In Vivo e Ex Vivo Abordagens para o Estudo do cancro do ovário metastático Colonização de Estruturas Láctea natural em Peritoneal adiposo

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o uso de técnicas padrão para quantificar a colonização do câncer de ovário dos depósitos adiposos peritoneais. Isso é realizado por meio da injeção intraperitoneal de células de câncer de ovário em camundongos após o sacrifício dos camundongos em pontos de tempo específicos. Os depósitos de gordura peritoneal são identificados e isolados dos camundongos.

Finalmente, o número de células de câncer de ovário presentes em depósitos adiposos específicos é quantificado usando citometria de fluxo. Além disso, para estudos baseados em mecanismos, a colonização de células de câncer de ovário também pode ser estudada em co-cultura ex vivo, seguida de análises quantitativas e/ou moleculares apropriadas. Em última análise, essas abordagens in vivo e ex vivo permitem a interrogação dos processos envolvidos na colonização de células de câncer de ovário do tecido adiposo peritoneal por meio de métodos qualitativos ou quantitativos.

A principal vantagem dessa abordagem é que somos capazes de implementar técnicas padrão para avaliar etapas específicas na colonização metastática do câncer de câncer de mama peritoneal. As implicações da técnica estendem a prevenção de metástases. Especificamente, permite a identificação de interações do microambiente de células cancerígenas que regulam o crescimento de células cancerígenas de ovário dentro de estruturas contendo células imunes conhecidas como manchas leitosas.

Geralmente, os indivíduos novos neste método acharão útil ter experiência no manuseio de ratos. Embora as injeções intraperitoneais sejam aparentemente simples, a falta de uma boa técnica pode levar a dados imprecisos. Além disso, a dissociação do tecido em suspensão de célula única requer prática e planejamento meticuloso antes do início do experimento.

Esta técnica específica não requer que os animais estejam sob anestesia. De acordo com protocolos aprovados, realizar esta técnica em animais vivos. Coloque 500 microlitros da suspensão de célula única marcada com fluorescência na seringa.

Em seguida, coloque a seringa em uma agulha estéril de calibre 25 para reduzir o cisalhamento celular antes da injeção. Segurando o mouse com a outra mão, pegue o mouse pela nuca e segure a cauda usando a palma da mão e o indicador. Em seguida, fixe a perna traseira esquerda entre o dedo anelar e o dedo mínimo para evitar traumatizar os órgãos abdominais.

Contenha bem o mouse para que ele não possa se mover durante a injeção. Imagine uma linha no abdômen e localize um ponto no lado direito do animal e próximo à linha média. O ponto de entrada é cranial dois e ligeiramente medial do último mamilo.

Prepare-se para inserir a agulha no lado direito do camundongo para evitar o ceco e reduzir o risco de perfurar os intestinos. Insira a agulha na região lateral inferior do abdômen do mouse a uma profundidade de aproximadamente 0,5 centímetros. Puxe o êmbolo para trás para confirmar que a agulha não penetrou em um vaso sanguíneo ou outros órgãos peritoneais.

Se nenhum fluido for aspirado, injete a amostra usando pressão lenta e constante. Em seguida, retire a agulha e retorne o mouse à sua gaiola. Não recape a seringa antes de descartá-la no recipiente para objetos cortantes.

Sacrifique os camundongos em pontos de tempo específicos após a injeção para remoção de órgãos vitais. Conforme descrito no protocolo de texto, a coleta de depósitos de gordura peritoneal constitui a remoção de órgãos internos. Faça uma incisão na linha média perto do pape inguinal através da parede peritoneal para expor os órgãos internos para extirpar a gordura omental.

Exponha o complexo pancreático omental estendendo o baço da cavidade peritoneal com uma pinça para a gordura gonadal. Use uma pinça para levantar a gordura gonadal ao redor dos ovários e excise-a cortando as conexões dos tecidos. Imediatamente. Coloque os lenços em PBS gelado.

Em seguida, remova a gordura uterina usando uma pinça para levantar a gordura uterina ao redor dos cornos uterinos e excise cortando as conexões dos tecidos antes de colocar imediatamente os tecidos em PBS gelado. Ao obter a gordura mesentérica, corte a junção entre o intestino delgado e o piloro. Use uma pinça para segurar firmemente a extremidade livre do intestino delgado e retire-a lentamente da gordura mesentérica.

Libere a gordura mesentérica da raiz mesentérica usando uma tesoura de dissecação. Em seguida, coloque imediatamente os lenços de papel em PBS gelado. Finalmente, para remover a gordura pleo portal, levante a extremidade distal do baço usando uma pinça para expor a fina faixa de gordura do tecido, conectando o hilo do baço ao pâncreas.

Extirpar a gordura pleo portal, liberando-a primeiro do pâncreas e depois dissecando-a cuidadosamente do baço. Em seguida, coloque imediatamente os tecidos no PBS para começar a pesar. Combine todos os tecidos adiposos com o omento.

Transfira os tecidos para tubos separados de cinco mililitros contendo 1,5 mililitros de ECCOs livres de soro, meio de águia modificado ou DMEM e 0,1% de albumina de soro bovino. Agrupe os tecidos colhidos de três camundongos independentes para garantir um rendimento suficiente de células para citometria de fluxo. Em seguida, pique os tecidos usando uma tesoura cirúrgica e adicione 1,5 mililitros de DMEM livre de soro contendo 0,4% de colagenase.

Incubar a suspensão de tecido a 37 graus Celsius por 30 minutos com mistura rotacional como etapa opcional. Dissocie ainda mais o tecido por mastigação. Neste caso, transfira a suspensão de colagenase tecidual para um micro estômago ou bolsa e mastigue por 10 minutos em baixa, girando a orientação das bolsas após cinco minutos.

Em seguida, filtre as amostras através de um filtro de malha de náilon para remover detritos grandes. Coletar as células por centrifugação a 250 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar a fração sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 100 microlitros de PBS combinado com 900 microlitros de cloreto de amônio, lise de potássio, tampão e incube em temperatura ambiente por um minuto.

Em seguida, centrifugue as células novamente como antes e descarte o sobrenadante após o resus, suspendendo o pellet celular em 250 microlitros de PBS gelado filtre as amostras através de uma malha de nylon de 60 mícrons para garantir uma suspensão de célula única. Em seguida, enxágue o filtro com 250 microlitros de PBS gelado para crescer e preparar células marcadas com fluorescência e resus. Suspender a uma concentração de 2 milhões de células por mililitro.

Aplique aproximadamente seis microlitros do adesivo tecidual na membrana da cultura. Insira e deixe secar ao ar. Em seguida, lave a membrana duas vezes com água estéril para remover qualquer adesivo excessivo Antes de secar as membranas ao ar sob uma capa laminar, excise cuidadosamente o OA e prenda-o à membrana revestida com adesivo usando uma pinça estéril.

Depois de permitir que o tecido adira à membrana por um minuto, adicione 500 microlitros da suspensão celular em cima de cada omento em cada inserto de cultura. Em seguida, preencha a área ao redor da câmara transwell com 2,5 mililitros de mídia DMEF 12. Incubar o OA com suspensão celular por seis horas a 37 graus Celsius em um ambiente de 5% de CO2.

Remova e lave cuidadosamente o OA com cerca de 10 mililitros de PBS. Finalmente, visualize focos de células cancerígenas fluorescentes usando um sistema de imagem fluorescente apropriado. As localizações relativas dos depósitos adiposos peritoneais podem ser vistas por meio de dissecção anatômica macroscópica.

Aqui é mostrado um olhar mais atento ao portal Pleo e ao tecido adiposo omental. Os tamanhos relativos dos depósitos adiposos excisados são mostrados aqui. Manchas leitosas são observadas no tecido adiposo omental e pleo portal usando histologia padrão.

Os resultados quantitativos da análise de fluxo de vários depósitos de gordura peritoneal são mostrados. Os critérios de passagem para as análises são mostrados aqui. As células parentais ideadas foram usadas como controle negativo.

As preparações de tecido omental continham uma população significativa de células positivas para tomate DT em relação à medula uterina e à gordura gonadal. Na citometria de fluxo quantificada, os dados são expressos como aumento médio de mudança de dobra de eventos positivos de tomate TD em relação a camundongos injetados com PBS in vivo e colonização ex vivo de OA por SKV três, IP um GFP células de câncer de ovário é mostrado aqui. A imagem de fluorescência de OA total demonstrou padrões semelhantes de colonização da localização de células cancerígenas em ensaios in vivo e ex vivo.

O exame histológico desses tecidos confirmou a presença de células cancerígenas localizadas nas manchas leitosas. Finalmente, a detecção imuno-histoquímica de citoqueratina expressa por células SKO V três IP e GFP confirma esses achados histológicos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de identificar e extirpar cuidadosamente o tecido adiposo peritoneal e evitar a contaminação por outros tipos de tecido, o que distorcerá os dados quantitativos obtidos da citometria de fluxo.

Em segundo lugar, é importante lembrar de escolher minhas cepas apropriadas para o estudo em questão. A técnica pode ser usada para identificar interações de linhagens celulares de câncer de ovário bem estabelecidas no microambiente do omento que são importantes para a formação de metástases. Também pode ser usado para avaliar o potencial maligno de linhagens celulares que modelam lesões precoces observadas nas trompas de Falópio.