Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS

O objetivo geral deste procedimento é isolar fibroblastos usando FACS, renunciando assim à cultura in vitro, que demonstrou causar uma alteração fenotípica nessas células. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia do desenvolvimento e na cicatrização de feridas, como identificar subtipos de fibroblastos envolvidos em cicatrizes e fibrose. A principal vantagem desta técnica é que os experimentos in vitro são evitados como aderência ao plástico, masculino ao fenótipo do fibroblasto.

Esse método não apenas pode fornecer informações sobre fibroblastos dérmicos, mas também pode ser aplicado a outros sistemas, como fibroblastos peritoneais e aderências abdominais. Comece raspando e depilando a pele dorsal do camundongo de interesse. Em seguida, mergulhe o camundongo desnudo em etanol a 70% e coloque o animal em uma superfície limpa e estéril para secar.

Em seguida, começando na base da cauda, use uma pinça para cobrir a pele e faça um corte transversal com uma tesoura de dissecação. Em seguida, disseque ao longo do plano suprafascial para colher o tecido dorsal. Quando um pedaço de pele de 60 por 100 milímetros for removido, use a ponta cega de um bisturi para remover cuidadosamente qualquer gordura subcutânea.

Em seguida, enxágue a pele colhida em betadine, seguido de cinco lavagens de PBS com gelo. Usando lâminas de barbear e tesouras de dissecação, pique os pedaços de derme em um prato estéril até que as amostras tenham aproximadamente dois a três milímetros de tamanho. Em seguida, transfira fragmentos de tecido de até cinco camundongos para o número apropriado de tubos cônicos individuais de 50 mililitros contendo 20 mililitros de colagenase 4 em dmem.

Agite as amostras vigorosamente a 37 graus Celsius. Após uma hora, transfira os tubos para uma capa estéril e passe as rajadas de tecido por uma seringa desnecessária de 10 mililitros três a cinco vezes. Retorne as amostras ao agitador por mais 30 minutos, seguidas por mais três a cinco pipetas com uma seringa de 10 mililitros.

Em seguida, filtre as amostras através de um filtro de 100 mícrons em um novo tubo de 50 mililitros e lave a malha com 20 mililitros de dmem, suplementado com FBS para elevar o volume total para 40 mililitros. Em seguida, gire as células e use uma pipeta de vidro estéril para aspirar a camada superior de gordura. Quando os locais adiposos contaminantes forem removidos, use uma nova pipeta de vidro para remover o restante do sobrenadante e ressuspenda os pellets em 20 mililitros de dmem mais FBS.

Agora, filtre as células através de um filtro de 75 mícrons e enxágue a malha com 10 mililitros de dmem mais FBS. Em seguida, gire as células novamente e remova a gordura e o sobrenadante como acabamos de demonstrar. Ressuspenda o pellet em 20 mililitros de tampão FACS, reservando uma alíquota de cinco mililitros para o controle não corado.

Em seguida, gire a amostra restante, descarte o sobrenadante e coloque o pellet no gelo. Para isolar os fibroblastos por FACS, ressuspenda os pellets em 500 microlitros de mistura de incubação de anticorpos de linhagem em gelo. Após 20 minutos, misture delicadamente cinco mililitros de tampão FACS, suplementado com DNase com as células e gire-as para baixo.

Lave o pellet em um segundo cinco mililitros de DNase. Em seguida, ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão FACS e DNase, reservando uma alíquota de 50 microlitros de células para o controle do corante de viabilidade. Por fim, adicione corante de viabilidade à amostra restante e classifique as células de acordo com o diagrama.

O uso de uma abordagem de depleção negativa de linhagem em vez de uma abordagem de seleção positiva evita a pré-seleção para subpopulações específicas. A análise de microarray de transcriptoma pull revela que os fibroblastos cultivados isolados pelas metodologias de colheita viva e explante tecidual têm um alto grau de similaridade em um nível amplo de transcriptoma com um coeficiente de correlação produto-momento de Pearson de 0,92. Em comparação, os fibroblastos cultivados diferiram significativamente de um fibroblasto não cultivado colhido vivo, estabelecendo a importância de analisar fibroblastos colhidos vivos em vez de fibroblastos cultivados.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do desenvolvimento e cicatrização de feridas confirmarem a heterogeneidade dos fibroblastos e identificarem subpopulações responsáveis por cicatrizes e outras formas de fibroses.