Imagens de fluorescência com um nanômetros Precisão (Fiona)

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como realizar imagens de fluorescência com precisão de um nanômetro ou experimentos de Fiona. Isso é feito primeiro configurando o equipamento necessário e alinhando a óptica para reflexão interna total, fluorescência, microscopia ou grama. O próximo passo é imobilizar o CY 3D NA na superfície interna de uma câmara de amostra e localizar moléculas individuais de CY 3D NA com precisão nanométrica.

Posteriormente, Fiona é aplicada para estudar o movimento de uma única miosina truncada cinco um motor marcado com um ponto quântico. Em última análise, o tamanho do passo da miosina à medida que caminha, Acton foi medido em 36 nanômetros pela análise de Fiona. Embora esse método possa fornecer informações sobre motores moleculares, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como o rastreamento de receptores na membrana das células.

A demonstração visual deste método é crítica, pois os detalhes experimentais são difíceis de aprender. É importante usar óculos de segurança a laser o tempo todo durante a configuração. Para reflexão interna total, fluorescência, microscopia ou grama.

Para começar, defina as alturas de todos os componentes ópticos para a altura do centro do microscópio, porta traseira, monte o laser, o obturador do laser e os filtros ND. Use filtros ND para atenuar a potência do laser o mais baixo possível, mantendo o feixe visível. Aperte os parafusos com as chaves sextavadas apropriadas.

Planeje um caminho de viga conforme ilustrado pelas linhas azuis pontilhadas. Neste esquema, marque o caminho do feixe com fita adesiva ou marcador na mesa óptica. Coloque o espelho M1 na primeira volta em ângulo reto, coloque as duas íris ao longo da segunda seção reta do caminho do feixe planejado.

Ajuste a posição e a inclinação de M1 de modo que o laser passe pela íris e coloque o espelho M dois. Na segunda curva em ângulo reto, coloque o expansor de feixe 10 x ao longo da terceira seção reta do caminho. Ajuste sua inclinação de forma que o expansor de feixe fique paralelo à mesa óptica e ao caminho planejado do feixe.

O próximo passo é ajustar M1 e M dois iterativamente, de modo que o laser passe direto pelos centros de ambas as lentes, L um e L dois do expansor de feixe. Use um pedaço de papel branco para bloquear o feixe após o expansor de feixe para verificar o perfil do feixe a olho nu. Ajuste até que o perfil da viga expandida não seja ED.

Gaussiano ajusta a distância entre L um e L dois de modo que o feixe seja agrupado obturador. O laser desaparafusa a objetiva do microscópio e aparafusa em um alinhamento fluorescente. Os espelhos de destino M três e M quatro para direcionar o feixe expandido para a porta do microscópio e para o espelho dicróico.

Dentro da torre. Ajuste M três para centralizar a parte mais brilhante do feixe no alvo fluorescente e M quatro para fazer o feixe inclinar-se verticalmente, feche o laser e aparafuse a objetiva de volta. Multa. Ajuste as inclinações de M três e M quatro para otimizar a potência do laser e o perfil do feixe fora da objetiva.

Monte uma câmera E-M-C-C-D no microscópio e conecte a câmera a um computador. Inicie o software da câmera. Monte uma amostra fluorescente no microscópio.

Olhe para o ponto fluorescente brilhante na câmera. Verifique se o ponto não se desloca no ecrã porque a focagem mudou. Coloque a lente TIR no estágio de translação XY, Z a uma distância do plano focal traseiro da objetiva que é igual à distância focal, o L três, que é de cerca de 30 centímetros.

Ajuste a posição de L três de modo que o laser passe pelo centro da lente. Translade L três ao longo do caminho do feixe para ajustar o agrupamento do feixe. Certifique-se de que o feixe ainda esteja centralizado no monitor e de formato simétrico.

Translade L três perpendicularmente ao caminho do feixe para inclinar o feixe para fora da objetiva. Continue transladando a lente TIR de forma que o TIR seja alcançado antes de realizar um Fiona. Experimento de localização e mobilização de CY 3D NA. Moléculas únicas constroem câmaras de amostra conforme detalhado no texto do protocolo.

Duas tiras de fita dupla-face são aplicadas na lâmina ao longo das bordas longas, deixando uma lacuna de três a cinco milímetros no centro e, em seguida, uma lamínula limpa é colocada no topo da lâmina vistas laterais da câmara da direita e da frente são mostradas. As extremidades abertas da câmara são deixadas abertas e servem como entrada e saída para imobilizar o SI 3D NA nas superfícies internas da câmara de amostra. Pipete 10 microlitros de biotina BSA na câmara.

Aguarde cinco minutos. Lave a câmara de amostra pipetando 40 microlitros de T 50 BSA na câmara. Em seguida, pipetar 10 microlitros de neut travain na câmara e incubar por cinco minutos.

Lave a câmara novamente com 40 microlitros de pipeta T 50 BSA, 20 microlitros de SI 3D NA na câmara de amostra e incube por cinco minutos. Por fim, lave a câmara com 80 microlitros de T 50 BSA. Para iniciar o procedimento de geração de imagens de moléculas individuais de SI 3D NA sob turfa M, pipete 30 microlitros de tampão de imagem na câmara de amostra e aguarde de oito a 10 minutos.

Monte a amostra para aquisição de imagens em um microscópio de relva equipado com um laser verde, uma objetiva de imersão em óleo 100 X e uma câmera EMCD. Defina o tempo de exposição e o ganho EM. Adquira um filme da amostra para 1000 quadros.

Compile e execute Fiona Pro para análise de Fiona. Use este programa IDL para importar a imagem adquirida para inserir o tamanho efetivo do pixel e o fator de conversão de intensidade para número de fótons e para escolher pontos para análise de Fiona. No final, o programa produzirá os resultados do ajuste com funções gaussianas 2D, bem como números totais de fótons e precisão de localização, compilará e executará a contagem de pH pro.

Para caracterizar a contagem de fótons, use este programa DL para medir o número médio de fótons emitidos por uma flora. Quatro antes do branqueamento fotográfico para importar a imagem adquirida e inserir o fator de conversão de intensidade para número de fótons. O programa detectará pontos fluorescentes, calculará automaticamente a contagem de fótons em função do número do quadro e produzirá os traços da contagem de fótons.

Prepare a amostra para este experimento pipetando 20 microlitros de BSA biotinilada a um miligrama por mililitro em DD H2O em uma câmara de amostra. Incube por 10 minutos. Enxágüe com 30 microlitros de D ddh, duas pipetas O em 0,5 miligramas por mililitro de neut travain e incube por dois minutos.

Lave a câmara com 30 microlitros de M cinco PSA. O acton para este experimento deve ser preparado no dia anterior, conforme descrito no texto do protocolo. Diluir a f actina preparada 25 vezes em geral, tampão actina até uma concentração final de cerca de 0,004 miligramas por mililitro.

Pipetar a solução de actina para a câmara e aguardar 10 minutos. Enxágüe a câmara com 30 microlitros de tampão diluído miosina cinco A com etiquetas de bandeira por 30. Dobre um tampão M cinco até uma concentração final de 250 nano molar.

Misture um microlitro da miosina diluída com um microlitro de Anti-Flag Q.Do 7 0 5. Adicione oito microlitros de M cinco para encher até 10 microlitros e pipete para cima e para baixo para misturar. Bem, incube por 10 minutos no gelo.

Pipete 20 microlitros de tampão de imagem contendo miosina Q dot na câmara de amostra. Incube por oito a 10 minutos. Visualize a amostra no microscópio de relva a uma exposição de 30 milissegundos.

Adquira pelo menos 1000 quadros para iniciar a análise de dados. Abra o arquivo de vídeo na imagem J e corte o vídeo em torno de um ponto em movimento. Rastreie o ponto através do vídeo para gerar coordenadas X e Y ao longo do tempo em pixels, aplicando a análise de Fiona a cada quadro do vídeo.

Converta pixels em nanômetros conforme descrito no texto do protocolo. Calcule o deslocamento da posição inicial em função do tempo. Execute um teste T no deslocamento para obter os passos da caminhada da miosina.

Exclua todos os valores zero da coluna de tamanho da etapa. Plote a distribuição dos tamanhos das etapas usando origin ou matlab. Ajuste um gaussiano ao histograma.

Nesta imagem típica de superfície imobilize SI 3D NA. A seta amarela aponta para uma única molécula SI 3D NA cuja função de propagação de ponto ou PSF é mostrada aqui. O PSF é equipado com uma função gaussiana bidimensional, e os resíduos de encaixe também são mostrados. Este gráfico é um traço típico de contagem de fótons versus número de quadros e o ajuste exponencial fornece o número médio de fótons de cerca de 1,4 vezes 10 elevado ao sexto para medir o tamanho do passo de miosina um arquivo de vídeo com bom sinal para ruído de uma única miosina.

À medida que caminha, um filamento de actina é capturado. Três quadros de exemplo são mostrados. A aplicação de Fiona a cada quadro produz um traço de distância versus tempo plotado em vermelho.

Um algoritmo de localização de etapas baseado no teste T é usado para extrair etapas individuais e a saída é sobreposta em branco Os tamanhos das etapas e os nanômetros são rotulados em branco. Quando as etapas de vários traços são combinadas em um histograma, os tamanhos de etapas medidos são gaussianos distribuídos em cerca de 35,8 mais ou menos 0,4 nanômetros. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar experimentos com Fiona, incluindo a configuração de um microscópio de grama Para obter os melhores resultados Com esses procedimentos, é importante minimizar os danos fotográficos ao uso e experimentos de força do piso.

Não se esqueça de que trabalhar com microscopia de grama e Fiona pode ser extremamente perigoso e precauções como óculos de segurança devem ser usadas durante a execução deste procedimento.