Name: Manipulação e In Vitro Maturação Xenopus laevis Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprenda a manipular oócitos de Xenopus laevis para maturação in vitro e injeção intracitoplasmática de espermatozoides. Este método permite estudar o desenvolvimento embrionário e a função de proteínas maternas.

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Somos gratos aos membros do laboratório Gurdon pela discussão útil. K.M. é pesquisador do Wolfson College e é apoiado pela Herchel Smith Postdoctoral Fellowship e pela Great Britain Sasakawa Foundation. O laboratório Gurdon é apoiado por doações do Wellcome Trust (RG69899) e MRC para JBG

<ol><li>Miyamoto, K., Gurdon, J. B. Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiyamoto%2C+K+%22Biology+and+Pathology+of+the+Oocyte%3A+Role+in+Fertility%2C+Medicine%2C+and+Nuclear+Reprogramming%22">Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming</a>. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Second, Cambridge University Press. 1-11 (2013).</li>
<li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo%3A+a+novel+antisense+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).</li>
<li>Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordin+is+required+for+the+Spemann+organizer+transplantation+phenomenon+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos.</a> Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).</li>
<li>Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+requirement+for+HIRA-dependent+H3.3+deposition+revealed+at+gastrulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus.</a> Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).</li>
<li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).</li>
<li>Heasman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+cadherins+and+underexpression+of+beta-catenin+inhibit+dorsal+mesoderm+induction+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos.</a> Cell. 79 (5), 791-803 (1994).</li>
<li>Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+antisense+oligonucleotides+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The use of antisense oligonucleotides in Xenopus oocytes.</a> Methods. 51 (1), 75-81 (2010).</li>
<li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Wave1+is+required+for+reprogramming+transcription+in+oocytes+and+for+normal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development.</a> Science. 341 (6149), 1002-1005 (2013).</li>
<li>Halley-Stott, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+nuclear+transplantation+to+Germinal+Vesicle+stage+Xenopus+oocytes+-+a+method+for+quantitative+transcriptional+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming.</a> Methods. 51 (1), 56-65 (2010).</li>
<li>Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+characterizes+chromatin+presetting+by+NF1+and+Oct1+and+enhances+glucocorticoid+receptor+binding+to+the+MMTV+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter.</a> Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).</li>
<li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).</li>
<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).</li>
<li>Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+transgenesis+by+sperm+nuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection.</a> Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).</li>
<li>Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+%27autocatalytic%27+nature+of+the+maturation+promoting+factor+%28MPF%29+in+oocytes+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis.</a> Cell. 4 (3), 269-274 (1975).</li>
<li>Smith, L. D., Ecker, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+oocyte+nucleus+in+physiological+maturation+in+Rana+pipiens%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens.</a> Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).</li>
<li>Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+actin+polymerization+is+required+for+transcriptional+reprogramming+of+Oct4+by+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes.</a> Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).</li>
<li>Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+Xenopus+oocytes+using+the+host+transfer+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis).</a> Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Sakane, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+multiple+and+paralogous+genes+in+Xenopus+laevis+using+two+pairs+of+transcription+activator-like+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases.</a> Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).</li>
<li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+RNA%2FCas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Nós aqui detalhe um novo método para esgotar fatores maternos ou overexpress fatores exógenos antes da fertilização. Este sistema requer dois micro-injecções, mas em vez disso ignora a cirurgia de sapos, utilizado no método de transferência 7,17 hospedeiro. É ideal para remover a etapa cirurgia sapo em termos de cuidados com os animais. Além disso, não temos de levar em conta a qualidade de rãs do sexo feminino de acolhimento para os experimentos de transferência, o que significa que podemos nos livrar de um fator biológico que afeta o sucesso dos experimentos. Portanto, neste sistema a qualidade dos oócitos obtidos a partir de rãs PMSG-condicionadas é um importante fator biológico que é a chave para as experiências bem-sucedidas. A qualidade dos oócitos pode ser julgado após a coleta de ovário ou após defolliculation. Se qualquer anormalidade for observada nestas fases, é ideal para coletar outro ovário de uma nova rã. Outro ponto em que você pode verificar a qualidade do ovócito é após a maturação do oócito. Se menos do que 80% de progesteronaoócitos tratados-e mostrar sinais de maturação, você pode não ser capaz de obter o número suficiente de embriões para análises posteriores. O uso de defolliculation enzimática em vez de defolliculation manual é também uma outra vantagem de se utilizar este sistema para reduzir o trabalho necessário para defolliculation. No entanto, ainda é possível que defolliculation manual pode dar um desenvolvimento melhor do que o tratamento enzimático. Como mostrado na Figura 3, quase 10% dos oócitos maturados in vitro podem alcançar o estágio natação girino. Estes dados são recolhidos a partir de 13 experimentos independentes, incluindo os relatados em 8 e novos experimentos de injeção. Método de transferência anfitrião precisa 75-150 ovócitos em cada tratamento para a obtenção de dados significativos uma vez que 30-60% dos oócitos transferidos podem chegar à fase neurula 17. O nosso método começa normalmente com 200-300 oócitos em cada grupo experimental, uma vez que aproximadamente 40-60% dos embriões clivados pode chegar afase resposta muscular. Estes dados sugerem que ambos os métodos de desenvolvimento suporta uma taxa razoável. Temos até agora obtido 10 sapos vivos de oócitos com injeção de controle oligo antisense com injecção de mRNA e controle utilizando esta técnica, indicando que esta abordagem apoia o desenvolvimento por meio de metamorfose. Nosso método de manipulação de oócitos-ICSI é uma oportunidade para testar o papel dos fatores maternos durante o desenvolvimento embrionário muito cedo, logo após a fertilização. Além disso, a sobre-expressão de factores de modificação da cromatina antes da fertilização pode tornar possível a remodelação da cromatina materna antes da fertilização para a compreensão estados cromatina materna necessário para o desenvolvimento. Esta estratégia também pode funcionar bem com sistemas de edição gene atuais, como a transcrição ativador-like efetoras nuclease (TALEN) 18,19 e CRISPR / CAS9 20,21 uma vez que estes podem ser expressas, mesmo antes da fertilização. Portanto, a nossa nova abordagem tem uma potentiAl de ser utilizado para muitas aplicações no futuro.

Xenopus laevis é um amplamente utilizado, poderoso organismo modelo para estudar o desenvolvimento 1. Isso ocorre porque os ovos de Xenopus são extraordinariamente grande (cerca de 1,2-1,4 mm, em comparação com congéneres de mamíferos sendo cerca de 0,1 mm) e abundante. Os ovos contêm componentes maternalmente sintetizados e armazenados, que são o suficiente para conduzir o desenvolvimento embrionário até meados de transição blastula (MBT, que ocorre na fase de 8-8,5 com células 4,000-8,000). MBT é acompanhada de ativação do genoma zygotic, que então produz produtos de genes embrionários que direcionam o desenvolvimento. Numerosos estudos teve como objetivo identificar fatores maternos importantes para o desenvolvimento. Muitos estudos baseiam-se na injecção de oligonucleótidos anti-sentido (oligos), incluindo oligonucleótidos de morfolino em embriões fertilizados, caso em que a degradação de proteínas maternas podem ser observados na fase de gástrula 2-4. Alternativamente, os ARNm são injectados para fertilizados inbryos perturbar funções de genes ou para traçar destino de proteínas sobre-expressos. No entanto, a injecção nos embriões em estágio de uma célula normalmente não afeta os níveis de proteínas maternos expressão nas fases embrionárias muito cedo antes MBT. Heasman e Wylie estabelecido o método de transferência de acolhimento para superar esse problema 5. No método, os oócitos desfoliculados manualmente são injectados com oligonucleótidos anti-sentido e transferidos para fêmeas hospedeiras 6. As proteínas são reprimidos antes da fertilização, de modo que os papéis de proteínas downregulated no desenvolvimento embrionário precoce pode ser examinado. Este método de depleção materna levou à identificação de vários papéis de desenvolvimento únicas de proteínas maternas, como revisado em 7. Neste relatório, detalhamos o nosso método desenvolvido recentemente, em que a depleção materna ou sobre-expressão de mRNA antes da fertilização é conseguido sem defolliculation manual e transferência de acolhimento8. Defolliculation manual requer muito tempo e transferência de acolhimento muitas vezes precisa de técnicas hábeis e a licença específica para a cirurgia animal, dificultando, assim, o uso frequente de método de depleção materna. Defolliculation e transferência de acolhimento são substituídos por defolliculation enzimática 9,10 e injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) 11-13, respectivamente. ICSI a ovos foi originalmente usado para produzir rãs transgênicos 12. Esperma e embrionárias núcleos também foram transplantadas para in vitro de oócitos de anfíbios amadureceu 11,14,15. Aqui, vamos mostrar o nosso método passo-a-passo para injetar esperma para oócitos maturados in vitro que foram pré-injectados com oligos anti-sentido ou mRNA.

<table><tbody><tr><td>Gonadotrofina Sérica de Égua Grávida (PMSG)&nbsp;</td><td>MSD Saúde Animal</td><td>Vm 01708/4309</td><td>PMSG-Intervet 5000iu pó e solvente para solução injetável</td></tr><tr><td>Sal de metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoato (MS222)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>Para desfoliculação de oócitos. Armazenar em -20&nbsp; &#176;C.</td></tr><tr><td>Nanoject Drummond</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-205/206</td><td>Para microinjeção</td></tr><tr><td>capilar de vidro&nbsp;</td><td>Laboratórios Alpha</td><td>7" Drummond #3-000-203-G/XL</td><td>Para Microinjeção</td></tr><tr><td>Micropipeta Extrator&nbsp;</td><td>Instrumento SUTTER</td><td>Modelo D-97</td><td>Para microinjeção</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>Para maturação in vitro e</td></tr><tr><td>tubo de centrífuga ultra-claro ICSI 14 ml&nbsp;</td><td>Beckman Coulter United Kingdom Ltd</td><td>344060</td><td>Para purificação de esperma</td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol)</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>Para purificação de esperma</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td></td><td>Sigma D141</td><td>Reagente de permeabilização celular</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Hybaid&nbsp;</td><td>HB-SHK-1</td><td>Para desfoliculação de oócitos</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação (microscópio de zoom estéreo)</td> <td>ZEISS</td><td>Semi SV6</td><td>Para coleta de oócitos e microinjeção</td></tr><tr><td>50 &mu; filtro de poros m</td><td>CellTrics</td><td>04-0042-2317</td><td>Para purificação de esperma</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100XP</td><td>Para purificação de esperma</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 ml</td><td>Cellstar Greiner Bio-One</td><td>227261 ou 210261</td><td>Coleta de oócitos e reação de desfoliculação</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 ml</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td>Para purificação de esperma</td></tr><tr><td>90 mm Petri prato&nbsp;</td>Prato de Cultura de Células de Fácil Manuseio <td>Thermo Scientific</td><td>101VR20/C</td><td></td></tr><tr><td>, 60&nbsp; x&nbsp; Prato</td> de Cultura de Células <td>FALCON</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>de Fácil Manuseio de 15 mm, 35&nbsp; x&nbsp; FALCON</td><td></td><td>351008</td><td></td> de 15 mm</tr></tbody></table>

manipulação e<em&gt; in vitro</em&gt; maturação<em&gt; xenopus laevis</em&gt; oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Os ovos de anfíbios têm sido amplamente utilizados para estudar o desenvolvimento embrionário. O desenvolvimento embrionário inicial é impulsionado por fatores armazenados pela mãe acumulados durante a oogênese. Para estudar os papéis de tais fatores maternos no desenvolvimento embrionário inicial, é desejável manipular suas funções desde o início do desenvolvimento embrionário. As formas convencionais de interferência gênica são alcançadas pela injeção de oligonucleotídeos antisense (oligos) ou mRNA em óvulos fertilizados, permitindo a sub ou superexpressão de proteínas específicas, respectivamente. No entanto, esses métodos normalmente requerem mais de várias horas até que a expressão da proteína seja afetada e, portanto, a interferência das funções do gene não é eficaz durante os estágios embrionários iniciais. Aqui, apresentamos um sistema experimental no qual os níveis de expressão de proteínas maternas podem ser alterados antes da fertilização. Os oócitos de Xenopus laevis obtidos de ovários são desfoliculados por incubação com enzimas. Oligos antisense ou mRNAs são injetados em oócitos desfoliculados no estágio de vesícula germinativa (GV). Esses oócitos são amadurecidos in vitro em óvulos no estágio de metáfase II (MII), seguido por injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). Desta forma, até 10% dos embriões ICSI podem atingir o estágio de girino nadador, permitindo assim testes funcionais de knockdown ou superexpressão de genes específicos. Essa abordagem pode ser uma maneira útil de estudar os papéis dos fatores armazenados maternalmente no desenvolvimento embrionário inicial.

O desenvolvimento embrionário de embriões utilizando ICSI em oócitos maturados in vitro foi analisado (Figura 3A). As taxas de maturação dos oócitos GV para o palco MII são variáveis ​​e depende muito da qualidade do oócito. Em boas experiências, quase 100% dos oócitos GV responder a progesterona e mostrar sinais de maturação do oócito, finalmente se tornando ovos na fase MII. Todos os oócitos foram submetidos a ICSI e cerca de 25% dos ovos injectados clivados (Figura 3A, n = 13 para o controlo scrambled oócitos injectados com oligo e n = 7 para não oócitos injectados com oligo). Cerca de 60% ou 80% dos embriões clivados, produzidos a partir de oócitos injectados com oligo de controlo ou oócitos não injectados, respectivamente, atingiram o estádio de blástula / gástrula. Entre os embriões de blástula / gástrula, cerca de metade dos embriões injectados com amostras em oligo foram de boa qualidade (quase nenhum sinal de clivagem anormal e apoptose), enquanto que 82% dos embriões de blástula / gástrula foram de boa qualidade em namostras em injectados (Figura 3A). Por fim, 41% e 11% dos embriões injectados clivados em amostras de oligo-atingiu a resposta muscular e as fases natação girino, respectivamente, enquanto 60% e 29% dos embriões clivados em amostras não injectados fez (Figura 3A). Estes embriões são ICSI a mistura de embriões normais e anormais (Figura 3B). Alguns deles sofrem metamorfose e desenvolver a amadurecer rãs 8. Estes resultados sugerem que a injecção de oligonucleótidos anti-sentido em oócitos GV, seguido por IVM e ICSI, permite o desenvolvimento embrionário inicial eficiente. Embora a injeção de si oligos antisense diminui o desenvolvimento embrionário, que ainda são capazes de obter embriões suficientes para muitos fins experimentais, como verificar as taxas de desenvolvimento, RT-PCR, Western Blot e assim por diante. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig1highres.jpg" /> Figo<html> ure 1: Os exemplos típicos de oócitos de Xenopus laevis de boa qualidade ou má qualidade de experimentos in vitro de maturação. (A) Um exemplo de oócitos de má qualidade. Por exemplo, os oócitos que mostram pigmentação irregular não são utilizadas para as experiências subsequentes. Cada oócito de Xenopus laevis é de cerca de 1,2-1,4 mm de diâmetro. (B) Um oócito parcialmente desfoliculados. A metade direita do oócito é coberta por células foliculares, os quais podem ser distinguidas pela presença de vasos sanguíneos. Uma seta mostra uma área livre de células do folículo e em que a agulha de injeção é injetado. (C) Um exemplo de oócitos de boa qualidade, que são do mesmo tamanho e mostram hemisférios animais uniformemente pigmentadas com claro contraste entre o hemisfério animal e do hemisfério vegetal. 2496 / 52496fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figura 2:. Oócitos de Xenopus laevis, antes e após a maturação Após a maturação do oócito, claras manchas brancas aparecem no topo da hemisférios animais e células foliculares são descascadas. Cada laevis oócito Xenopus é de aproximadamente 1 mm de diâmetro. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig3highres.jpg" /> Figura 3: Desenvolvimento de embriões de ICSI, produzidos a partir de oócitos maturados in vitro. (A) O desenvolvimento de embriões de ICSI para cada fase é resumido. Os oócitos foram injectados com oligonucleótidos anti-sentido de controlo scrambled (controlo) de injecção de oligo ou sem injecção (não injectável), seguido por IVM e ICSI. O número correspondente de embriões em cada fase é mostrado acima das barras. A média ± SEM é mostrado. N = 4-13 experiências independentes / f diferenteemales. (B) Exemplos de sobrevivência de embriões de ICSI. Estes embriões nos estágios tailbud foram produzidos de uma experiência, em que cerca de 200 oócitos foram usadas como um material de partida.

Descrevemos métodos de manipulação de oócitos imaturos de Xenopus laevis, maturação in vitro de oócitos em óvulos e injeção intracitoplasmática de espermatozoides. Este protocolo permite a degradação de algumas proteínas maternas e a superexpressão de genes de interesse na fertilização e, portanto, é valioso para estudar papéis de fatores específicos no desenvolvimento embrionário inicial.

Manipulação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

O objetivo do seguinte experimento é silenciar proteínas maternas armazenadas em ovócitos ou superexpressar proteínas de interesse no momento da fertilização de ovos de rã. Isso é conseguido pela injeção de oligonucleotídeos antissenso ou mRNA em ovócitos imaturos desregulados enzimaticamente, a fim de degradar ou superexpressar uma proteína específica. Como segundo passo, os ovócitos são transferidos para um meio contendo progesterona, o que induz a maturação dos ovócitos em ovos.Em seguida, o esperma é injetado nos óvulos amadurecidos in vitro para observar o efeito do silenciamento ou superexpressão no desenvolvimento embrionário. Em última análise, o desenvolvimento de ovócitos injetados com oligonucleotídeos até girinos nadadores constitui o teste funcional do silenciamento ou superexpressão gênica. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o transplante para hospedeiro, é que podemos pular o processo cirúrgico em rãs utilizando protocolos padrão.Colete o opus sobre SAC contendo cítos saudáveis em uma placa de Petri de nove centímetros contendo MBS mais ps. Em seguida, separe a ovário em pedaços quadrados com largura de um a dois centímetros. Colete cerca de cinco mililitros do ovário rasgado com cítos em um novo tubo de 50 mililitros.Em seguida, lave os tecidos com MBS mais PS várias vezes e colete os ovos em 15 mililitros de MBS fresco mais ps. Agora, adicione sete unidades de enzima de desfolhação à suspensão e incube a suspensão com agitação suave até que estejam pelo menos parcialmente desfolhados. Isso levará pelo menos uma hora após a incubação.Encha o tubo com MBS mais Ps para interromper a reação. Deixe a solução aderir à parede do tubo e não diretamente sobre os citos. Deixe os tecidos sedimentarem e descarte a solução e o agente.Células pequenas e imaturas flutuarão e também devem ser descartadas. Repita este passo de lavagem um total de 10 vezes após as lavagens. Transfira as células para uma placa de nove centímetros com MBS mais ps.Transfira a placa para um microscópio estereoscópico e, a partir daqui, mantenha os cítos entre 16 e 18 graus Celsius tanto quanto possível. Selecione cítos de boa qualidade no Estágio seis utilizando a classificação de Dumont com uma pipeta de vidro, colete-os em uma nova placa com MBS mais ps. Um cíto de boa qualidade deve apresentar pigmentação uniforme no hemisfério animal e mostrar uma separação nítida entre os hemisférios animal e vegetal.Eles também devem ter todos aproximadamente o mesmo tamanho, que seria entre 1,2 e 1,4 milímetros de diâmetro. Colete cerca de duzentos a trezentos cítos para cada injeção, totalizando cerca de 1000 cítos por experimento. A qualidade do sítio O é fundamental para o sucesso.Se o oócito apresentar alguma anormalidade durante o preparo, recomendo que você corrija um ovário de um lote diferente e recomece. Em preparação para a injeção do oligo antissenso, posicione o êmbolo metálico de um microinjetor em sua posição mais baixa e acople uma micropipeta de vidro preenchida com óleo ao êmbolo metálico. Sob um microscópio estereoscópico, corte a ponta da micropipeta utilizando pequenas tesouras cirúrgicas.Faça uma ponta tão pequena quanto possível. Próximo laser. Uma tira de paraforma na platina do microscópio e sobre ela dispense três microlitros de solução de ácido nucleico a um micrograma por microlitro.Com isso, preencha a ponta da agulha. Se estiver sendo aprisionado ar, a abertura deve ser ampliada. Agora faça uma marca visível na agulha de injeção a cerca de meio milímetro da ponta.Em seguida, prossiga com a injeção dos cítos, injetando primeiro um, e localize uma área livre de células foliculares onde a agulha possa penetrar. Insira a ponta ao longo do limite equatorial, mirando no ponto central sob a vesícula germinativa. Ao mesmo tempo, segure firmemente o cíto com uma pinça no lado oposto.Agora, utilizando o controle por pedal, ejetar a solução, ejetando entre 4,6 e 9,2 nanogramas de oligonucleotídeos antissenso ou entre 250 picogramas e 13,8 nanogramas de RNA mensageiro. Após injetar todas as células, transferi-las para o meio de incubação e deixá-las incubando por alguns dias para que possam ocorrer alterações no proteassoma.Posteriormente, transfira os cítos com uma quantidade mínima de meio para placas de ágar de seis centímetros contendo de cinco a oito mililitros de meio de maturação. Em seguida, deixe os cítos se desenvolverem neste meio por 16 horas antes de injetá-los com espermatozoides. Para este protocolo, é necessário preparar um estoque congelado de espermatozoides.Consulte o protocolo descrito após 16 horas de incubação para a maturação. Transfira cuidadosamente os citos para uma placa de 6 centímetros revestida com ovo grosseiramente triturado contendo MBS mais PS para lavá-los. Se os citos forem manipulados incorretamente, eles podem se ativar espontaneamente antes da ixy.Agora, conte os cítos maduros e procure por manchas brancas, que indicam que a vesícula germinativa do cíto sofreu rompimento. Se menos de 80% estiverem bons, coletivamente não são saudáveis o suficiente para sobreviver ao procedimento de ixy. Para prosseguir.Encha um novo recipiente com meio de injeção e transfira delicadamente todos os cítos para o recipiente após meia hora. Prossiga com a injeção dos cítos maduros com a solução de espermatozoides utilizando a mesma preparação do injetor descrita para oligos. Idealmente, deve haver um ou dois espermatozoides por 4,6 nanolitros na solução de injeção.Para testar esta solução de injeção, faça gotas da solução de DPI a 0,3 microgramas de DPI por mililitro e injete 4,6 nanolitros nessas gotas. Em seguida, conte o número de espermatozoides em cada gota por microscopia de fluorescência. Após confirmar a concentração de espermatozoides, injete os cítos com 4,6 nanolitros da solução de espermatozoides.Certifique-se de que o tempo necessário para injetar as soluções permaneça constante e injete os ovócitos de forma contínua, com pausas mínimas entre as injeções. Após a cada 100 injeções, troque a solução de espermatozoides. Após todos os ovócitos maduros terem sido injetados, a placa deve ser incubada por quatro a cinco horas e, em seguida, examinada.Para embriões que sofreram clivagem, as sulcos de clivagem podem não estar tão nítidos quanto nos embriões fertilizados normais; transfira todos os embriões clivados para o meio de incubação e deixe-os incubando durante a noite. No dia seguinte, os embriões sobreviventes devem ser transferidos para o meio de desenvolvimento embrionário 0,1 XMMR de embriões ixy. O uso de ovócitos maturados in vitro foi avaliado em bons experimentos, e quase 100% dos ovócitos com vesícula germinativa responderam à progesterona e apresentaram sinais de maturação.Cerca de 25% sofreu clivagem. De 60 a 80% dos embriões clivados atingiram o estágio de blastogástula, e cerca de um terço desses alcançou o estágio de girino natante. Os embriões ixy foram uma mistura de embriões normais e anormais, demonstrando que a injeção do oligonucleotídeo antissenso sogo em células germinativas do citoplasma vegetal, seguida por MIV e Dixie, permitiu o desenvolvimento embrionário inicial.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manipular proteínas maternas antes da fatoração.

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Research

JoVE Journal

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Biologia do Desenvolvimento

Aqui demonstramos microinjeção citoplasmática...

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Fertilização de Oócitos Xenopus Utilizando o método de transferência do host

Xenopus embrionárias epitélios são um sistema modelo ideal para estudar os comportamentos das células, como o desenvolvimento de polaridade e mudar de forma durante a morfogênese epitelial. Histologia tradicional de amostras fixa é cada vez mais sendo complementado por live-célula de imagem confocal. Aqui nós demonstrar os métodos para isolar os tecidos de rã e visualizar ao vivo as células epiteliais e seus citoesqueleto usando live-célula microscopia confocal.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Relatamos aqui a expressão robusta e eficiente de proteínas fluorescentes após a injeção de mRNA em oócitos não fertilizados de Branchiostoma lanceolatum. O desenvolvimento da técnica de microinjeção neste cordados basal irá pavimentar o caminho para longo alcance inovações técnicas neste sistema modelo emergente, incluindo in vivo de imagens e manipulações específicas de genes.

Expressão de proteínas fluorescentes em Branchiostoma lanceolatum Por injecção de mRNA em oócitos não fertilizados

O manuscrito aqui fornece um simples conjunto de métodos que permitam analisar a secreção e difusão de ligantes marcados fluorescentes em Xenopus. Isto proporciona um contexto para testar a capacidade de outras proteínas para modificar a distribuição de ligando e permitindo experiências que podem dar uma visão sobre os mecanismos que regulam a gradientes de morfogénio.

Utilizando Análise de confocal<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Para Investigar moduladores de Wnt e Shh morfogénio gradientes

Nos embriões de Xenopus, as células do teto do blastocele são pluripotentes e podem ser programadas para gerar vários tecidos. Aqui, descrevemos protocolos para usar explantes de telhado de blastocele de anfíbios como um sistema de ensaio para investigar as principais características in vivo e in vitro do desenvolvimento neural inicial.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionárias explantes Estudar características Neural desenvolvimento precoce<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Descrevemos um sistema de capas de oócitos e animais de Xenopus para a clonagem de expressão de genes capazes de induzir uma resposta em ectoderma competente, e discutimos técnicas para a análise subsequente de tais genes. Este sistema é útil na identificação funcional de uma ampla gama de produtos gênicos.

Clonagem Funcional Utilizando um<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Sistema de Expressão

Um protocolo optimizado para a maturação in vitro de oócitos de peixe-zebra utilizados para a manipulação dos produtos dos genes maternos é aqui apresentada.

Manipulação funcional do gene materno produtos Usando<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação do oócito em Zebrafish

Este protocolo demonstra um método baseado em fluorescência para visualizar a vasculatura e quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis . Os vasos sanguíneos podem ser visualizados minutos após a injecção de um corante fluorescente no coração batendo de um embrião após manipulações genéticas e / ou farmacológicas para estudar o desenvolvimento cardiovascular in vivo .

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Descrevemos um método de constrição física para produzir mini embriões a partir de embriões de célula única de Xenopus laevis .

Manipulação Física para Gerar Embriões Mini de Xenopus

Este protocolo descreve procedimentos para maturação in vitro de oócitos de camundongo, fertilização in vitro e subsequente cultura embrionária até o estágio de blastocisto.

Maturação in vitro, fertilização e cultura de embriões pré-implantacionais em ovocitos de camundongos

Aprenda a manipular oócitos de Xenopus laevis para maturação in vitro e injeção intracitoplasmática de espermatozoides. Este método permite estudar o desenvolvimento embrionário e a função de proteínas maternas.

Manipulação e In Vitro Maturação Xenopus laevis Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário (Vídeo) | JoVE Journal

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