Cultura e Co-Culture of Mouse ovários e folículos ovarianos

O objetivo geral deste procedimento é cultivar ovários neonatais e/ou folículos ovarianos individuais in vitro. Isso é feito dissecando primeiro os ovários de fêmeas frias da idade apropriada. O segundo passo é preparar o tecido, incluindo a dissecção fina de folículos ovarianos individuais com agulhas de acupuntura.

Em seguida, os ovários neonatais ou folículos pré-antrais individuais são cultivados com alimentação regular, e a etapa final é fixar ou congelar o tecido para análise histológica ou molecular. Em última análise, o sistema de cultura suporta o desenvolvimento de uma maneira altamente fisiológica e pode ser usado para examinar a regulação do desenvolvimento do folículo ovariano e para investigar as interações entre os folículos ovarianos primordiais e em crescimento. A principal vantagem desta técnica é que os folículos ovarianos intactos são suportados através do desenvolvimento folicular, mantendo sua estrutura tridimensional sem a necessidade de matrizes de suporte.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia ovariana e também a ajudar a investigar os efeitos de compostos tóxicos, como quimioterapia, drogas no ovário e, portanto, na fertilidade feminina. Primeiro tivemos a ideia de co-cultivar diferentes idades e, portanto, estágios dos folículos ovarianos ao discutir como investigar os efeitos do crescimento de folículos no pool de folículos primordiais em repouso, Demonstrando a técnica ao lado de Steph Morgan e Lisa Campbell estarão Vivian Allison, uma técnica do laboratório e Allison Murray, que foi uma cientista de pós-doutorado no laboratório por muitos anos. Ambos ajudaram a desenvolver aspectos-chave da técnica Para puxar as pipetas para este protocolo.

Aqueça e dobre as pipetas de vidro sobre uma chama e faça um corte limpo usando um cortador de vidro. Em seguida, esterilize o vidro curvo a 160 graus Celsius por cerca de 45 minutos. É preciso prática para obter a curva certa na pipeta para sua técnica.

Sempre corte a pipeta com um cortador de vidro para que não haja vidro irregular. Você também quer garantir que você tenha a extremidade com o diâmetro certo para o seu tecido Construído para esterilizar o meio de dissecção feito de meio lebowitz L 15 com BSA através de um filtro de 0,2 mícron. São 25 milímetros de diâmetro construídos para esterilizar a cultura do ovário neonatal.

Passe por outro filtro de 0,2 mícron com apenas 25 milímetros de diâmetro e colete-o em um tubo estéril. Em seguida, adicione um mililitro do meio neonatal a cada poço de 24. Placa de poço e transfira uma membrana para a superfície do meio em cada poço.

O meio de cultura folicular também é esterilizado por filtro como o meio de cultura do ovário. Em seguida, o óleo de silicone também deve ser esterilizado por filtro. Em seguida, repare 96 placas de cultura de poço com gotas de 30 microlitros do meio folicular ao longo da linha superior.

Cubra cuidadosamente esses poços com 70 microlitros de óleo de silício. Alternativamente, a co-cultura de folículo folicular requer 100 microlitros de meio com uma sobreposição de 100 microlitros de óleo de silício. Em seguida, prepare placas de co-cultura de ovário folicular com um mililitro de meio por poço e uma membrana nuclear esterilizada por UV com muito cuidado.

Comece transferindo um mililitro de meio de dissecção para cada placa de embrião de vidro estéril. Depois de colorir os filhotes de zero a cinco dias pós-parto, segure a pele que cobre a parede abdominal com uma pinça fina e inci a pele e a parede corporal. Abra esta grande incisão expondo o abdômen.

A bexiga geralmente é ingurgitada nesta fase e pode ser perfurada para facilitar a dissecção. Usando uma pinça de relojoeiro, afaste as entranhas. Em seguida, de cada lado, siga os chifres uterinos da bexiga até o rim.

O ovário é uma estrutura semelhante a uma nuvem localizada logo abaixo do rim, na parte superior do útero. Segure o ovário com cuidado e usando uma tesoura. Corte-o do útero.

Depois de dissecar os dois ovários, transfira-os para pratos cheios de dissecção quente. Média. Use um microscópio de dissecção com platina aquecida a 37 graus Celsius para dissecar os ovários usando agulhas de insulina. Apare o saco basal e qualquer excesso de material, incluindo a trompa de Falópio, até que apenas o ovário permaneça.

Em seguida, transfira cada ovário para o poço de uma placa preparada usando uma pipeta curva. Coloque um ovário em cada cultura de membrana, o tecido trocando metade do meio em dias alternados por até seis dias ao trocar o meio, coloque a ponta da pipeta na borda do poço do meio para evitar perturbar a membrana. Após a cultura, os ovários podem ser armazenados congelados ou fixados ou histologia ou imunoquímica.

Depois de coletar os ovários de camundongos mais velhos em um prato de meio de dissecção quente, remova o Basa ovariano. Use agulhas de insulina para aparar o saco basal e qualquer excesso de material, incluindo a trompa de Falópio, até que apenas o ovário permaneça. Em seguida, corte os ovários ao meio usando as agulhas e transfira cuidadosamente cada metade para um vidro de relógio individual contendo um mililitro de meio de dissecação.

Cubra os óculos do relógio com uma lâmina de vidro e guarde-os no forno por até uma hora o mais rápido possível. Trabalhando sob um microscópio com um estágio aquecido em uma capela de fluxo de lâmina, disseque os ovários em pedaços grandes usando agulhas de insulina para identificar folículos pré-antais tardios. Os folículos pré-antal contêm duas a três camadas de células de granulose e têm um diâmetro de cerca de 180 a 200 micrômetros.

Disseque qualquer um deles usando uma agulha em linha e uma agulha de acupuntura presa por um porta-agulha, evite danificar a lâmina basal, mas certifique-se de remover o estroma S circundante. Isso requer prática. O folículo precisa de algum tecido fecal, mas não muito.

Além disso, se o processo de dissecção for muito áspero, o folículo será danificado e se romperá ou morrerá. Durante a cultura, o usuário preparou o perpe para transferir cuidadosamente os folículos para um novo vidro de relógio cheio de meio. Mantenha os folículos na seção de calibre fino do perpet usando uma ocular calibrada instalada em um microscópio de dissecação.

Meça os folículos. Se eles estiverem a menos de 10 micrômetros de um diâmetro de 190 micrômetros. Eles podem ser usados para cultura, descartar os outros folículos dos folículos selecionados.

Escolha apenas o mais saudável para cultivar. Eles devem ser translúcidos, sem áreas reticentes mais escuras, ter um laminar basal intacto e algum tecido tecal anexado. Um bom rendimento é de 10 a 15 folículos por ovário.

Agora, usando um perpe curvo preparado, transfira esses folículos para a placa de cultura de 96 poços preparada. Coloque um folículo em cada poço abaixo da camada de óleo e da cultura. Os folículos duram até seis dias todos os dias.

Prepare uma nova linha com mídia. Uma hora ou mais depois, transfira os folículos para a próxima linha de meios frescos e equilibrados ou coculturas de folículos foliculares cultive dois folículos lado a lado em um. Bem, em vez de transferências, use uma ponta de gel fina para trocar metade do meio a cada dois dias.

Para o ovário folicular, as coculturas transferem um folículo para um ovário neonatal colocado em uma membrana em uma placa de cultura, coloque cuidadosamente o folículo ao lado de um pólo do ovário neonatal para que possam ser colocados em contato um com o outro. Mantenha essa cultura por até cinco dias. Substituindo 500 microlitros do meio em dias alternados.

Os folículos pré-antal geralmente ficam encapsulados pelos ovários neonatais. Durante essa cultura, os ovários neonatais de recém-nascidos foram cultivados por seis dias e expostos a tóxicos reprodutivos. No segundo dia de cultivo, os tecidos foram processados para determinar o número e a saúde dos diferentes estágios dos folículos.

Um tóxico investigado foi a cisplatina. O outro tóxico investigado foi a doxorrubicina. Um experimento diferente investigou o efeito do hormônio folículo estimulante da gonadotrofina e do hormônio luteinizante no crescimento de folículos individuais.

Mas o tamanho do folículo dessa análise foi medido periodicamente para mapear seu crescimento. A co-cultura de folículos foliculares foi investigada usando um folículo que expressa GFP e um folículo selvagem O processamento imuno-histoquímico desta co-cultura revelou que os processos de GFP estavam dentro dos tipos selvagens.

Os ovários neonatais da camada tecal e do tipo selvagem também foram co-cultivados com o folículo que expressa GFP. Nesse cenário, os processos de GFP migraram através do interstício ovariano. A cultura do ovário neonatal é um método bastante simples, mas espere passar algum tempo dominando a técnica de dissecar folículos pré-antrais intactos e intactos.

Isso é essencial para o seu desenvolvimento adequado. Após a cultura folicular, os oócitos podem ser fertilizados por fertilização in vitro, após a qual os embriões podem ser transferidos para fêmeas pseudo-grávidas e filhotes vivos obtidos.