Enriquecimento para resistente à quimioterapia do cancro do ovário células-tronco de linhas de células humanas

O objetivo geral deste procedimento é selecionar e isolar células-tronco de câncer de ovário resistentes à quimioterapia ou CSCs. Isso é feito primeiro marcando com fluorescência as linhas de células de câncer de ovário com proteína fluorescente vermelha ou RFP e selecionando células positivas para RFP usando classificação ou fatos de células ativadas por fluorescência. A segunda etapa do procedimento é tratar as linhagens de células de câncer de ovário com cisplatina quimioterápica por 72 horas e, em seguida, cultivar as células sobreviventes em meio CSC.

Após dois dias, os esteróides de não adesão se formarão. Em seguida, as CSCs são caracterizadas usando análise de expressão gênica para marcadores de células-tronco e as CSCs são analisadas para marcadores de superfície celular usando citometria de fluxo. Em última análise, a análise das CSCs para resposta terapêutica é obtida tratando células com cisplatina ou paclitaxel e realizando um ensaio de MTT para medir a viabilidade.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o tratamento de células cancerígenas com altas doses de paclitaxel e cisplatina, é que nosso método produz células mais viáveis enquanto usa menos quantidades tóxicas de agentes quimioterápicos. As implicações dessa técnica se estendem para melhorar a terapia do câncer de ovário, porque as CSCs representam uma população terapeuticamente resistente que precisará de novas modalidades de tratamento. Este método também pode ser aplicado a outros sistemas, como câncer de pâncreas, câncer de mama e outros tipos de tumores com células terapeuticamente resistentes.

Junto com Jennifer Demonstrando essa técnica estará o Dr. Leroy, um pós-doutorado do meu laboratório. Para começar a propagar Skov três e O tosse 4 2 9 linhas celulares em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de CO2 e cultivar células entre 40 e 50% de fluência co. Para gerar SCV três células expressando proteína fluorescente vermelha ou RFP, adicione partículas lentivirais expressando RFP e 10 microgramas por mililitro de poli cérebro ao SCV três meios na ausência de penicilina e estreptomicina por 72 horas.

Após 72 horas, selecione para células positivas de RFP por classificação de células ativadas por fluorescência ou fatos pela primeira RFP de tripsina e células que não expressam RFP e, em seguida, centrifugue a 125 vezes G por cinco minutos após a centrifugação, ressuspenda as células a 10 milhões de células por mililitro em PBS contendo 0,1% BSA em um classificador de células. Use células não RFP para determinar os parâmetros de classificação. Em seguida, colete células que expressam alta RFP usando um laser de 561 nanômetros para enriquecer as células-tronco cancerígenas.

Trate SCV três, SCV três RFP ou O tosse 4 2 9 linhagens celulares com 20 micromolares de cisplatina quimioterápica por 72 horas. A próxima tripsina são as células e a cultura de células sobreviventes em meio CSC. Troque o meio a cada dois dias centrifugando as células a 125 vezes G por cinco minutos e Resus suspendendo o pellet em meio CSC fresco verifique a viabilidade das células a cada dois dias, contando as células e realizando a exclusão do azul trian.

Colete CSCs para experimentos posteriores centrifugando como antes e suspendendo novamente o pellet na solução apropriada. Monitora a morfologia das células CSC usando um microscópio óptico com ampliações de 20 x e 40 x. Para caracterizar as CSCs primeiro, coletar três preparações de CSCs centrifugando meios contendo células a 125 vezes G por cinco minutos.

Em seguida, ressuspenda o pellet em uma solução de fenol contendo tiocianato de índio gu. Para extração de RNA, sintetize DNA complementar ou CD NA de 0,1 a um micrograma de RNA usando um kit de transcrição reversa de CDNA disponível comercialmente. Em seguida, execute a reação em cadeia da polimerase transcrita reversa quantitativa, abreviada Q-R-T-P-C-R conforme detalhado no protocolo de texto.

Execute todos os Q-R-T-P-C-R em duplicata para cada amostra usando um termociclador de PCR em tempo real capaz de detectar vários fluoróforos. Como etapa final, normalize a expressão gênica de células-tronco para liberar a expressão de DH para cada amostra. Usando o método delta delta CT

Colha CSCs coletando meios contendo células e centrifugando a 125 vezes G por cinco minutos. Adicione 500 microlitros de uma solução de descolamento celular não proteolítico para quebrar as células antes de centrifugar novamente para remover a solução de descolamento celular. Em seguida, lave as células duas vezes com PBS frio.

Incube as células em meios de crescimento normais por uma hora antes de rotular as células depois de girar as células. Como antes, ressuspenda as células em PBS com 0,1% BSA contendo anti CD 1 33 PE e anti CD one 17 FE. Em seguida, fixe as células durante a noite em formaldeído 1% Para, realize citometria de fluxo para analisar a expressão da superfície celular CD um 17 e CD 1 33. Colete dados sobre células nos canais FL um e FL três e gere portas para células que expressam fits E e pe.

Gere um gráfico de pontos com quatro quadrantes e determine o número de células em cada placa de quadrante. 5.000 células por poço para cada variante de célula em placas de 96 poços durante a noite. Em seguida, trate as células com várias concentrações de cisplatina ou paclitaxel por 96 horas.

Após 96 horas, adicione 10 microlitros de 10 miligramas por mililitro. O MTT incuba a 37 graus Celsius por duas a quatro horas até que o precipitado se forme para solubilizar. MTT. Adicione o solvente MTT uma solução contendo ácido clorídrico quatro milimolares e 0,1% NP 40 em isopropanol.

Após a incubação por 15 minutos no escuro, leia as placas a 570 nanômetros em um leitor de placas para demonstrar que as CSCs foram isoladas de linhagens de células epiteliais de câncer de ovário usando tratamento com cisplatina. As imagens das linhagens celulares foram adquiridas antes do tratamento e após a seleção, a microscopia de luz capturou imagens de aderência. As células SCV três e OCA 4 2 9, bem como as CSCs SCV três e OCA 4 2 9 CSCs parecem redondas e não se ligam às placas de cultura de tecidos.

SCV três células transduzidas com RFP retêm sua fluorescência após o isolamento das CSCs, demonstrando que as células são viáveis. Viável. As culturas de CSC foram avaliadas quanto à sua resposta à terapia medicamentosa. As CSCs demonstraram aumento da resistência à expressão de cisplatina e paclitaxel de genes de células-tronco.

CD 1 33 NEIN nano e T quatro foram examinados. Em experimentos iniciais. T quatro nano e neína foram elevados em S SCV três culturas de CSC em comparação com não tratadas, mas os resultados não foram estatisticamente significativos.

CD 1 33 foi significativamente induzido em SCV três culturas de CSC em comparação com células não tratadas. Ao repetir esses experimentos, T quatro e nano aumentaram em S SCV três CSCs em comparação com as células de controle parental. SCV três, CSCs exibem expressão aumentada da superfície celular do marcador CSC CD one 17, conforme revelado pela análise de fax Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a principal limitação deste protocolo é o período de tempo que o CSC permanece viável.

Usando este protocolo, o CSC permanece viável por menos de uma semana. Portanto, os tipos de experimentos e análises para os CSCs precisam ser cuidadosamente cronometrados. Não se esqueça que trabalhar com cisplatina pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de roupas de proteção e evitar o contato com a pele e as membranas mucosas devem sempre ser tomadas seguindo este procedimento.

Outros métodos, como a exclusão do azul de triam, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a viabilidade da célula, bem como limitar os ensaios de diluição para demonstrar as características promotoras de tumor das CSCs após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do câncer explorarem caminhos que levam à resistência à quimioterapia.