Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

O objetivo geral deste procedimento é localizar proteínas de interesse no tecido mamário do camundongo durante a lactação. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular, como onde as proteínas instantâneas envolvidas na secreção do produto médio, localizadas no camundongo, células epiteliais mamárias durante a lactação. A principal vantagem dessa técnica é que você pode observar rápida e facilmente a localização das proteínas em um determinado contexto de tecido.

Após a eutanásia, posicione o camundongo de costas, molhe a área ventral com etanol e seque-a com uma toalha de papel. Em seguida, use uma pinça para puxar a pele abdominal entre as duas patas traseiras e faça uma incisão de um centímetro de comprimento através da pele com uma tesoura afiada. A partir desta primeira incisão, corte a pele até o pescoço e, em seguida, puxe a pele para longe do peritônio.

Prenda um lado da pele de cada vez, esticando cada lado esticado. Em seguida, use um cotonete estéril para empurrar as glândulas mamárias abdominais e inguinais para longe da pele e dissecá-las para longe do peritônio. Coloque o tecido mamário dissecado em uma placa de dissecção resfriada por gelo.

Finalmente, remova o linfonodo localizado na junção das glândulas abdominal e inguinal Usando um bisturi. Corte o tecido de memória em fragmentos de aproximadamente três milímetros cúbicos de tamanho e enxágue imediatamente esses fragmentos em PBS. Para remover o máximo de leite possível, seque rapidamente os fragmentos em uma toalha de papel e coloque-os em uma solução de PBS gelada contendo 4% de formaldeído por 10 a 15 minutos no gelo.

Para fixar suavemente o tecido após a fixação, enxágue rapidamente os fragmentos mamários em PBS gelado e, em seguida, mergulhe os fragmentos em PBS gelado contendo 40% de sacarose por 16 a 48 horas a quatro graus Celsius. Enquanto agita suavemente corretamente, rotule os moldes criogênicos de plástico e, em seguida, preencha-os um terço do caminho com composto de temperatura de corte ideal à temperatura ambiente. Coloque um fragmento contendo dois a três milímetros cúbicos de tecido mamário em cada molde e cubra-os com composto adicional.

Em seguida, congele o composto de temperatura de corte ideal e a amostra, colocando os moldes na superfície de um banho de nitrogênio líquido até que todo o molde fique opaco. Armazene os blocos no freezer a menos 80 graus Celsius até que as amostras sejam seccionadas. Ajuste a temperatura do criostato para menos 26 graus Celsius e espere até que a temperatura se estabilize.

Enquanto isso, coloque os blocos a serem seccionados no criostato para que possam se equilibrar a menos 26 graus Celsius. Também. Mantenha o bloco de tecido congelado congelado durante todo o procedimento de seccionamento.

Além disso, resfrie a lâmina de barbear, o corte. Apoie o dispositivo anti-rolamento e a escova a menos 26 graus Celsius, colocando-os no criostato por pelo menos 10 minutos. Além disso, coloque uma caixa de slides dentro do criostato para poder armazenar lâminas de vidro à medida que as seções são feitas.

Enquanto esses itens esfriam, rotule adequadamente as lâminas de vidro carregadas positivamente que serão usadas para coletar as seções de tecido e mantê-las em temperatura ambiente. Em seguida, remova uma amostra de seu molde. Cubra a superfície de um disco de tecido de metal com composto de temperatura de corte ideal em temperatura ambiente e empurre a amostra congelada sobre ele.

Coloque o suporte úmido dentro do criostato e deixe esfriar por pelo menos 15 minutos. Uma vez resfriado, coloque o suporte úmido no suporte do disco do criostato e ajuste a espessura do corte entre cinco e seis mícrons. Em seguida, ajuste a posição do dispositivo anti-rolamento fazendo cortes no meio de montagem até que as fatias se formem de maneira uniforme e correta.

Quando as configurações estiverem corretas, execute as seções de tecido girando a roda em um movimento uniforme contínuo. Use um pincel para agarrar e manobrar a seção pelo palco. Recupere as seções de tecido uma a uma, segurando a luz de vidro acima da seção e inclinando-a lentamente para baixo até que a seção de tecido toque a lâmina.

Usando uma caneta de barreira hidrofóbica, desenhe um círculo ao redor do tecido montado na lâmina. Deixe o círculo secar por aproximadamente um minuto em temperatura ambiente. Em seguida, use um marcador permanente para desenhar uma linha ao redor das seções de tecido na parte de trás da lâmina.

Em seguida, hidratamos as seções de tecido cobrindo-as com uma gota de PBS por alguns minutos em temperatura ambiente. Em seguida, fixe as seções de tecido cobrindo-as com solução de aldeído 3% PARAFORM recém-preparada em PBS por 10 a 15 minutos. Em seguida, permeie-os em PBS com saponina 0,05% por 10 a 15 minutos.

Em seguida, incube-os em PBS com albumina sérica bovina a 3% por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente após a recuperação do antígeno Quando necessário, enxágue as seções de tecido com PBS e depois incube-as em PBS com 3% de albumina sérica por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução de bloqueio e a 30 a 50 microlitros de anticorpo primário diluído em PBS contendo 2% de BSA, de modo que cada seção de tecido seja completamente coberta. Colocar o mesmo volume do diluente sozinho numa secção de tecido para efectuar um controlo negativo.

Em seguida, coloque as lâminas de vidro em uma caixa umidificada durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Lave bem as seções de tecido com PBS em temperatura ambiente por 10 minutos e repita pelo menos quatro vezes. Dilua o anticorpo secundário apropriado em PBS contendo 2% BSA de acordo com as instruções do fabricante e, em seguida, coloque 30 a 50 microlitros dessa solução em todas as seções de tecido.

Incube as seções por uma hora e meia em temperatura ambiente. Em seguida, lave bem as seções de tecido novamente com PBS em temperatura ambiente por 10 minutos e repita pelo menos quatro vezes. Em seguida, pinte os lipídios neutros nas seções incubando o tecido em 30 a 50 microlitros de solução A PBS contendo três microgramas por mililitro de boda P 4 93, 5 0 3 por 10 minutos em temperatura ambiente.

Após a incubação, enxágue rapidamente as seções de tecido duas vezes com contracoloração PBS, o DNA nuclear com 30 a 50 microlitros de uma solução PBS contendo três DPI micromolares por 10 minutos em temperatura ambiente. Lave as seções de tecido duas vezes com PBS antes de montar as lâminas. Para observação, remova o PBS e coloque uma gota de meio de montagem em cada seção de tecido.

Em seguida, coloque um lado de uma lamínula em um ângulo contra a corrediça que faz contato com a borda externa da gota de líquido e, em seguida, abaixe a tampa lentamente, evitando bolhas de ar. Deixe o líquido se espalhar entre a lâmina de vidro e a lamínula por alguns minutos e, em seguida, remova o excesso de suporte de montagem com uma toalha de papel. Sele a lamínula na lâmina de vidro com esmalte e armazene as seções de tecido a quatro graus Celsius.

Por fim, crie uma imagem das seções conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Essas imagens mostram a localização de caines na glândula mamária de camundongos lactantes. No dia 10 de lactação, na presença ou ausência de filhotes durante a amamentação, as cainas parecem estar acumuladas principalmente na região apical.

Além disso, a microscopia confocal revela que os caines também estão presentes, embora em menor grau, no lado basal das células secretoras epiteliais na presença de filhotes quando a secreção de leite é retardada, os caines também aparecem acumulados sob a membrana plasmática apical e são claramente observados no lado basal da memória. Células secretoras epiteliais A butirofilina mostrada em vermelho é uma das principais proteínas associadas ao leite, gordura, glóbulos e leite. Esta proteína transmembrana está localizada principalmente na membrana plasmática apical das células secretoras epiteliais mamárias e, consequentemente, é encontrada na superfície dos glóbulos de gordura do leite após ser liberada pelo brotamento Unmastered.

A visita pode ser feita em oito a 10 horas se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter longe da luz durante o procedimento de detecção imunológica Após este procedimento. Outros métodos, como a detecção de ImmunoGold usando microscopia eletrônica de transmissão, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a localização subcelular da proteína de interesse após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular explorarem a localização de proteínas em tecidos normais e patológicos em várias espécies. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como ajudar a servir a distribuição tecidual de uma proteína de interesse. Não se esqueça que trabalhar com animais, regiões e alguns instrumentos pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar luvas e trabalhar sob um exaustor devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.