Ensaiando populações de células do sangue Drosophila melanogaster Larva

O objetivo geral deste procedimento é isolar e quantificar as populações de células sanguíneas circulantes e residentes de larvas únicas de drosófilas. Isso é feito primeiro sangrando suavemente os citos he circulantes através de incisões definidas na parede do corpo larval. O segundo passo é liberar a população de células sanguíneas residentes das bolsas hematopoiéticas localizadas entre a epiderme larval e as camadas musculares, o que requer raspagem ou espetação usando uma agulha ou outra ferramenta de dissecação.

Quaisquer hemócitos remanescentes na carcaça da larva são contados e as células sanguíneas liberadas são visualizadas nas lâminas de vidro onde as larvas foram dissecadas. A etapa final é realizar a análise da Imagem J para quantificar as células sanguíneas liberadas. Isso permite um cálculo do número de hemócitos circulantes e residentes por larva, por exemplo, comparando larvas de diferentes estágios de desenvolvimento.

O melão rosala de voo de frutas. Augusta tem sido um excelente modelo para entender os princípios gerais da imunidade e do desenvolvimento de células sanguíneas. Células sanguíneas e invertebrados também são chamados de hemos, que comumente se acredita estarem circulando na hemolinfa.

No entanto, em muitos estágios de desenvolvimento e no adulto, uma grande parte dos hemosots é realmente encontrada em aglomerados de Cecile que residem em certos tecidos. Pesquisas recentes se concentraram nessas populações de hemossoto residentes, suas propriedades e regulação, e desenvolvemos um método que permite isolar seletivamente as células sanguíneas residentes e circulantes da larva de drosófila Em comparação com os métodos existentes que liberam citos uns seletivamente. Este método distingue entre as populações circulantes e residentes e fornece uma abordagem automatizada e reprodutível para seu isolamento e quantificação.

Desenvolvemos esse método quando começamos a estudar as células sanguíneas residentes nas bolsas hematopoiéticas da larva de drosófila. Descobrimos que, quando isolamos seletivamente hemossomas residentes versus circulantes, essas duas populações apresentam comportamentos diferentes, como na proliferação. A demonstração visual desse método é útil porque é importante se familiarizar com a localização do residente nos hemócitos circulantes e como liberá-los seletivamente.

O método permite abordar questões-chave no desenvolvimento, hematopoiese e imunidade, por exemplo, em relação a sinais que induzem as células sanguíneas e promovem sua localização nas bolsas hematopoiéticas e vice-versa. Em relação aos sinais que mobilizam Cecile hemos em circulação, por exemplo, após um desafio imunológico, Indivíduos novos neste método podem ter dificuldade em lidar com as larvas suavemente e fazer incisões precisas para a parte de sangramento deste procedimento. Essas etapas são críticas para garantir que as duas populações não se misturem e sejam liberadas ao mesmo tempo.

Este método é muito útil para drosófilas de vários tamanhos e estrelas e pode ser adaptado a outros estágios de desenvolvimento e potencialmente a outros invertebrados também. Para isolar as larvas da comida da mosca, esguiche água no frasco e lave as larvas em uma placa de Petri. Retire as larvas da placa de Petri usando um pincel e coloque-as na água em uma cavidade.

Transfira as larvas para uma lâmina em um bloco de metal frio e selecione as larvas do tamanho e genótipo desejados sob um microscópio de fluorescência. As larvas devem carregar transgenes que marcam os citos pela expressão de uma proteína fluorescente ou outro marcador visível de citos he. Coloque uma larva no primeiro papanicolau.

Bem, para isolar os citos circulantes usam dissecação, tesoura ou duas agulhas limpas para fazer incisões no lado ventral da larva. Para evitar residente, ele cita uma incisão na extremidade posterior e uma incisão na extremidade anterior da larva. Certifique-se de que as incisões serão feitas no mesmo local em cada larva.

Deixe as larvas sangrarem por alguns segundos sem qualquer pressão ou agitação física. Após alguns segundos, levante suavemente as larvas com as agulhas ou pinças e coloque em um segundo. Bem, para enxaguar para liberar o residente que ele cita.

Transfira suavemente as larvas para o próximo poço e prenda as larvas com uma ponta de agulha. Use outra agulha para quebrar os aglomerados de citos visíveis através da parede do corpo larval. Evite a glândula linfática enquanto libera o residente.

Ele cita. Escolha uma parte das larvas para cutucar em cada poço e faça o mesmo para as amostras restantes. Coloque a carcaça final em uma área limpa da mesma lâmina e espalhe-a o mais fino possível para maximizar o foco nas camadas ópticas.

Conte os outros citos restantes manualmente com um contador de contagem. Quando a dissecção estiver completa, pese entre cinco a 15 minutos para que as células se assentem. Antes da imagem, os poços armazenam a lâmina em uma câmara úmida para evitar a secagem.

Os citos estabelecidos na lâmina são examinados em um microscópio de fluorescência, imagens de fluorescência dos citos estabelecidos são tomadas para o método de poço único. O campo de imagem deve cobrir todo o poço para o método de digitalização de ladrilhos. As margens dos poços são selecionadas e as imagens são adquiridas usando microscópio comercial.

As imagens resultantes do software de varredura de ladrilhos são então analisadas para quantificação do hemossítio. O software Image J é iniciado e a imagem do poço é aberta. Certifique-se de que a imagem seja de oito bits ou 16 bits.

Ajuste o limite selecionando a imagem. Em seguida, selecione ajustar e limitar. Para observar a janela de limite, marque a opção de fundo escuro e selecione vermelho.

Em seguida, ajuste o nível de limite inferior. Essa configuração permitirá que o usuário marque as células com um ponto vermelho. As células que não estão sendo cobertas serão vistas em escala de cinza.

Inicie o analisador de partículas para contar as células, selecione, analise e clique em analisar partícula. Selecione contornos de sobreposição para ver a contagem do algoritmo para analisar o número de células, clique em OK e observe a janela de resumo com a contagem Residente, os citadores podem ser perturbados mecanicamente, resultando em um aumento transitório na população de células sanguíneas circulantes para causar distúrbios. Larvas inteiras são revestidas com esferas de vidro e podem se recuperar por um período de tempo definido durante o qual os citos se mudam para as bolsas hematopoiéticas.

Isso é ilustrado quantificando a fração de células sanguíneas circulantes antes e depois da perturbação e após o período de recuperação para perturbar mecanicamente os hemócitos residentes, selecione até quatro a oito larvas e coloque-as em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros com aproximadamente 0,5 gramas de esferas de vidro de 600 mícrons e 0,5 mililitros de água. Vortex o tubo manualmente em velocidade, 10 por um minuto. Recupere as larvas das contas de vidro derramando o conteúdo do tubo de microcentrífuga em uma placa de Petri e escolhendo as larvas com um pincel para a fase de recuperação.

Coloque as larvas nas placas de Petri previamente preparadas com uma fina camada de comida para moscas. Incube as larvas por 45 minutos para permitir que as larvas restabeleçam seu padrão de hemócitos após o período de recuperação. Continue com as dissecções de raspagem de sangramento conforme descrito anteriormente nas larvas de controle, os hemócitos estão localizados em bolsas hematopoiéticas, formando manchas laterais e listras dorsais.

A perturbação mecânica transitória das larvas leva a um aumento dramático na população de hemócitos circulantes às custas dos hemócitos residentes. Após o período de recuperação, os citos retornam às bolsas hematopoiéticas. As larvas podem exibir aglomerados associados a vasos dorsais aumentados e listras dorsais, que são locais predominantes de acúmulo pós-distúrbio precoce.

As porcentagens avaliadas de hemócitos circulantes foram quantificadas pelo método de raspagem de sangramento. Este método fornece uma nova abordagem para a pesquisa de células sanguíneas de invertebrados. Permite investigar a população de células sanguíneas auto-renovadoras residentes e outros hemócitos, a fim de entender a regulação por microambientes locais e pistas sistêmicas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e quantificar seletivamente a circulação em larvas de instalação hemos residentes Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em cerca de 15 minutos por larva. Isso inclui a liberação de imagens e quantificação de células sanguíneas. Após este procedimento, outros métodos, como imunoquímica e ensaios biológicos celulares, podem ser realizados para abordar questões como o status de proliferação de células sanguíneas, diferenciação, sobrevivência ou fagocitose.

Ao tentar este procedimento, é importante manter a calma e liberar hemócitos circulantes com cuidado, manusear as larvas suavemente para evitar a liberação de hemócitos residentes junto com os circulantes.