Geração de Genomic Eliminações em linhas celulares de mamíferos através CRISPR / Cas9

O objetivo geral deste procedimento é usar o sistema de nuclease CRISPR Cas nove para criar deleções genômicas. Primeiro eletro purificado, os dois plasmídeos CRISPR e um plasmídeo repórter GFP simultaneamente nas células. Em seguida, usando a classificação de células ativadas por fluorescência, isole os 3% superiores das células que expressam GFP.

Em seguida, coloque as células classificadas na diluição limite e rastreie clones de deleção bioalélica usando PCR convencional. Em última análise, o CRISPR Cas nine pode ser usado para estudar genes e elementos genéticos, produzindo alelos de deleção de perda de função Em comparação com as mutações frameshift produzidas por um único RNA guia, grandes deleções geradas pelo sistema de nuclease CRISPR Cas nine podem ajudar a garantir a perda de mutações funcionais. Essa abordagem também permite uma triagem fácil e barata por meio de uma PCR convencional.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando descobrimos que a triagem de pequenos indels criados por um único RNA guia é tecnicamente desafiadora, trabalhosa e cara, os alelos de deleção também são particularmente informativos para o estudo de elementos genéticos sem revestimento. Para cada pellet de par CRISPR, duas vezes 10 elevado às seis células cultivadas em suspensão. Ressuspenda as células em 100 microlitros de solução de eletroporação e depois transfira para um QAT de eletroporação.

Adicione cinco microgramas de CRISPR Cas nove construa SG RNAA cinco microgramas de CRISPR Cas nove. Construa SG a, B e 0,5 microgramas da expressão GFP, construa a pipeta para cima e para baixo várias vezes suavemente para misturar. Tente evitar a produção de bolhas usando um sistema de eletroporação.

Eletropurar as células com 250 volts por cinco milissegundos em um vete de dois milímetros com uma pipeta de transferência estéril e transferir imediatamente a solução para um mililitro de meio de cultura pré-aquecido. Incube as células a 30 graus Celsius por 24 a 72 horas. Passe as células por um filtro estéril de 50 mícrons para um tubo de fax.

Em seguida, classifique por fax os 3% principais das células positivas para GFP para enriquecer as células que receberam altos níveis de plasmídeos. Depois de otimizar as condições de diluição limitantes para as células de interesse, a placa classificou as células em uma placa de 96 poços e uma diluição de 30 células por placa com 100 microlitros de meios de cultura de células por poço. Para as células a granel classificadas restantes, congele metade das células para revestimento futuro.

Coloque a outra metade para triagem e validação do primer. Incube essas células a 37 graus Celsius por três a sete dias. Deixe os clones incubarem a 37 graus Celsius por sete a 14 dias, dependendo do tempo de duplicação da linhagem celular.

Usado para isolar o DNA genômico Resus, suspender os pellets parentais e de células em massa em 50 microlitros de solução de extração de DNA. Execute a amostra em um termociclador para extrair o DNA genômico. Em seguida, meça a concentração de DNA.

Agora monte uma reação de PCR de 20 microlitros combinando 10 microlitros de duas misturas XPCR. 0,5 microlitros de primer direto de 10 micromolares 0,5 microlitros de primer reverso de 10 micromolares, 50 a 100 nanogramas de DNA genômico e água de até 20 microlitros. Realizar PCR para a banda de não deleção e a banda de deleção em reações separadas.

Em seguida, coloque as amostras em um termociclador e execute usando 35 ciclos com uma temperatura de ajoelhado A de 60 graus Celsius, conforme detalhado no protocolo escrito que acompanha. Resolva as amostras em um gel de aros a 2% a 10 volts por centímetro usando um tampão XTAE. Em seguida, examinar as amostras para verificar a presença ou ausência de bandas de não exclusão e de eliminação.

Considere uma estratégia para multiplexar os pares de primers de PCR de deleção e não deleção em uma única reação. Alternativamente, você pode executar reações de PCR de exclusão e não exclusão separadamente. Para células em suspensão, transfira todos os clones para uma única placa de 96 poços que já contém 50 microlitros de meios de cultura de células por poço.

Em seguida, transfira 50 microlitros de cada poço para uma placa de PCR de 96 poços. Alternativamente, para células de aderência, tripsina, olhos, clones antes da transferência para uma única placa de 96 poços. Em seguida, transfira 50 microlitros de cada poço para uma placa de PCR de 96 poços, centrifugue a placa de PCR a 400 vezes G por cinco minutos e remova o sobrenadante sacudindo a placa de PCR sobre uma pia.

Agora adicione 50 microlitros de solução de extração de DNA por poço e ressuspenda os grânulos de células após a extração de DNA genômico, execute reações de PCR para detectar bandas de não deleção e deleção dos clones. Resolva os produtos de PCR em um gel 2% aros a 10 volts por centímetro. Usando um buffer XTAE.

Identificar os clones com a deleção desejada e amplificar as culturas numa placa ou balão maior. No exemplo, observamos das células parentais da esquerda para a direita, três clones de não deleção, três clones de deleção monoalélica e três clones de deleção bialélica. O uso de vários pares SG r NNA não sobrepostos pode ajudar a controlar os efeitos fora do alvo.

Cada par levaria à produção de uma exclusão exclusiva. O ponto de interrupção visando pares SG em vários locais em relação ao gene pode ser usado para excluir todo o corpo do gene para criar indels frameshift, mesmo que um ou ambos os alelos não tenham sido excluídos ou para permitir a interrupção de uma isoforma específica. Neste experimento.

Em relação à deleção de todo o gene, PIM um dois pares de RNA SG foram projetados clonados no vetor de expressão PX 3 3 0 e entregues às células MEL por eletroporação. Junto com o repórter GFP, os 3% principais das células positivas para GFP foram plaqueadas clonalmente na deleção limitante e rastreadas por PCR para clones de deleção mono alélica e bioalélica sem deleção para esta deleção PIM um. Os clones de deleção bioalélica foram selecionados para posterior proliferação após cinco dias para expansão.

Cada clone foi retestado por PCR de DNA genômico para confirmar a deleção e deleção de BIC. Os amplicons foram submetidos ao sequenciamento de Sanger para identificar a deleção precisa. O RNA foi isolado de clones de deleção BIC e analisado por R-T-Q-P-C-R para confirmar a perda de expressão de PIM um.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em questão de semanas para identificar clones de deleção vital. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o sistema CRISPR CAS de nove nucleases para criar deleções genômicas por meio de plasmídeos CRISPR, classificação de células brilhantes GFP e triagem de clones individuais por PCR convencional para clones de deleção BioE.