Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

O cancro é uma doença complexa que é influenciada pelo tecido circundante do tumor, bem como pro- local e anti-inflamatórias mediadores. Portanto, os modelos de injeção ortotrópicas, ao invés de modelos subcutâneos pode ser útil para estudar a progressão do câncer de uma forma que melhor mimetiza patologia humana.

O objetivo geral deste procedimento é investigar a progressão das células mamárias após o enxerto de células tumorais na almofada de gordura de memória do camundongo. Isso é feito injetando células de câncer de mama na almofada de gordura da memória de um camundongo adulto e, em seguida, medindo o volume do tumor com um paquímetro em níveis de tempo predeterminados. Ao final do experimento, a massa e o volume do tumor foram determinados e o sangue e os pulmões do animal foram colhidos para posterior análise.

Em última análise, macro e micro metástases podem ser quantificadas por análise visual e imuno-histoquímica, respectivamente. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a injeção de células tumorais subcutâneas, é que o local da injeção da almofada de gordura mamária imita o local original da formação do tumor de mama, produzindo resultados mais confiáveis. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do câncer de mama, como qual tumor, supressores, oncogenes ou componentes do compartimento estromal estão envolvidos na progressão do câncer.

Um dia antes do procedimento, raspe os camundongos gama N-O-D-S-C-I-D do quarto mamilo até a linha média e pese-os para verificar se todos os animais têm pesos aproximadamente comparáveis. No dia seguinte, lave uma cultura de células de adenocarcinoma de mama humano uma vez com PBS e, em seguida, tripse as células quando a maioria das células se desprender. Extinguir a reação com 10 mililitros de soro contendo meio DMEM e, em seguida, girar as células por sete minutos a 1.200 RPMs à temperatura ambiente, lavar o pellet para remover qualquer vestígio de soro e, em seguida, ressuspender o segundo pellet em PBS.

Após a contagem, alíquota das células em concentrações de 500.000 por 150 microlitros em tubos de microcentrífuga estéreis no gelo. Em seguida, encha um tubo cônico de 50 mililitros com 35 mililitros de PBS e outro com 70% de etanol e mergulhe cotonetes em cada um. Quando todas as ferramentas estiverem prontas para cada animal, aplique pomada oftálmica nos olhos do animal.

Em seguida, use fita adesiva para conter suavemente um mouse anestesiado em uma almofada de aquecimento e confirme a sedação beliscando o dedo do pé. Use um cotonete embebido em etanol para limpar a área raspada e, em seguida, use uma lâmina de bisturi para fazer uma pequena incisão entre o quarto mamilo e a linha média. Insira o cotonete embebido em PBS na incisão para fazer um bolso e, em seguida, use uma pinça para expor uma almofada de gordura de memória, que pode ser detectada por sua cor branca.

Use outra pinça para apertar a almofada de gordura em sua base e expor totalmente o tecido. Em seguida, pipete as células de adenocarcinoma para cima e para baixo algumas vezes para fazer uma solução celular homogênea e aspire suavemente 150 microlitros de células em uma seringa de insulina. Tomando cuidado para segurar uma seringa horizontalmente com o orifício da agulha voltado para cima.

Injete as células na almofada de gordura mamária, confirmando uma injeção bem-sucedida por inchaço do tecido. Em seguida, solte a almofada de gordura suavemente e use uma pinça de mosquito para suturar a incisão, girando a sutura ao redor da pinça de mosquito no sentido horário, anti-horário e horário para fazer três nós. Após a cirurgia, injete um analgésico e coloque cada animal em decúbito esternal em uma gaiola individual, monitorando os camundongos até que estejam totalmente recuperados.

Oito semanas após a implantação da célula, os camundongos são preparados para a colheita do órgão. Fixe o animal em uma base de espuma e use paquímetros para medir o volume do tumor. Em seguida, faça uma longa incisão vertical na linha média e, em seguida, faça duas incisões horizontais logo abaixo da perna da frente e acima da perna de trás.

Prenda a pele na espuma para expor o tumor e, em seguida, use uma tesoura para dissociar o tumor da pele. Em seguida, remova suavemente os pulmões, colocando o pulmão esquerdo na solução de Bowen por três dias, após os quais esse folky metastático superficial se tornará claramente visível a olho nu, congelará parte do tecido em nitrogênio líquido para posterior isolamento de RNA e colocará a parte restante do tumor em um dos tubos cônicos preenchidos com formina. Em seguida, após o sacrifício do animal por punção cardíaca, dispensou a amostra de sangue de 450 microlitros em um tubo de microcentrífuga contendo 50 microlitros de citrato de sódio a 3,2%, em seguida, girou os glóbulos vermelhos e armazenou as amostras de plasma a 20 graus Celsius negativos até que erros experimentais de uso posterior, como uma inoculação imprecisa das células ou vazamento, possam levar a variações no tamanho do tumor ou até mesmo à ausência de um tumor, levando a a formação de uma estrutura que parece semelhante à memória.

Almofada de gordura injetada com tampão de controle. A taxa de crescimento do tumor também depende da natureza da linha celular injetada e, em geral, pode ser observada através da pele do camundongo. Além disso, a área ao redor do tumor pode apresentar grandes vasos que surgem da remodelação vascular e que podem desempenhar papéis cruciais na remoção de resíduos e no fornecimento de nutrientes e oxigênio ao tecido tumoral.

Ao contrário dos experimentos in vitro, a taxa de crescimento das células tumorais pode não ser constante no tempo in vivo devido à hipóxia e à falta de nutrientes. Áreas necróticas podem se formar dentro do tecido circundante, e essas áreas afetarão a taxa de crescimento do tumor. Além disso, as células injetadas que expressam genes específicos de interesse podem afetar a progressão do câncer, pois os genes podem induzir o crescimento do tumor que começa rapidamente, mas diminui no final ou vice-versa.

A coleta dos pulmões na solução de Bowen ajuda a visualizar os focos metastáticos superficiais, que aparecem como formações pálidas elevadas na superfície do tecido pulmonar. A formação de focos depende da linhagem celular. Células não agressivas podem dar origem apenas a micrometástases, que podem ser facilmente identificadas com coloração h e e no tecido pulmonar embebido em parafina.

Após este procedimento, outros métodos como o Eliza podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o crescimento do tumor experimental afeta os níveis de citocinas ou moléculas pró-angiogênicas no plasma.