantamento para adquirir os dados de encantamento, selecione adquirir sequência. Uma imagem será adquirida por cada filtro de emissão escolhido.

A exposição automática selecionará as configurações ideais em cada comprimento de onda de acordo com as seleções do assistente de imagem. Após a conclusão da aquisição da imagem, expanda a guia topografia de superfície na paleta de ferramentas. Em seguida, selecione a orientação que reflete com precisão o lado do animal voltado para a câmera ou parte superior do instrumento ivus.

Clique em gerar superfície e corte a região do campo de visão que contém o animal. Use a máscara roxa para definir o limite do animal e, em seguida, selecione concluir. A superfície aparecerá automaticamente.

Salve o resultado na guia topografia de superfície e, em seguida, feche a guia. Em seguida, para reconstruir a posição da fonte óptica 3D, expanda a guia de reconstrução 3D agradável. Para usar os algoritmos de reconstrução óptica difusa implementados em imagem viva, as imagens adquiridas para a sequência de deleite serão listadas por um comprimento de onda da missão.

Selecione iniciar e a janela de visualização de dados será aberta exibindo a sequência a ser analisada, definida para o limite óptico otimizado calculado automaticamente. Em seguida, selecione reconstruir para executar automaticamente os algoritmos de reconstrução e gerar uma representação 3D da fonte óptica. Em seguida, clique no ícone 3D na barra de ferramentas para abrir o navegador DICOM e clique duas vezes no conjunto de dados Quantum FX adquirido anteriormente para carregá-lo na visualização 3D da imagem viva.

Expanda as ferramentas ópticas 3D na paleta de ferramentas e desmarque a caixa Exibir superfície do assunto na guia Superfície para desmarcar a topografia da superfície. Em seguida, use o histograma na guia de volume da seção de ferramentas de multimodalidade 3D da paleta de ferramentas para criar manualmente uma tabela de pesquisa para visualizar o esqueleto e o implante de fio K visível na imagem de micro TC para determinar onde o tecido de interesse específico está no histograma, use a ferramenta deslizante para limitar a renderização até que o tecido ou estrutura esteja visível. Em seguida, clique com o botão direito do mouse no histograma para gerar os pontos e formar uma curva para isolar essa área do histograma.

Depois de salvar os dados do esqueleto e do implante de fio K, clique duas vezes em qualquer ponto gerado no histograma para codificar por cores os componentes desejados. Para análise de imagem de micro CT, use o software quantum FX para selecionar a imagem de interesse e, em seguida, inicie o visualizador. Em seguida, selecione a ferramenta de rotação e reoriente a imagem.

Para visualizar o eixo longitudinal do fêmur, selecione a ferramenta de medição e meça o comprimento do fêmur. Em seguida, inicie o visualizador 3D para gerar as renderizações 3D e ajustar o limite para mostrar as alterações na anatomia óssea associadas à infecção do implante. Aplique os planos de recorte para que a renderização 3D seja limitada à seção transversal desejada da área de interesse no fêmur distal e inicie o pacote de software analyze 11.0.

Carregue o arquivo star vox que foi usado para criar a renderização 3D e inicie a ferramenta de calculadora de imagens. Use a ferramenta de painel de região para cortar a imagem, removendo todos os planos que não incluem o fêmur. Em seguida, abra a ferramenta de seções oblíquas e use a opção de três pontos para localizar pontos no meio do fêmur, trocanter maior e na extremidade do pino.

Use esses pontos para criar um plano oblíquo e, em seguida, gerar uma imagem com as novas fatias. Abra a ferramenta ROI e exiba as fatias transaxiais, ajustando as configurações mínima e máxima para exibir o osso cortical. Crie contornos para as fatias correspondentes aos 25% distais do fêmur e use a ferramenta propagar regiões para interpolar entre esses contornos e criar uma região 3D de interesse.

Salve essa região de interesse como um mapa de objetos e abra a ferramenta de opções de amostra. Em seguida, marque a caixa de seleção do mapa de objetos que acabou de ser criado e clique no botão configurar estatísticas de log para confirmar se a caixa de seleção de volume e o botão de imagens de amostra estão selecionados. Em seguida, exporte as medições de volume para um programa de análise de dados e normalize os volumes ósseos externos dos pontos de tempo posteriores para o primeiro ponto de tempo da imagem usando esta fórmula, onde X representa o ponto de tempo de interesse.

Para visualizar a região 3D de interesse sobre o osso, carregue a imagem de TC na ferramenta de renderização de volume e carregue o mapa de objetos que contém a região 3D de interesse. Em seguida, vá para visualizar objetos e defina o original como para abrir a janela de visualização, iniciar o menu de tipos de renderização e selecionar a composição de objetos. Em seguida, clique no botão de limite e ajuste os limites para mostrar o mapa de ossos e objetos usando o mesmo intervalo de limite fixo para todos os pontos de tempo.

Por fim, clique no botão de rotação e defina a orientação para uma visualização anterolateral verdadeira. Clique em renderizar para gerar a renderização final e salve a renderização na janela de renderização do volume principal. Neste estudo, os sinais bioluminescentes de camundongos infectados com Zen 36 permaneceram acima dos sinais de fundo de camundongos infectados simulados durante o experimento.

Além disso, os sinais fluorescentes do EGFP foram maiores do que os camundongos infectados simulados nos primeiros momentos, mas se aproximaram dos níveis de fundo durante o curso da infecção para visualizar os sinais ópticos no contexto anatômico das articulações do joelho pós-cirúrgicas em 3D, as imagens ópticas geradas usando o sistema de imagem de espectro IVUS. Para este experimento representativo foram co-registrados com imagens de micro CT geradas usando o sistema de imagem de micro CT quântico fx. Como acabamos de demonstrar, os dados ópticos foram então mapeados nas imagens de micro CT em 3D usando um algoritmo de reconstrução de tomografia óptica difusa, conforme ilustrado neste filme, a imagem de micro CT também permite a visualização e quantificação de mudanças consequentes na qualidade e dimensões do osso que ocorrem durante a infecção.

Conforme relatado anteriormente, o volume ósseo externo do fêmur distal aumenta substancialmente com o tempo. Para quantificar essas alterações, a análise volumétrica de imagens 3D pode ser realizada e as alterações no volume ósseo ao longo do tempo podem ser normalizadas para o volume ósseo inicial. Como esperado das imagens de micro CT, o volume ósseo externo aumenta substancialmente em camundongos infectados em comparação com camundongos infectados simulados após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para que nosso laboratório usasse esse modelo para avaliar a eficácia dos revestimentos de implantes carregados com antibióticos, determinar o papel da interleucina uma beta na promoção do recrutamento de neutrófilos para a articulação pós-cirúrgica infectada e avaliar e comparar regimes antibióticos profiláticos e de tratamento. Após esses procedimentos, outros métodos, como imagens fotoacústicas, podem ser realizados para detectar sinais fluorescentes infravermelhos próximos, o que pode ser importante para o desenvolvimento futuro de sondas fluorescentes projetadas para diagnosticar a presença de uma infecção.