Precisas e Fenol DNA Sexagem gratuito do dia 30 de Porcina embriões por PCR

O objetivo geral deste procedimento é identificar com precisão o sexo dos embriões de porco do dia 30, usando DNA livre de fenol obtido de cada embrião. E dois pares de primers específicos para sexo para uma reação de PCR. Este método tem o potencial de responder a várias questões relacionadas à fisiologia reprodutiva na pecuária, como o efeito de fatores maternos na proporção sexual, incluindo a capacidade uterina e o estado metabólico da porca, bem como vários fatores paternos.

A vantagem dessa técnica envolve a ausência de produtos químicos tóxicos, como fenol-clorofórmio, ou colunas caras durante a purificação do DNA. Então, vamos colocar o show na estrada. A demonstração visual desse método é tão importante quanto a preparação dos sintomas.

Os passos são fáceis de aprender, mas é importante um cuidado especial com os detalhes, para evitar a contaminação cruzada dos sintomas. Transfira amostras de embriões para um freezer negativo de oitenta graus Celsius, de acordo com o texto. Rotule os tubos de amostra com o ID de amostra necessário para o número de amostras a serem analisadas.

Use gelo seco para encher um recipiente térmico até a metade e insira um sample tubo pré-rotulado no gelo seco. Usando luvas de inverno, com um par de luvas de exame por cima, transfira almofarizes e pilões pré-resfriados do freezer negativo de oitenta graus Celsius para um recipiente de gelo seco. Em seguida, coloque um embrião congelado dentro da argamassa sobre o gelo seco e, em seguida, despeje nitrogênio líquido adequado para cobrir o embrião.

E use um pilão para moê-lo em um pó fino. Usando uma microespátula, transfira o pó do embrião para um tubo de amostra pré-rotulado e coloque o tubo no freezer de oitenta graus negativos. Repita a trituração e o congelamento de cada embrião adicional, trocando as luvas de exame entre as amostras para evitar contaminação cruzada.

Depois de rotular todos os tubos microcentrifugados necessários para o número de amostras a serem analisadas, transfira os tubos de amostra contendo pó de embrião do freezer negativo de oitenta graus Celsius para um recipiente com gelo seco. Pipetar 180 microlitros de hidróxido de sódio a 50 milimolares em cada tubo microcentrifugado pré-labado. Pré-aqueça uma incubadora a noventa e cinco graus Celsius.

Com um palito, transfira aproximadamente cinco a dez miligramas de pó de embrião de um tubo de amostra para um tubo pré-rotulado de hidróxido de sódio. Levante lentamente o palito da solução para visualizar o lisado de DNA como uma substância branca pegajosa e transparente. Transfira as amostras com lisado de DNA para a incubadora de noventa e cinco graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, transfira imediatamente o tubo para um recipiente isolado cheio de gelo.

Em seguida, adicione vinte microlitros de um triscloridrato molar diretamente nos tubos e bata nos tubos para misturar suavemente. Com papel de pH, certifique-se de que o pH seja de aproximadamente 8,0. Em seguida, centrifugue os tubos a dois mil G e temperatura ambiente por dois minutos para remover os detritos de tecido não dissolvidos.

Transferir 150 microlitros do sobrenadante superior transparente para novos tubos. Ou uma placa de 96 poços. E armazene a quatro graus Celsius por até duas semanas.

Ou, vinte graus Celsius negativos por até um ano. O sucesso deste protocolo depende de quão específico você projeta seu primer nos cromossomos X e Y. Então, como você se certifica de que eles estão nos cromossomos X e Y?

Usar o NCBI Map Viewer é a melhor maneira de mostrar isso. Para projetar primers específicos para sexo para PCR, use o site do NCBI para obter números de acesso para a região determinante do sexo do sinal de poro Y.Ou SRY e proteína de dedo de zinco ligada ao X, ou ZFX. Copie e cole os números de acesso em uma ferramenta de design de primer online.

Use explosão de nucleotídeo ou explosão N para validar a especificidade dos primers em relação ao banco de dados genômico de sinal de poro atual 104. Para entrar nas sequências, estão localizados apenas no cromossomo X e Y para SRY e ZFX, respectivamente. Para realizar a PCR com os lisados de DNA, use qualquer enzima de PCR de mistura pronta para partida a quente e prepare uma mistura principal adicionando dois primers específicos para o sexo a uma concentração final de 0,3 micromolar em uma reação de PCR de 15 microlitros.

Pela primeira vez em execução, as reações preparam um tubo de PCR para o controle negativo sem modelo e dois tubos adicionais para controles positivos, adicionando um microlitro de DNA genômico de sinal de poro sexual obtido comercialmente. Para as rondas subsequentes de PCR, incluir um microlitro de uma amostra da última análise de sexagem bem-sucedida como controlo positivo. Configure o seguinte programa de PCR em um termociclador e realize a PCR.

Para varificar as amostras após a PCR, prepare um gel de agarose 2% TBE com coloração de gel de DNA cibernético ou brometo de etídio. Adicione 1,5 microlitros de corante de carga 10X às amostras antes de carregar no gel e correr. Observe e ajuste as intensidades da banda sob luz fluorescente e capture uma imagem do gel.

Identifique embriões com uma banda como feminina e duas bandas como masculina. Aqui é mostrado um resultado representativo para determinação do sexo de 345 lisados de DNA rastreados por PCR. A temperatura de recozimento ideal do primer de 65 graus Celsius é visivelmente mais alta do que a TM dos primers mostrados aqui para gerar intensidade semelhante e tamanhos de ampilcon previstos.

Dois produtos amplificados de SRY e ZFX são apresentados aqui. A amostra de lisado de embriões femininos produz apenas uma única banda de fragmentos de DNA de 506 pares baseados no gene ZFX localizado no cromossomo X. Todos os embriões masculinos produzem dois fragmentos de DNA com igual intensidade de 400 pares de bases para SRY e 506 pares de bases para ZFX.

Como mostrado aqui, os lisados de DNA não mostraram nenhuma inibição da reação de PCR após a triagem de 345 embriões. Apenas três indivíduos não foram sexados e a porcentagem de embriões femininos foi ligeiramente maior que a masculina. Uma vez que essa técnica é dominada desde a moagem até a realização de PCR, leva cerca de uma hora para processar cerca de dez embriões.

Ao fazer esta técnica, é importante evitar a contaminação cruzada, especialmente ao transferir o pó do embrião para os tubos. Após este procedimento, podemos usar outros métodos, como metilação do DNA, microarray e sequenciamento para investigar os efeitos genômicos e epigenéticos da nutrição e doenças infecciosas entre os sexos. O desenvolvimento dessa técnica abrirá caminho para que pesquisadores das áreas de fisiologia reprodutiva e zootecnia realizem pesquisas relacionadas ao dimorfismo sexual em diversas espécies de gado.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar primers específicos para o sexo, abstrair o DNA dos embriões e realizar a reação de PCR usando lisados de DNA. Lembre-se de que trabalhar com gelo seco é bastante perigoso, portanto, tome as devidas precauções ao usar luvas e óculos de proteção.