Manipulação e In Vitro Maturação Xenopus laevis Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

O objetivo do experimento a seguir é derrubar proteínas maternas armazenadas em oócitos ou superexpressar proteínas de interesse no ponto de fertilização de ovos de rã. Isso é obtido injetando oligos antisense ou mRNA em oócitos imaturos desregulados enzimaticamente para degradar ou superexpressar uma proteína específica. Como segunda etapa, os oócitos são transferidos para o meio contendo progesterona, que induz a maturação dos oócitos em óvulos.

Em seguida, o esperma é injetado nos óvulos maturados in vitro para observar o efeito do knockdown ou superexpressão no desenvolvimento embrionário. Em última análise, o desenvolvimento de oócitos oligo injetados em girinos nadadores é o teste funcional de knockdown ou superexpressão de genes. A principal vantagem desta técnica sobre os vasos existentes, como o hospedeiro para transferir, é que podemos pular o processo de cirurgia de sapo usando protocolos padrão.

Colete uma obra sobre SAC contendo citos saudáveis em uma placa petro de nove centímetros contendo MBS mais ps. Em seguida, separe o ovário em pedaços quadrados de um a dois centímetros de largura. Colete cerca de cinco mililitros do ovário rasgado com citos em um novo tubo de 50 mililitros.

Em seguida, enxágue os tecidos com MBS mais PS algumas vezes e colete os ovos em 15 mililitros de MBS fresco mais ps. Agora, adicione sete unidades de enzima de desfolha à suspensão e incube a suspensão com vegetação suave até que estejam pelo menos parcialmente desfolhadas. Isso levará pelo menos uma hora após a incubação.

Encha o tubo com MBS mais Ps para interromper a reação. Puxe a solução para a parede do tubo e não diretamente para os citos. Deixe os lenços assentarem e descarte a sopa e o agente.

Citos pequenos e imaturos flutuam e também devem ser descartados. Repita esta etapa de lavagem um total de 10 vezes após as lavagens. Transfira os citos para um prato de nove centímetros com MBS mais ps.

Transfira o prato para um microscópio de dissecação e, daqui em diante, mantenha os citos a 16 a 18 graus Celsius, tanto quanto possível. Selecione citos de estágio seis de boa qualidade usando a classificação Dumont usando uma pipeta de vidro, colete-os em um novo prato com MBS mais ps. O cyte de boa qualidade deve ter pigmentação uniforme no hemisfério animal e mostrar uma separação clara entre o hemisfério animal e vegetal.

Eles também devem ter aproximadamente o mesmo tamanho, que teria entre 1,2 e 1,4 milímetros de diâmetro. Colete cerca de dois a 300 citos para cada injeção, perfazendo cerca de 1000 citos por experimento. A qualidade do site O é a chave para o sucesso.

Se o Oside mostrar alguma anormalidade durante a preparação, recomendo que você corrija um ovário de um rebanho diferente e comece de novo. Em preparação para a injeção do oligo antisense, coloque o êmbolo de metal de um microinjetor em sua posição mais baixa e insira um capilar de vidro cheio de óleo no êmbolo de metal. Sob um microscópio de dissecação, corte a ponta da agulha usando uma pequena tesoura cirúrgica.

Faça uma gorjeta menor possível. Próximo laser. Uma tira de paraforma no microscópio stage e sobre ele Dispense três microlitros de solução de ácido nucleico a um micrograma por microlitro.

Com isso, encha a ponta da agulha. Se o ar estiver sendo retido, a abertura deve ser maior. Agora faça uma marca visível na agulha de injeção a cerca de meio milímetro da ponta.

Em seguida, prossiga com a injeção dos citos para injetar um primeiro, encontre uma área livre de células foliculares onde a agulha possa penetrar nessa área. Insira a ponta ao longo do limite equatorial apontando para o ponto central sob a vesícula germinativa. Ao mesmo tempo, estabilize o cite com uma pinça no lado oposto.

Agora, usando o controle do pedal, ejete a solução, ejete entre 4,6 e 9,2 nanogramas de oligos antisense ou entre 250 picogramas a 13,8 nanogramas de RNA mensageiro. Depois de injetar todos os citos, transfira-os para o meio de incubação e deixe-os incubar por alguns dias para que as mudanças possam ocorrer. No proteassoma.

Mais tarde, transfira os citos com uma quantidade mínima de meio para pratos revestidos de agros de seis centímetros contendo cinco a oito mililitros de meio de maturação. Em seguida, deixe os citos se desenvolverem neste meio por 16 horas antes de injetá-los com esperma. Para este protocolo, o estoque de esperma congelado deve ser preparado.

Consultar o protocolo de texto após 16 horas de incubação para maturação. Com muito cuidado, transfira os citos para um prato de seis centímetros com MBS e PS para lavá-los. Se os citos forem manuseados incorretamente, eles podem se ativar espontaneamente antes do ixy.

Agora, conte os citos amadurecidos e procure manchas brancas que indiquem que a vesícula germinativa do cite se quebrou. Se menos de 80% forem bons, eles coletivamente não são saudáveis o suficiente para sobreviver ao procedimento ixy. Para prosseguir.

Encha um novo prato com meio de injeção e transfira delicadamente todos os citos para o prato após meia hora. Prossiga com a injeção dos citos maduros com solução de esperma usando a mesma preparação injetora descrita para oligos. Idealmente, deve haver um ou dois espermatozóides por 4,6 nanolitros na solução injetável.

Para testar esta solução de injeção, faça gotas de solução DPI a 0,3 microgramas DPI por mililitro e injete 4,6 nanolitros nessas gotas. Em seguida, conte o número de espermatozóides em cada gota por microscopia de fluorescência. Depois de confirmar a concentração de espermatozoides, injete os citos com 4,6 nanolitros da solução de esperma.

Certifique-se de que o tempo necessário para injetar as soluções permaneça consistente e injete os oócitos de forma constante, com o mínimo de pausa entre as injeções. Após cada troca de 100 injeções, a solução de esperma. Depois que todos os oócitos amadurecidos forem injetados, o prato deve ser incubado por quatro a cinco horas e depois inspecionado.

Para embriões que sofreram clivagem, os sulcos de clivagem podem não ser tão claros quanto os de embriões fertilizados normais, transferir todos os embriões clivados para meios de incubação e deixá-los incubar durante a noite. No dia seguinte, os embriões sobreviventes devem ser transferidos para o desenvolvimento embrionário 0,1 XMMR de embriões ioxy. O uso de oócitos maturados in vitro foi examinado em bons experimentos, quase 100% dos oócitos de vesículas germinativas responderam à progesterona e mostraram sinais de maturação.

Cerca de 25% sofreram clivagem. 60 a 80% dos embriões clivados atingiram o estágio de gás blsótico, e cerca de um terço deles atingiu o estágio de girino nadador. Os embriões ixy eram uma mistura de embriões normais e anormais, mostrando que a injeção do sogo antisense em citos vecais germinativos, seguidos por IVM e Dixie, permitiu o desenvolvimento embrionário inicial.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como manipular as proteínas maternas antes da fatoração.