Um Ex Vivo Induzida por laser Lesão Medular modelo para avaliar mecanismos de axonal Degeneration em tempo real

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar os mecanismos de degeneração axonal aguda em tempo real. Isso é conseguido isolando o tecido neurológico e da medula espinhal positivo para uma coxa, enquanto perfunde continuamente o tecido com líquido cefalorraquidiano artificial oxigenado com baixo teor de cálcio. Em seguida, o tecido da medula espinhal é alinhado sob uma objetiva de microscópio de dois fótons, mantendo as condições fisiológicas, e a mielina é corada com o corante fluorescente lipofílico vermelho Nilo.

Em seguida, uma lesão de tamanho micros é criada na superfície dorsal de uma coluna dorsal, ajustando a potência do laser para transeccionar axônios mielinizados dentro das colunas. Os resultados mostram retração dos axônios danificados, periaxonal, inchaço da mielina e outras respostas celulares com base em medições quantitativas das imagens. Portanto, a principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que usamos toda a medula espinhal cervical e, portanto, as fibras da coluna dorsal permanecem intactas.

Portanto, isso evita danos às fibras mielinizadas centrais subjacentes, o que geralmente ocorre durante a preparação da tira de substância branca. Demonstrando este procedimento estará o Dr. Starlin ada, um pós-doutorando em meu laboratório que realmente defendeu essa técnica para se preparar para a perfusão intracardíaca. Faça baixo teor de cálcio, líquido cefalorraquidiano artificial ou A CSF com duas vezes concentrado em soluções BNC para profusão da medula espinhal ex vivo.

Durante a imagem, prepare o LCR A normal com duas vezes as soluções estoque A e B em um frasco de vidro. Ofereça essas soluções para pH 7,4. Mantenha o LCR A com baixo teor de cálcio resfriado perto da área de dissecção e mantenha o LCR A normal em temperatura ambiente perto do microscópio.

Borbulhe ambas as soluções com carro e gasolina por meia hora antes de usar e borbulhe-as continuamente enquanto estiverem em uso. Em seguida, prepare a câmara de perfusão do banho aberto para a imagem. Primeiro, conecte a saída de metal dos aquecedores em linha à câmara.

Em seguida, cole a câmara de imagem à câmara de derramamento com uma boa quantidade de material pegajoso para que haja um potencial de ajustar ligeiramente a posição da câmara de imagem. Prenda a sonda de temperatura de feedback dos aquecedores em linha perto da entrada do fluido e prenda o tubo de sucção de aço inoxidável à linha de vácuo na saída da câmara. Agora ligue a bomba de vácuo e a bomba de perfusão.

Assim que a câmara se encher com A CSF, reduza a bomba para 1,5 a dois mililitros por minuto. Em seguida, controle o volume A CF na câmara pela posição da linha de vácuo. Para ajustar a eutanásia de seis a 10 semanas de idade, um camundongo transgênico YFP.

Primeiro, confirme se não há resposta reflexiva de beliscão do dedo do pé. Em seguida, raspe a área que cobre a medula espinhal e o cérebro. Após o barbear, limpe a pele exposta com Betadine e etanol 70%.

Agora borrife o peito e a área abdominal com 70% de etanol e perfunda o animal trans Cardi com carbogênio borbulhante com baixo teor de cálcio A CSF. Quando o fígado começar a empalidecer, prenda a agulha de perfusão no coração com um clipe. Em seguida, vire o animal e limpe o lado da pele dorsal com etanol a 70%.

Faça uma incisão ao longo da linha média do nariz ao quadril para expor a calota craniana e o tecido acima das vértebras. Use alfinetes para afastar a pele e prender o animal no nariz e no ombro. Agora mova a preparação para um microscópio de dissecção com uma tesoura firmemente cortada na superfície dorsal do crânio no nível dos bulbos olfatórios.

Insira a ponta da tesoura na incisão recém-feita e corte ao longo de ambas as bordas da calota craniana para expor o cerebelo. Não extirpar completamente a calota craniana. Levante a calota craniana expondo o cérebro e corte cuidadosamente as bordas esquerda e direita do osso interparietal sobre o cerebelo.

Agora, enquanto puxa suavemente a calota craniana e a superfície da coluna vertebral dorsal, faça cortes logo abaixo das raízes nervosas posteriores para expor ainda mais a medula espinhal. Em seguida, usando uma tesoura de ponta fina, corte cuidadosamente as vértebras bilateralmente. Em um ângulo de 45 graus, é vital evitar danos às colunas dorsais.

Essas fibras brancas brilhantes são facilmente danificadas sem ser cuidadoso, continuando a puxar suavemente o osso e o músculo excisados enquanto corta as vértebras. Corte de um a dois centímetros para isolar um segmento de tecido da medula espinhal cervical adequado para imagens. Em seguida, use uma tesoura para cortar o tecido e o osso paralelos à coluna vertebral.

Limpe também o tecido embaixo da coluna. Faça esses cortes o mais nivelados possível, pois é muito importante que o tecido fique plano no nível da câmara para obter imagens. Finalmente, use o bisturi número 11 para transeccionar o tronco encefálico após a terminação das fibras da grama e no nível torácico superior.

Em seguida, use uma tesoura para cortar o tecido e o osso nesses dois pontos. O tecido isolado deve conter dois terços da coluna vertebral abrangendo o tronco encefálico cordal, o aumento cervical e a medula espinhal torácica superior. Transfira a coluna vertebral isolada para a câmara de imagem ex vivo e aumente gradualmente a temperatura perfuse oito para entre 36 e 37 graus Celsius na próxima hora.

Mantenha essa temperatura durante a geração de imagens. Um aspecto crítico deste protocolo é garantir que você isole a medula espinhal sem danificar as fibras da coluna dorsal. O segundo aspecto mais crítico deste protocolo é garantir que a medula espinhal seja continuamente perfundida com líquido cefalorraquidiano artificial oxigenado.

Usando um suporte de lâmina de tecido modificado, prenda cuidadosamente a coluna vertebral na câmara. É importante evitar tocar na medula espinhal exposta, nas colunas dorsais ou pressioná-las com os fios liker. Agora, para corar a mielina, interrompa brevemente o fluxo da solução e remova a linha de vácuo.

Adicione cinco a 10 microlitros de corante vermelho do Nilo de cinco milimolares perto da extremidade cordal da medula espinhal. Em seguida, misture a solução suavemente em toda a câmara de imagem e deixe o tecido incubar por um ou dois minutos. Uma vez corado, retorne o fluxo de LCR A oxigenado entre 1,5 e dois mililitros por minuto e substitua a linha de vácuo usando um microscópio de dois fotos.

Imagem da medula espinhal usando uma objetiva de imersão em água. Abaixe lentamente a objetiva até a superfície do LCR A e, em seguida, coloque a medula espinhal em foco sob luz fluorescente AF. Agora mude para o modo de varredura para obter imagens de linha de base da grama ascendente.

Fibras mielinizadas do óculo. Para excitar o YFP e o vermelho do Nilo, defina a excitação para 950 nanômetros e isole as emissões fluorescentes com filtros DI crônico e de passagem de curvatura. Se dentro de uma hora após a imagem você notar que mais de 3% dos axônios têm esteróides, isso significa que a medula espinhal foi danificada durante o isolamento.

Agora é melhor descartar a preparação Para ferir o tecido com o laser. Primeiro, localize uma área do tecido que pareça estar nivelada. Em seguida, aumente a ampliação da área de visualização para 30,3 x.

Ajuste o laser para 800 nanômetros e aumente sua potência para cerca de 110 miliwatts. Agora execute cinco varreduras a laser de campo de visão. Os resultados devem ser uma ablação completa de 20 mícrons de diâmetro.

Verifique a lesão em configurações de imagem padrão com o laser em 17 miliwatts e em 20,08 x de aumento. Se as fibras axonais na ablação não estiverem completamente seccionadas, descarte a preparação. Agora, use as configurações de lapso de tempo com capturas Z para fazer gravações dinâmicas de resposta a lesões.

A preparação pode ser visualizada por até 24 horas. Um segmento da medula espinhal foi isolado e posicionado conforme descrito na linha de base T-P-L-S-M. O registro mostra saxões articulares de grama mielinizada como axônios positivos para YFP alinhados paralelamente na bainha dinar mielina corada de vermelho com poucos esteróides axonais ou outros sinais morfológicos de degeneração axonal.

Detalhes finos podem ser vistos, como o nariz da ADM VA destacado por pontas de setas. 40 minutos depois, após lesão medular induzida por laser. A maioria dos axônios seccionados forma bulbos terminais axonais característicos e se retrai do local da lesão, os axônios adjacentes ao local da lesão sofrem degeneração secundária e o inchaço axonal tornou-se mais proeminente.

Ao contrário das fibras retráteis trimestrais, a maioria dos bulbos axinais retraídos localizados distalmente da lesão e dos esteróides foram fortemente marcados com Vermelho do Nilo, sugerindo uma mudança ambiental dentro do axônio. Às sete horas, os axônios continuaram se retraindo para longe do local da lesão. No entanto, isso é mais evidente em bulbos terminais localizados distais ou rostral da lesão do que em bulbos terminais localizados proximais ou cortais à lesão.

Em última análise, os axônios que foram inicialmente poupados gradualmente sofreram degeneração secundária retardada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como isolar o neuro e a medula espinhal e realizar uma lesão da medula espinhal induzida por laser. Portanto, você poderá examinar os aspectos dinâmicos da degeneração axonal primária e secundária em tempo real.

As informações obtidas com o uso deste sistema modelo podem levar a uma importante compreensão mecanicista dos danos ao axônio e à mielina após a lesão.