Medição da Actividade larval no Drosophila Monitor de Atividade

Este relatório descreve um método para medir a atividade larval de Drosophila usando o TriKinetics Drosophila Activity Monitor. O dispositivo emprega feixes infravermelhos para detectar movimentos de até 16 animais individuais. Os dados podem ser analisados para representar parâmetros de movimento, incluindo taxas e posições dos animais dentro das câmaras de ensaio.

O objetivo geral deste procedimento é analisar a atividade larval sem o uso de software de análise de vídeo complicado. Isso é feito primeiro transferindo larvas selecionadas para um filtro de malha para limpar os detritos. Em seguida, as larvas individuais são transferidas para tubos de ensaio, onde são presas por tampões de trado, que são inseridos em um monitor de atividade de drosófila ou dispositivo de barragem.

Após três a cinco minutos de aclimatação, as gravações são retiradas do sistema DAM para análise. Em última análise, os movimentos larvais medidos pela mãe podem ser usados para analisar diferentes parâmetros de atividade para um determinado genótipo. Uma vantagem que essa técnica tem sobre os métodos existentes é que ela é automatizada e objetiva.

Embora seja simples o suficiente para medições de atividade de rotina, muitos laboratórios já possuem o equipamento necessário que pode ser facilmente adaptado para uso em larvas. Demonstrando o procedimento estará Aiden McFarlin, um estudante de graduação do meu laboratório. Este protocolo usa um dispositivo monitor de atividade de drosófila multifeixe M cinco ou uma barragem.

Para montar a barragem. Primeiro, conecte o monitor à unidade de interface da fonte de alimentação ou PSIU usando o cabo telefônico CAB seis. Em seguida, conecte o PSIU a uma tomada elétrica.

Uma luz verde indicará uma conexão apropriada. Terceiro, conecte o PSIU através de um cabo USB a um computador para gravação de dados. Agora instale e abra o sistema DAM MB um programa V seis X no computador.

Quando o software é aberto, ele começa automaticamente a gravar dados no controle do software. Para a barragem, defina o intervalo de gravação desejado. Escolha as preferências e clique acima ou abaixo da opção de intervalo de leitura para selecionar diferentes períodos de tempo nos quais os dados serão armazenados.

Há uma variedade de outros parâmetros que podem ser definidos em preferências e em tipo de dados de saída. Cada parâmetro fornece uma análise única da atividade larval dentro do tubo. Sugere-se que todos os parâmetros sejam selecionados antes da coleta de dados.

Se você não tiver certeza de qual parâmetro deseja medir Para este ensaio, prepare um frasco com larvas forrageiras Para cada genótipo que se pretende analisar. Use um ambiente padrão e comida para moscas para preparar os tubos de ensaio. Despeje uma solução de 4% de trado a uma profundidade de 1,5 centímetros em uma placa de Petri.

Isso se torna o material do plugue para o tubo de ensaio, muito denso para ser enterrado. Em seguida, certifique-se de que os tubos estejam limpos e desobstruídos, lavando-os com água quente. Em seguida, aqueça uma garrafa squeeze com 100 mililitros de água no micro-ondas por 10 a 15 segundos ou até que apareça condensação.

Em seguida, inverta a garrafa e esprema suavemente o ar quente e úmido no tubo de ensaio. Quando uma fina camada de condensação aparece na parede do tubo, ela está suficientemente úmida. Em seguida, remova o disco de gel do prato e coloque-o sobre uma superfície de malha, à qual ele não adere firmemente.

Para coletar as larvas, prepare um filtro de malha esticando a malha de náilon serigrafada sobre um funil. Prenda a malha no gargalo do funil com um elástico e posicione o funil em um béquer. Agora retire uma espátula cheia de alimentos contendo larvas forrageiras do frasco de cultura e transfira-as para o filtro de malha.

Lave a comida das larvas em temperatura ambiente, água da torneira, larvas individuais podem ser coletadas da malha usando um pincel. Transfira as larvas cerca de 1,5 polegadas para um tubo de ensaio úmido. Em seguida, sele o tubo conectando-o com o sem-fim.

Isso é feito pressionando uma extremidade do tubo no gel duas vezes e a outra extremidade. Uma vez que a pressão force um dos dois plugues para fora na extremidade oposta, à medida que os tubos são carregados, coloque-os na barragem. Em seguida, ajuste a posição de cada tubo para que o animal não possa se mover além do alcance dos sensores.

Em seguida, prenda os tubos ao dispositivo usando um anel de massa. Registre a atividade do LARVAS em uma incubadora de 20 graus Celsius para evitar leituras imprecisas que possam ocorrer devido a sombras, luzes fluorescentes ou variações de temperatura no laboratório. Na incubadora.

Use iluminação LED não fluorescente durante a gravação. Antes de coletar dados, deixe as larvas se aclimatarem por cinco minutos. Pode ser útil realizar um teste sem animais para garantir que as condições de luz não acionem os sensores DAM.

Após cinco minutos, inicie o software DAM pré-configurado para iniciar a gravação. O ensaio pode durar 30 minutos sem condensação ou alimentos adicionais. É essencial que, antes de registrar, o parâmetro de atividade pretendido para análise tenha sido selecionado em preferências.

Se não for selecionada, esta atividade não estará disponível para análise post hoc. Após a conclusão do tempo de gravação desejado, feche o software DAM, os dados são salvos automaticamente na pasta de dados do sistema dam. Transfira o arquivo de dados para uma pasta separada para que possa ser processado posteriormente.

Os tubos de ensaio podem ser limpos com água fervente para reutilização. Para processar os dados brutos em um formato compreensível, abra o aplicativo de verificação de arquivos DAM e escolha. Selecione a pasta de dados de entrada, escolha a pasta de dados e o arquivo desejado e selecione a opção de digitalização.

Por fim, selecione o comprimento do compartimento para o período de leitura desejado. Isso organiza os dados brutos em parâmetros definidos pelo operador. Agora selecione o tipo de dados de saída para analisar a configuração de movimento desejada.

Se o comprimento do compartimento for maior que o intervalo de leitura do sistema selecionado, vá para o menu de leituras extras e selecione a opção soma de dois em compartimentos. Em seguida, salve o arquivo com um nome apropriado na mesma pasta para a qual os dados brutos foram transferidos. Usando um programa de planilha padrão, abra o arquivo salvo.

Dependendo do tipo de dados analisado, a planilha deve ser lida de forma diferente. Normalmente, para medir movimentos ou contagens, o período de tempo do estudo será registrado numericamente, enquanto cada tubo de leitura individual receberá uma letra designada. Normalmente, as colunas K a Z representam os slots para tubos de ensaio e as linhas representam os pontos de dados coletados.

Se, por exemplo, os movimentos foram coletados por 20 minutos, em um minuto, os intervalos calculam a média das 20 linhas para calcular um número médio de movimentos por minuto e outras medidas. Um estudo de resposta à temperatura de larvas de terceiro ínstar da cepa W 1 1 1 8 foi feito usando o dispositivo de monitoramento para detectar diferenças na larva e locomoção. Em sete temperaturas diferentes, cada larva foi analisada por 20 minutos.

Claramente, as larvas ficaram significativamente mais ativas à medida que o ambiente esquentava. Para comparação, um mutante hipoativo da cepa W 1 1 18 foi testado chamado inativo. A análise indicou que as larvas inativas eram significativamente menos móveis do que um controle para testar os limites de detecção do ensaio.

Uma comparação de larvas em diferentes estágios foi feita enquanto muito menor que a terceira em larvas de estrelas. A atividade da primeira e da segunda larvas estelares foi de fato detectável e mensurável, observando as mudanças na atividade com o tempo no dispositivo. Verificou-se que a atividade do terço em larvas estrela em cada minuto do ensaio de 20 minutos permaneceu relativamente consistente.

Uma vez dominado, este protocolo fornece um método preciso, simples e econômico para avaliar os parâmetros básicos da atividade larval sob uma variedade de condições experimentais.