Medindo Fluxos de nutrientes minerais e substâncias tóxicas em plantas com Traçadores Radioativos

In planta, a medição dos fluxos de nutrientes e tóxicos é essencial para o estudo da nutrição e toxicidade das plantas. Aqui, abordamos protocolos de radiotraçadores para determinação de influxo e efluxo em raízes de plantas intactas, usando fluxos de potássio (K⁺) e amônia/amônio (NH₃/NH₄⁺) como exemplos. Vantagens e limitações de tais técnicas são discutidas.

O objetivo geral do experimento a seguir é medir os fluxos unidirecionais de potássio e amônia para dentro e para fora das raízes de mudas de cevada intactas e caracterizar o funcionamento dos principais sistemas de transporte de nutrientes nas membranas das plantas. Isso é conseguido primeiro cultivando mudas por uma semana em soluções hidropônicas de composição química específica para garantir que as plantas estejam em um estado nutricionalmente estável. A cultura hidropônica permite que as raízes sejam acessíveis para manipulação experimental.

Como segunda etapa, as raízes de plantas intactas são imersas por períodos variáveis de tempo em soluções experimentais, incluindo soluções de absorção, que têm o substrato de interesse enriquecido com seu isótopo radioativo. Esta etapa será usada para determinar as taxas de transporte para dentro e para fora das mudas. Em seguida, as plantas são dissecadas imediatamente após um curto período de absorção para experimentos de influxo unidirecional ou transferidas para um funil FLX após uma absorção mais longa para medição da liberação do traçador.

Usando análise compartimental por traçador, flx ou Kate, são obtidos resultados que podem revelar aspectos-chave da capacidade, energética, mecanismos e regulação dos sistemas de transporte. Este método pode ajudar a responder a questões-chave relacionadas à fisiologia nutricional das plantas, como como os nutrientes minerais e tóxicos são transportados para dentro e para fora das plantas? Como esses fluxos respondem a ambientes em mudança e como afetam a compartimentação do substrato, celular e tecidual?

E, por último, como os estresses abióticos que comprometem os ambientes ecológicos na agricultura, como salinidade, seca e toxicidade de metais pesados, afetam os fluxos e a dinâmica dos nutrientes das plantas. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como ensaios de depleção ou acumulação de substrato ou medições de eletrodos vibratórios seletivos de ferro, é que somos capazes de medir fluxos unidirecionais em oposição a flexões líquidas, o que é uma diferença entre influxo e eFlex. Ao fazer isso, podemos obter informações valiosas sobre a capacidade energética, mecanismos e regulação dos sistemas de transporte de nutrientes e intoxicantes vegetais.

A espécie modelo de cevada será usada neste experimento, cultivar as mudas de cevada hidroponicamente por sete dias em uma câmara de crescimento climatizada um dia antes da experimentação agrupar várias mudas para fazer uma única réplica. Enrole um pedaço de tubo de dois centímetros de tigon ao redor da parte basal das calhas e prenda o tubo com fita adesiva para criar um colar. Use três plantas por feixe para o ensaio de influxo direto ou DI e seis plantas por feixe para a análise compartimental por ensaio de traçador, flx ou Kate um dia antes do experimento.

Prepare os seguintes materiais e soluções para DI, reúna soluções de pré-rotulagem, rotulagem e dessorção, tubos de centrifugação e frascos de amostra, areje e misture todas as soluções para Kate. Reúna bem o seguinte. Soluções mistas de rotulagem e eluição aeradas, funis de efluxo, tubos de centrifugação e frascos de amostra.

Preparar os traçadores de rádio no dia do experimento seguindo todos os requisitos da licença de materiais radioativos da instituição. Use equipamento de segurança e dosímetros adequados e use blindagem apropriada para a preparação do isótopo radioativo de potássio. Potássio 42.

Coloque um copo limpo e seco na balança e zere a balança. Retire um frasco para injetáveis do marcador da embalagem e deite o pó no copo. Observe a pipeta de massa, 19,93 mililitros de água destilada no copo, seguidos por 0,07 mililitros de ácido sulfúrico.

Posteriormente, calcula-se a concentração da solução-mãe radioactiva. Dada a massa e o peso molecular do carbonato de potássio e o volume da solução, use um contador Geiger Mueller para monitorar rotineiramente a contaminação. O isótopo radioativo de nitrogênio 13 é produzido em um cíclotron e chega como um líquido para medições de DI.

Usando potássio 42, pipete a quantidade de solução estoque radioativa necessária para atingir a concentração final desejada de potássio na solução de rotulagem Para medições de DI usando nitrogênio 13, pipete uma pequena quantidade inferior a 0,5 mililitros do traçador de rádio na solução de rotulagem. Deixe a solução de rotulagem se misturar completamente por aeração. Em seguida, pipete uma subamostra de um mililitro de solução de rotulagem em cada um dos quatro frascos de amostra.

Meça a atividade de rádio nos frascos usando um contador gama. Certifique-se de que o contador esteja programado de forma que as contagens por minuto ou as leituras de CPM sejam corrigidas. Para o decaimento isotópico, que é particularmente importante para traçadores de vida curta, calcule a atividade específica da solução de marcação S não expressa como contagens por minuto por micromole, calculando a média das contagens das quatro amostras e dividindo pela concentração de substrato na solução, mergulhe as raízes da cevada em uma solução de pré-marcação não radioativa por cinco minutos para pré-equilibrar as plantas em condições de teste.

Depois disso, mergulhe as raízes na solução de marcação radioativa por cinco minutos. Transfira as raízes para uma solução de dessorção por cinco segundos para remover a maior parte da atividade de rádio aderente à superfície. Em seguida, transferir as raízes para um segundo copo de solução de dessorção durante cinco minutos.

Para limpar ainda mais as raízes do traçador extracelular, disseque e separe os brotos basais e as raízes. Coloque as raízes em tubos de centrífuga e gire as amostras por 30 segundos em uma centrífuga de grau clínico de baixa velocidade. Para remover a água superficial e intersticial, pese as raízes para obter o peso fresco.

Meça a radioatividade nas amostras da planta usando um contador gama, calcule o influxo na planta usando esta fórmula. Comece este procedimento preparando a solução de rotulagem e medindo o nó S conforme mostrado anteriormente. Depois de medir s, adicionar 19 mililitros de água a cada amostra, de modo que o volume final seja igual ao volume EIT de 20 mililitros.

Contar a actividade radioeléctrica em cada amostra de 20 mililitros. Mergulhe as raízes na solução de rotulagem por uma hora. Após uma hora, remova as plantas da solução de rotulagem e transfira-as para o funil FLX, garantindo que todo o material radicular esteja dentro do funil.

Prenda suavemente as plantas ao lado do funil de efluxo aplicando uma pequena tira de fita adesiva sobre o colar de plástico Despeje suavemente o primeiro elu no funil. Inicie um cronômetro para contar em segundos e, após 15 segundos, abra a torneira e colete o EIT no frasco de amostra. Feche a torneira e despeje suavemente o próximo EIT no funil.

Desta forma, colete o EIT para o restante da série Elucian por um período total da UE de 29,5 minutos. Uma vez concluído o protocolo da UE, colher as plantas conforme mostrado anteriormente, contar a atividade de rádio nos EITs e nas amostras de plantas usando o contador gama, multiplicar a leitura de cada EIT pela liberação do traçador de gráfico de fator de diluição em função do tempo de eluição para condições de estado estacionário, realizar regressões lineares e cálculos de fluxos. Meias mentiras de câmbio e tamanhos de piscina.

Aqui são mostradas isotermas representativas para o influxo de amônia em função de concentrações externas variáveis de amônia. Em raízes intactas de mudas de cevada cultivadas com alto teor de amônia ou amônio, e baixos ou altos fluxos de amônia de potássio foram significativamente maiores em McKayla com baixo teor de potássio. As análises Menin das isotermas revelam que o alto teor de potássio tem relativamente pouco efeito na afinidade do substrato dos transportadores de absorção de amônia, mas reduz significativamente a capacidade de transporte.

Este próximo resultado destaca a rápida plasticidade do sistema de absorção de potássio. Em raízes de mudas de cevada intactas cultivadas com potássio moderado e alto teor de amônio. Um aumento de quase 350% no influxo de potássio foi observado dentro de cinco minutos após a retirada de amônio da solução externa.

Este efeito de retirada de amônio foi sensível aos bloqueadores dos canais de potássio, tetraetil amônio bário e césio. Esses gráficos mostram o potássio 42 efl em estado estacionário em raízes de mudas de cevada intactas cultivadas com baixo teor de potássio e nitrato moderado, e os efeitos imediatos de cloreto de césio 10 milimolar, sulfato de potássio cinco milimolares e sulfato de amônio de cinco milimolares em flx potássio flx foi inibido por césio ou potássio, mas estimulado por amônio. O Cate também pode ser usado para estimar as concentrações e os tempos de renovação do substrato em compartimentos subcelulares.

A análise de regressão da fase de troca lenta da liberação do traçador, juntamente com a retenção do traçador nos tecidos vegetais, pode revelar informações importantes sobre o tamanho do pool e as meias-vidas de troca de componentes subcelulares, como parede celular, citoplasma e va. Esta tabela mostra os parâmetros do cabo extraídos das medições de potássio 42 flx em estado estacionário em mudas de cevada cultivadas com um nitrato milimolar ou 10 milimolares de amônio. Este último representando um cenário tóxico.

O alto teor de amônio causa supressão de todos os fluxos de potássio e um declínio significativo no tamanho do pool. Uma vez dominada, a eficiência da metodologia DI pode ser melhorada escalonando tratamentos com 30 segundos de intervalo. Ao fazer isso, podemos examinar até 10 condições em um único experimento.

Da mesma forma, várias corridas de Kate podem ser realizadas simultaneamente, com tempo suficiente entre as corridas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir fluxos de nutrientes e intoxicantes em plantas intactas usando traçadores radioativos.