Name: A avaliação in vivo de Rodent Plasmodium parasitemia e Merozoito Invasion por citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Aprenda a medir invasão de merozoítos e parasitemia em modelo murino de malária usando citometria de fluxo. Este método permite análise in vivo precisa da dinâmica da infecção por Plasmodium.

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Reconhecemos financiar o apoio do Conselho de Pesquisa Nacional de Saúde e Medicina (conceder APP605524, 490037 e 1047082), o Australian Research Council (conceder DP12010061), a Estratégia Nacional de Infra-estrutura Collaborative Research, da Austrália e do fundo de investimento de Educação do Departamento de Inovação, Indústria , Ciência e Investigação. PML é um receptor de um prêmio de Pós-Graduação da Austrália.

Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as políticas da Universidade Macquarie e conformado com o Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (NHMRC) Código australiano de prática. O trabalho foi realizado sob as Ética Nenhum Acordo ARA 2012/017 aprovados e obtido da Comissão de Ética Animal da Universidade de Macquarie. Todas as experiências foram realizadas em ratinhos SJL / J a menos que indicado de outra forma. 1. Ratos e Experimental Malaria Infection <ol><li> Camundongos com temperatura controlada (21 ° C) com um ciclo claro-escuro de 12:12 hr casa. </li><li> Descongelar uma aliquota de criopreservado P. chabaudi Adami DS com 5% de hemácias parasitadas (PRBCs) e injetar 200 mL na cavidade intra-peritoneal de camundongos C57BL / 6 camundongo doador. </li><li> Monitorar doador rato parasitemia a cada 1-2 dias, utilizando a citometria de fluxo, conforme descrito na Seção 3-4 do presente protocolo. Uma vez que os doadores atinge 5-15% parasitemia, coleta de sangue por punção cardíaca, como segue: <ol><li>Aspirar 100 ul de solução de heparina (300 U / ml de heparina em solução de Ringer rato (MTR) (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, MgCl2 1 mM, 2,2 mM de CaCl2, 20 mM de HEPES, 10 mM de glucose, 30 U / ml heparina, pH 7,4, filtro de 0,22 ^ M esterilizado)) numa seringa de 1 ml com uma agulha G 26. </li><li> Anestesiar o mouse por inalação com 5% de isoflurano, confirmando a profundidade desejada da anestesia, pela ausência de resposta de retirada pedal e dos reflexos da córnea. </li><li> Coloque rato sobre o seu lado e perpendicularmente agulha de inserção, logo abaixo do cotovelo, através das costelas, e no coração. Puxe o êmbolo da seringa lenta e gire a agulha até 0,5-1 ml de sangue é obtido. </li><li> Execute eutanásia humanitária por deslocamento cervical sob anestesia. </li></ol></li><li> Calcular as concentrado de hemácias por volume de sangue do dador assumindo uma contagem de sangue de 9 x 10 6 de RBC / ul (ou seja, se o doador estava em 10% quando a parasitemia sacrificados, o sangue conterá 9 x 10 5CH / ul). Dilui-se sangue parasitadas em solução salina de Krebs (NaCl 126 mM, KCl 2,5 mM, NaHCO 3 25, 1,2 mM de NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl2, 2,5 mM de CaCl2, 0,2% de glucose, pH 7,2, filtro de 0,22 ^ M esterilizado) tamponada de modo que a concentração é de 1 x 10 4 concentrado de hemácias por 200 ul e 200 ul injectar na cavidade intraperitoneal de ratinhos necessárias para a marcação de RBC e experimento transfusão. </li><li> Monitorar parasitemia a cada 1-2 dias, utilizando a citometria de fluxo, conforme descrito nas secções 3-4 deste protocolo. </li></ol> 2. A marcação de hemácias e Transfusão <ol><li> Recolha de sangue heparinizado a partir de murganhos, por punção cardíaca, tal como descrito no passo 1.3, e colocar em gelo. Manter sangue a 4 ° C em todos os momentos. Colete aproximadamente 200 sangue ul por mouse para ser injetado. Se necessário, dividida em duas amostras de sangue e tratar uma amostra de como desejar. NOTA: Desta forma, a invasão do samp tratadale pode ser comparado com um controlo, uma amostra não tratada (ver Figura 1 para esquemática). </li><li> Prepara-se uma solução de cada etiqueta fluorescente RBC 2x. <ol><li> Dilui-se uma solução estoque a 2 mg / ml de Atto 633-N-hidroxisuccinimida (NHS Atto-633) em MTR, de modo que a concentração é de 20 ug / ml. </li><li> Dilui-se uma solução estoque de 25 mg / ml de biotina-N-hidroxissuccinimida (biotina-NHS) em MTR, de modo que a concentração é de 250 ug / ml. </li></ol></li><li> Dividir as amostras de sangue em dois tubos e adicionar um volume igual de 2x solução Atto 633-NHS para um tubo, e um volume igual de 2x a biotina-NHS para outro tubo. Misturar imediatamente. Incubar sangue a 4 ° C durante 1 h, com agitação lenta constante, ou, alternativamente, misturar cada amostra de 10 - 15 min. </li><li> Lavar 3 vezes sangue marcadas com MTRC (MTR + 0,5% albumina de soro bovino (BSA), filtro de 0,22 ^ M esterilizado) como se segue: <ol><li> Adicionar pelo menos dois volumes de MTRC, centrifugar a 750 xg durante 5 minutos, remover o sobrenadante, e resuspend o sedimento em, pelo menos, 2 volumes de MTRC. Repita mais duas vezes. </li><li> Após a lavagem final, centrifugar a 750 xg durante 5 min e combinar o sangue sedimentadas em diferentes combinações (ou seja, sem tratamento Atto 633 / Biotina tratada e não tratada Biotina / tratada Atto 633). Adicionar MTR para fazer até um volume de 200 mL por rato para ser injetado. </li></ol></li><li> Injetar sangue marcado intravascular em camundongos infectados roedor malária ou controles não infectados como se segue: <ol><li> Execute transfusão a 2 - 15% parasitemia no auge de parasita esquizogonia. NOTA: isto ocorre aproximadamente a meio do ciclo escuro (ou seja, entre 12-2 da manhã de um ciclo de luz normal, ou 12-2 pm em um ciclo de luz inverso). </li><li> Camundongos morna usando uma lâmpada de calor por 5-10 minutos para aumentar o fluxo sanguíneo, mas tomar precauções para não superaquecer os ratos. Coloque os ratos em um dispositivo de retenção e intravascular injetar 200 mL de sangue marcado (aproximadamente 1 - 2 x 10 9 RBCs) através da veia da cauda. </li></ol></li><li> Coletar amostras de sangue em diferentes momentos após a injeção, conforme descrito na Seção 3. NOTA: As taxas de invasão pode ser quantificada inferior a 10 minutos após a injecção, dependendo da parasitemia do rato destinatário. </li></ol> 3. Recolha de amostras de sangue e Preparação para citometria de fluxo <ol><li> Preparar 50 ml de solução de coloração por amostra, e um pouco mais, no dia da experiência como se segue: <ol><li> Descongelar uma aliquota de 6 JC-1 mM armazenado a -20 ° C em dimetil-sulfóxido (DMSO). </li><li> Quente 50 ul de MTRC por amostra, e um pouco mais, a 37 ° C. </li><li> Embora a vórtex continuamente MTRC pré-aquecido, adicionar JC-1, de modo que a concentração final é de 12 uM. Isto é feito para reduzir a formação de JC-1 agregados; se agregados que formam, fazer tubo não centrífuga, pois isso vai evitar manchas. NOTA: Uma pequena quantidade de agregação não afetará o resultado. </li><li> Adicionar anti-CD45 da APC eFluor 780 e anti-CD71 PerCP eFluor 710 de modo a que a concentração final é de 1 ug / ml. Se o experimento RBC marcado, adicionar estreptavidina PE-Cy7 de modo que a concentração final é de 1 ug / ml. </li></ol></li><li> Realizar cauda sangramento por amputação da ponta da cauda ou a laceração do vaso sanguíneo dentro da cauda. Coloque uma gota de sangue da cauda para um pequeno pesar barco ou lâmina de vidro. Após a coleta de sangue, garantir que o sangramento parou. Pipeta 3 ul de sangue da cauda em 50 ul de solução de coloração pré-aquecido a 37 ° C e incubar as amostras a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Descongelar uma aliquota de 4 mM de Hoechst 33342 armazenado a -20 ° C em água destilada (se usando um laser 355 nm) ou Hoechst 34580 2 mM armazenado a -20 ° C em água destilada (se usando um laser de 405 nm). Prepare 500 mL por amostra, além de extra, de uma solução de 4 mm ou 2 M de Hoechst em MTRC, respectivamente. </li><li> Adicionar 500 uL de 4 uM Hoechst33342 ou 2 uM Hoechst 34580 para as amostras e incuba-se à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Centrifugar células a 750 xg durante 3 min a 4 ° C, o sobrenadante de descarte, adicionar 700 ul MTRC e analisar por citometria de fluxo. </li></ol> 4. Citometria de Fluxo <ol><li> Analisar amostras usando um laser 355/488/633 nm ou 405/488/633 instrumento a laser nm. </li><li> Amostras de filtrar através de um filtro de células 35 mM imediatamente antes da análise. Enxágüe filtro de células com água destilada entre amostras e re-uso. </li><li> Grave eventos suficientes para que a menor população contém, pelo menos, 500 eventos (geralmente 1.000.000 - 10.000.000 Eventos totais por amostra). </li><li> Excite Hoechst 33342 usando um laser de 355 nm e detectar eventos através de um filtro 460/50. Excitar a Hoechst 34580 usando um laser de 405 nm e detectar eventos através de um filtro 460/50. Excitar JC-1, anti-CD71 PerCP eFluor 710 e PE-estreptavidina Cy7 utilizando um laser de 488 nm e detectar eventos através de um 530/40, 692/40, e filtrar 750LP respectivoly. Excite Atto 633 e anti-CD45 APC eFluor 780 usando um laser de 633 nm e detectar eventos através de um filtro de 670/30 ou 750LP respectivamente. </li><li> Realizar análise e compensação usando citometria de fluxo apropriado software de análise da seguinte forma: <ol><li> Selecione as células inteiras e não incluem ruído, resíduos, e plaquetas com base em FSC / propriedades SSC (Figura 2A). Selecione células individuais com base em qualquer largura de pulso de disparo (Figura 2B) ou usando a área do pico do FSC e à altura (Figura 2C). </li><li> Escolher a eritrócitos maduros, e excluir progenitores e leucócitos de RBC, com base na fluorescência negativa nas PerCP eFluor 710 e 780 APC eFluor canais (Figura 2D). </li><li> Se a realização do experimento RBC marcado, selecione cada população de hemácias marcadas com base em PE-Cy7 e Atto 633 fluorescência e analisá-las separadamente (Figura 3A). </li><li> Selecione concentrado de hemácias com base em fluorescência positiva para ambos JC-1 e Hoechst ( <strong&gt; Figura 2E-H). </li></ol></li></ol> 5. cálculos e estatísticas <ol><li> Calcular a parasitemia por divisão do número de concentrado de hemácias pelo número total de glóbulos vermelhos (ou seja, o número de eventos em Q2 portão dividido pelo número de eventos no portão G4). Ao realizar o ensaio de invasão de parasitemia as duas populações marcados podem ser calculadas dividindo o número de concentrado de hemácias marcadas pelo número de glóbulos vermelhos marcados em que a população (isto é, o número de eventos que são tanto em portas de L1 e Q2, dividido pelo número de eventos no portão L1). NOTA: Rotulado parasitemia varia consideravelmente dependendo de fatores como a parasitemia endógeno e número de merozoites circulantes. Por esta razão, é útil para relatar a proporção de parasitemia, que é calculado como a parasitemia da população marcada tratados dividido pelo parasitemia da população de controlo marcado em cada ratinho individual. Para corrigir possíveis efeitos da tintura, relatório resulta umaé uma relação média parasitemia nas duas combinações de corantes. </li><li> Determinar a significância estatística dos índices usando o teste t uma amostra com 1 como a média hipotética. </li></ol>

<ol><li>Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+malaria+parasite-infected+blood+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry.</a> Cytometry. 4 (3), 228-237 (1983).</li>
<li>Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum%3A+rapid+quantification+of+parasitemia+in+fixed+malaria+cultures+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry.</a> Exp Parasitol. 62 (2), 275-282 (1986).</li>
<li>Makler, M. T., Lee, L. G., Recktenwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange%3A+a+new+dye+for+Plasmodium+species+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange: a new dye for Plasmodium species analysis.</a> Cytometry. 8 (6), 568-570 (1987).</li>
<li>Heyde, H. C., Elloso, M. M., van de Waa, J., Schell, K., Weidanz, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+hydroethidine+and+flow+cytometry+to+assess+the+effects+of+leukocytes+on+the+malarial+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of hydroethidine and flow cytometry to assess the effects of leukocytes on the malarial parasite Plasmodium falciparum.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 2 (4), 417-425 (1995).</li>
<li>Pattanapanyasat, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+malaria+parasites+in+two+different+red+blood+cell+populations+using+biotin+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry.</a> Cytometry. 25 (3), 287-294 (1996).</li>
<li>Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Plasmodium+falciparum+growth+and+development+by+UV+flow+cytometry+using+an+optimized+Hoechst-thiazole+orange+staining+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy.</a> Cytometry A. 73 (6), 546-554 (2008).</li>
<li>Theron, M., Hesketh, R. L., Subramanian, S., Rayner, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adaptable+two-color+flow+cytometric+assay+to+quantitate+the+invasion+of+erythrocytes+by+Plasmodium+falciparum+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">An adaptable two-color flow cytometric assay to quantitate the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum parasites.</a> Cytometry A. 77 (11), 1067-1074 (2010).</li>
<li>Bei, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometry-based+assay+for+measuring+invasion+of+red+blood+cells+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum.</a> Am J Hematol. 85 (4), 234-237 (2010).</li>
<li>Clark, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBC+barcoding+allows+for+the+study+of+erythrocyte+population+dynamics+and+P.+falciparum+merozoite+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion.</a> PLoS One. 9 (7), e101041(2014).</li>
<li>Malleret, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+robust+tri-color+flow+cytometry+assay+for+monitoring+malaria+parasite+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development.</a> Sci Rep. 1 (118), (2011).</li>
<li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+Plasmodium-infected+erythrocytes+in+murine+models+of+malaria+by+flow+cytometry+using+bidimensional+assessment+of+SYTO-16+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence.</a> Cytometry A. 75 (3), 225-235 (2009).</li>
<li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+detection+specificity+of+Plasmodium-infected+murine+erythrocytes+by+flow+cytometry+using+autofluorescence+and+YOYO-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1.</a> Cytometry A. 67 (1), 27-36 (2005).</li>
<li>Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+Plasmodium+parasitemia+by+flow+cytometry+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Korean+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy.</a> J Korean Med Sci. 27 (10), 1137-1142 (2012).</li>
<li>Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometric+assay+to+quantify+invasion+of+red+blood+cells+by+rodent+Plasmodium+parasites+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo.</a> Malar J. 13 (1), 100(2014).</li>
<li>Morohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+abnormalities+in+the+spleen+of+an+mFtz-F1+gene-disrupted+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse.</a> Blood. 93 (5), 1586-1594 (1999).</li>
<li>Shet, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+platelet+abnormalities+in+Berkeley+sickle+cell+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice.</a> Blood Cells Mol Dis. 41 (1), 109-118 (2008).</li>
<li>Duraisingh, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+of+Plasmodium+falciparum+merozoite+proteins+directs+receptor+targeting+for+invasion+of+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes.</a> EMBO J. 22 (5), 1047-1057 (2003).</li>
<li>Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+field+isolates+commonly+use+erythrocyte+invasion+pathways+that+are+independent+of+sialic+acid+residues+of+glycophorin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A.</a> Infect Immun. 67 (11), 5784-5791 (1999).</li>
<li>Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+switching+mechanism+in+the+invasion+of+erythrocytes+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum.</a> J Clin Invest. 86 (2), 618-624 (1990).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Descrevemos um método para a medição de ambos parasitemia e merozóitos de invasão in vivo amostras. Em relação à medida da parasitemia, este método oferece uma vantagem sobre os métodos anteriores em que 10-13 HJ-GVs podem ser distinguidas a partir de concentrado de hemácias, reduzindo assim o número de eventos positivos falsos. Enquanto HJ-hemácias são geralmente rara em humanos, alguns estudos relatam altos níveis em ratos 15,16 fazendo a distinção entre essas células e concentrado de he...

Os sintomas clínicos associados à malária ocorrem durante o ciclo replicativo assexuado do parasita Plasmodium dentro dos glóbulos vermelhos (hemácias). Os merozoítos, liberados durante o estágio hepático da infecção, rapidamente se ligam e invadem as hemácias. Depois de entrar na célula, o parasita cresce e amadurece, eventualmente passando por esquizogonia, dividindo a célula e liberando um aglomerado de merozoítos recém-formados que repetem esse ciclo. Como tal, uma avaliação da infecção por malária geralmente envolve o monitoramento tanto da parasitemia, que é a porcentagem de hemácias apropriadas por um ou mais parasitas, quanto da taxa de invasão de merozoítos em hemácias não infectadas. 
A citometria de fluxo é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para registrar as propriedades de um grande número de células em um curto período de tempo. Essa técnica tem clara aplicabilidade para a mensuração da parasitemia e invasão da malária e oferece várias vantagens em relação às técnicas tradicionais de microscopia. Isso inclui a medição precisa de parasitemia muito baixa, que seria proibitivamente demorada por microscopia, a natureza imparcial da medição e a capacidade de medir vários parâmetros celulares simultaneamente. A citometria de fluxo é amplamente utilizada para determinar tanto a parasitemia quanto a invasão de merozoítos em cultura in vitro 1-9, no entanto, as técnicas de mensuração desses parâmetros in vivo são menos desenvolvidas e podem ser complicadas pela presença de tipos celulares adicionais que interferem na análise. Nenhum ensaio foi descrito para medição de invasão in vivo e, embora existam alguns ensaios para a análise de parasitemia in vivo, eles não têm a capacidade de distinguir entre hemácias parasitadas (pRBCs) e hemácias contendo corpos de Howell-Jolly (HJ-RBCs)10-13. A última questão é particularmente importante, pois em camundongos as hemácias HJ podem representar até 0,9% das hemácias maduras14-16, impedindo assim a medição precisa da baixa parasitemia. 
Demonstramos anteriormente uma abordagem para a medição da parasitemia e invasão de merozoítos em um modelo de infecção por malária em roedores14. Aqui, fornecemos um protocolo mais detalhado e o vídeo que o acompanha. Essa abordagem se baseia em metodologias anteriores e permite a identificação precisa de hemácias parasitadas, distintas de leucócitos, progenitores de hemácias e hemácias HJ. Além disso, este ensaio permite a medição simultânea da invasão de merozoítos em duas populações de hemácias marcadas, uma população tratada ou alvo e uma população controle, fornecendo assim uma plataforma robusta para a avaliação da invasão em diferentes tipos de células.

<table><tbody><tr><td>bisBenzimida H 33342 tricloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Hoechst 33342. Armazenar uma solução de reserva a 4 mM a -20 &graus; C em água destilada</td></tr><tr><td>Hoechst 34580</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63493</td><td>Armazenar uma solução de estoque de 2 mM a -20 &graus; C em água destilada</td></tr><tr><td>JC-1 Dye</td><td>Life Technologies</td><td>T-3168</td><td>Armazene pequenas alíquotas de solução estoque de 6 mM a -20 &graus; C em DMSO</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>47-0451-80</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710</td><td>eBioscience</td><td>46-0711-80</td><td>Clone R17217</td></tr><tr><td>Atto 633 NHS éster</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1464</td><td>Atto 633-NHS. Conservar uma solução-mãe de 2 mg/ml a -20 °; C em DMF</td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21335</td><td>Biotina-NHS. Conservar uma solução-mãe de 25 mg/ml a -20 &graus; C em DMF</td></tr><tr><td>Estreptavidina PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td>Estreptavidin PE-Cy7</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H478</td><td></td></tr><tr><td>35 &micro; Tubos de tampa de filtro</td><td>M Citômetro de fluxo Becton Dickinson</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>: BD LSRFortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo: BD FACSAria II</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo: BD Influx</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo: CyAn ADP Analyzer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a avaliação in vivo de rodent plasmodium parasitemia e merozoito invasion por citometria de fluxo

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

Durante a infecção do estágio sanguíneo, os parasitas da malária invadem, amadurecem e se replicam dentro dos glóbulos vermelhos (hemácias). Isso resulta em um ciclo de crescimento regular e um aumento exponencial na proporção de hemácias infectadas com malária, conhecido como parasitemia. Descrevemos um protocolo baseado em citometria de fluxo que utiliza uma combinação do corante de DNA Hoechst e do corante potencial de membrana mitocondrial, JC-1, para identificar hemácias que contêm parasitas e, portanto, a parasitemia, de amostras de sangue in vivo de camundongos infectados com Plasmodium chabaudi adami DS. Usando essa abordagem, em combinação com anticorpos conjugados fluorescentemente, as hemácias parasitadas podem ser distinguidas de leucócitos, progenitores de hemácias e hemácias contendo corpos de Howell-Jolly (HJ-RBCs), com um limite de detecção de 0,007% de parasitemia. Além disso, delineamos um método para a avaliação comparativa da invasão de merozoítos em duas populações diferentes de hemácias. Neste ensaio, as hemácias, marcadas com dois compostos distintos identificáveis por citometria de fluxo, são transfundidas em camundongos infectados. A taxa relativa de invasão nas duas populações pode então ser avaliada por citometria de fluxo com base na proporção de hemácias parasitadas em cada população ao longo do tempo. Essa abordagem combinada permite a medição precisa da parasitemia e da invasão de merozoítos em um modelo in vivo de infecção por malária.

Medição da parasitemia. Para a medição da parasitemia, células sanguíneas devem primeiro ser seleccionado, e o ruído, detritos e plaquetas excluídos, com base no FSC / SSC propriedades (Figura 2A). Dependendo do citómetro usado, células individuais devem, então, ser seleccionado com base em qualquer largura de impulsos de disparo (Figura 2B), ou FSC altura de pico com razão de área (Figura 2C). Restante eventos deve ser composto de leucócitos, ...

Os invade parasita da malária e repetições dentro das células vermelhas do sangue. A avaliação precisa da invasão merozoite e parasitemia é fundamental para avaliar o curso da infecção da malária. Aqui nós descrevemos um protocolo de citometria de fluxo com base para a medição desses parâmetros em um modelo de rato da malária.

A avaliação in vivo de Rodent Plasmodium parasitemia e Merozoito Invasion por citometria de fluxo

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

O objetivo geral deste procedimento é medir a invasão de parásitos e merizontos em um modelo murino de infecção por malária. Isso é realizado primeiramente coletando sangue de animais não infectados. As hemácias são então marcadas com marcadores fluorescentes e injetadas em animais infectados.As amostras de sangue são então coletadas dos camundongos infectados e marcadas com anticorpos contra os marcadores de superfície celular apropriados de interesse. Por fim, o número de células não infectadas que foram invadidas por plasmodium shabo meite, bem como a parasitemia geral dos animais infectados, pode ser medido por análise citométrica de fluxo. Assim, a principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes para a medição da invasão por meite e parasitemia é que o ensaio é realizado in vivo, permitindo, dessa forma, a consideração de fatores como a influência do sistema imunológico.Assim, este método pode abordar algumas questões-chave na área da malária, como quais são os elementos específicos envolvidos na invasão de eritrócitos pelo MI. Antes de iniciar o ensaio, obtenha seis a oito camundongos infectados com Plasmodium shaboe em 2 a 15% de parasitemia, cerca de três horas antes da transfusão. Colete 200 microlitros de sangue heparinizado por camundongo a ser injetado em animais não infectados por punção cardíaca. Divida o sangue em duas alíquotas iguais para as amostras tratadas e não tratadas e coloque os tubos no gelo.Em seguida, divida as amostras em mais dois alíquotas iguais cada. Então, adicione um volume igual da solução recém-diluída de dois XAO 6 33 N hs a um tubo e um volume igual do dois x biotina NHS ao outro, para ambos os grupos de amostras tratadas e não tratadas. Em seguida, misture imediatamente os tubos e incube o sangue a quatro graus Celsius, com mistura a cada 10 a 15 minutos, após uma hora.Lave o sangue marcado três vezes com pelo menos dois volumes de solução de Ringer para camundongo, suplementada com BSA em cada lavagem após a terceira lavagem. Centrifugue as células pela última vez sem solução de lavagem e, em seguida, combine as amostras em pellet conforme ilustrado. Adicione solução de Ringer para camundongo até um volume final de 200 microlitros de solução por camundongo a ser injetado.Em seguida, no pico da fase esquizogônica do parasita, aqueça os animais infectados com plasmódio shabo sob uma lâmpada de calor. Após cinco a dez minutos, coloque os camundongos individualmente em um dispositivo de contenção e injete intravascularmente 200 microlitros do sangue marcado pela veia da cauda nos pontos terminais experimentais apropriados. Prepare a solução de coloração adicionando JC um à solução de Ringer para camundongo aquecida a 37 graus Celsius.Suplemente com BSA enquanto vórtex é contínuo na solução para reduzir a formação de agregados de JC um. Em seguida, adicione os anticorpos apropriados à solução. Então, colete pelo menos uma gota de sangue da cauda por camundongo em um barco de soro, e imediatamente pipete três microlitros de cada amostra de sangue da cauda em 50 microlitros de solução de coloração a 37 graus Celsius.Após 20 minutos, adicione 500 microlitros da solução cardíaca apropriada recém-descongelada às amostras para uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue as células, descarte o sobrenadante e adicione 700 microlitros de solução ringer para camundongo suplementada com BSA a cada amostra imediatamente antes da análise das células. Então, filtre cada amostra através de um filtro celular de 35 mícrons, lavando o filtro com água destilada entre cada tubo. Em seguida, registre pelo menos 500 eventos para a população menor.Selecione as células inteiras, excluindo o ruído, detritos e plaquetas, com base nas propriedades de dispersão para frente e dispersão lateral das amostras. Em seguida, selecione as células individuais com base na largura do pulso de disparo ou utilizando a razão entre a área de pico e a altura da dispersão para frente. Depois, utilize a fluorescência negativa nos canais per CPE floor sete 10 e A PCE floor sete 80.Para selecionar ainda mais os eritrócitos maduros e excluir os precursores de eritrócitos e leucócitos no experimento com eritrócitos marcados, selecione cada população de eritrócitos marcados com base no tamanho do PE sete e na expressão de A oh 6 33, e analise esses grupos separadamente. Por fim, selecione os eritrócitos parasitados com base na expressão positiva de JC um e herst. Em animais infectados com malária, a população duplamente positiva representa os eritrócitos parasitados, enquanto as populações restantes são eritrócitos não infectados.Como será o corpo Jolie contendo hemácias ou células desconhecidas? Normalmente, suas hemácias positivas para JC um e negativas representam de 0,3 a 0,9% das hemácias maduras, tornando a adição do corante JC um passo crítico para a medição de baixas parasitemias. Em amostras não infectadas, menos de 0,007% dos eventos devem ser duplamente positivos, dependendo da limpeza do citômetro de fluxo, o que pode variar consideravelmente após a injeção de hemácias marcadas em camundongos infectados.As populações de hemácias marcadas com biotina O633 e não marcadas devem ser analisadas separadamente, com uma parte de cada grupo determinada de acordo com seus ganchos e fluorescência JC um. Esses dados podem então ser utilizados para determinar as taxas relativas de invasão nas duas populações marcadas. Assim, seguindo este procedimento, a eficiência de invasão de Zoya pode ser comparada entre hemácias de diferentes tipos, a fim de descobrir elementos essenciais para este processo.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar para no modelo mais comum de infecção por malária e de como comparar a eficiência de invasão de me in vivo por citometria.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Microscopia intravital para seguir temporal e espacial eventos inflamatória e hemodinâmica na microcirculação pial.

Microscopia intravital da Microcirculação cérebro de camundongo usando uma janela fechada Cranial

Cruzamentos genéticos de parasitas da malária em roedores são realizadas, alimentando dois parasitas geneticamente distintas para os mosquitos. Progênie recombinante são clonados a partir de sangue do rato depois de permitir que mosquitos a morder camundongos infectados. Este vídeo mostra como produzir cruzamentos genéticos...

Protocolo para produção de uma Cruz genética do parasita da malária de roedores

Nós mostramos o método para a realização de microscopia intravital do baço usando parasitas da malária transgênica GFP ea quantificação da mobilidade do parasita e do fluxo sanguíneo dentro do órgão.

Microscopia intravital do Baço: Análise Quantitativa da Mobilidade Parasite e do fluxo sanguíneo

Este vídeo demonstra um ensaio de fagocitose baseado em citometria de fluxo envolvendo eritrócitos infectados por Plasmodium falciparum marcados e opsonizados por monócitos. A citometria de fluxo identifica fluorescência em monócitos, confirmando a identificação bem-sucedida de eritrócitos opsonizados por meio de fagocitose.

Um ensaio para quantificar a fagocitose mediada por anticorpos de eritrócitos infectados por parasitas

Este vídeo demonstra um ensaio para quantificar o crescimento intracelular de parasitas em macrófagos derivados da medula óssea (BMMs). As células de macrófagos estão infectadas com os estágios invasivos móveis e imóveis de Leishmania, promastigotas metacíclicos e amastigotas, respectivamente. Os parasitas invadem os macrófagos, internalizando-se em um vacúolo parasitóforo e se multiplicando em seu interior. O crescimento do parasita intracelular é quantificado usando um microscópio após a...

Um ensaio in vitro para quantificar o crescimento intracelular do parasita em macrófagos

Um método para o isolamento de leucócitos aderentes inflamatórios dos vasos sanguíneos do...

Isolamento e Análise de Cérebro-sequestrados de Leucócitos<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA infectadas Mice

Este artigo relata um método detalhado para a medição dinâmica e quantificação da velocidade do fluxo sanguíneo dentro dos vasos sanguíneos individuais da vasculatura hepática de camundongo usando imagens de microscopia intravital em combinação com uma metodologia específica para aquisição e análise de imagens.

Microscopia intravital Imagem do Fígado seguinte<em&gt; Leishmania</em&gt; Infecção: Uma Avaliação de hepáticas Hemodinâmica

A coinfecção humana é difícil de replicar in vitro. No entanto, os parasitas da malária humana podem ser facilmente cultivados in vitro, assim como as células mononucleares do sangue periférico humano recém-isoladas naturalmente infectadas com o HIV. Isso fornece um excelente modelo para estudar as respostas imunes precoces aos parasitas da malária no contexto da coinfecção pelo HIV.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medição de respostas imunes a Malária no Contexto do HIV co-infecção

Descrevemos um modelo de camundongo de malária cerebral experimental e mostramos como a patologia inflamatória e microvascular pode ser rastreada in vivo usando ressonância magnética.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology em um Modelo de Malária Cerebral Experimental Usando Ressonância Magnética

Devido às semelhanças marcantes do ciclo de vida e biologia de parasitas da malária de roedores para parasitas da malária humana, modelos de malária de roedores tornaram-se indispensáveis para a pesquisa da malária. Neste documento, padronizamos algumas das técnicas mais importantes utilizadas na análise fenotípica de espécies selvagens e transgênicas de malária por roedores.

Análise fenotípica de roedores malária parasita assexuada e estágios do sangue sexual e estágios do mosquito

Aqui descrevemos um novo método para ajudar a elucidar os mecanismos de imunidade celular ao Plasmodium durante a fase sanguínea da infecção. Este é um ensaio in vitro que mede a morte de hemácias infectadas por linfócitos citotóxicos.

In vitro Ensaio de Morte de Hemácias Infectadas por Plasmodium por Linfócitos Citotóxicos

Aprenda a medir invasão de merozoítos e parasitemia em modelo murino de malária usando citometria de fluxo. Este método permite análise in vivo precisa da dinâmica da infecção por Plasmodium.

A avaliação in vivo de Rodent Plasmodium parasitemia e Merozoito Invasion por citometria de fluxo

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