Name: Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T10:00:01.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Aprenda a isolar fibroblastos dérmicos de murinos por FACS sem cultura in vitro, preservando o fenótipo nativo. Este método avança o estudo da biologia do desenvolvimento e cicatrização de feridas.

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Este trabalho foi apoiado em parte por uma concessão do NIH subvenção R01 GM087609 (para HPL), um presente de Ingrid Lai e Bill Shu em honra de Anthony Shu (para HPL), NIH concessão U01 HL099776 (para MTL), o Laboratório Hagey para Pediatric Regenerative Medicine e The Oak Foundation (para MTL, GCG e HPL). GGW foi apoiado pela Escola de Medicina de Stanford, o Programa de Formação de Stanford Medical Scientist, e bolsa de formação NIGMS GM07365. Znm foi apoiado pela Fundação de Pesquisa de Cirurgia Plástica Fellowship Grant eo Fundo Família Hagey. MSH foi apoiado pelo Instituto Califórnia de Medicina Regenerativa (CIRM) Fellow Clínica formação TG2-01159 concessão, a Sociedade Americana de Cirurgiões Maxilo (ASMS) / Cirurgiões Buco Maxilo Facial Foundation (MSF) Research Award Grant, e de Transplante e Engenharia de Tecidos Prémio Fellowship.

Este protocolo segue métodos aprovados pelo Painel Administrativo da Universidade de Stanford em Laboratory Animal Care. 1. Digestão de murinos Derme <ol><li> Eutanásia ratinhos por deslocamento cervical depois de anestesia com uma injecção intraperitoneal de cetamina 100 mg / kg + xilazina 20 mg / kg de acepromazina + 3 mg / kg. Nota: Várias idades e origens podem ser usados. </li><li> Raspar e depilar a pele dorsal. Aproximadamente 100.000 células podem ser isoladas a partir de um pedaço de pele dorsal 60 mm x 100 mm. </li><li> Mergulhe o mouse em etanol 70% e coloque em uma superfície limpa e estéril para secar. </li><li> Colher imediatamente a pele do rato dorsal usando tesouras de dissecção estéreis. Em camundongos fêmeas, evitar incluindo o tecido mamário. </li><li> A partir da base da cauda, ​​utilize uma pinça para tenda a pele e fazer um corte transversal antes de dissecar ao longo do plano supra-fascial. </li><li> Evitar cuidadosamente incluindo qualquer gordura subcutânea durante a colheitaa pele. Examine a pele colhidas para qualquer gordura subcutânea e cuidadosamente raspá-lo usando a ponta chanfrada de um bisturi. </li><li> Lavar a pele colhidas em betadine seguido de 5x lavagens PBS em gelo. Nota: É importante manter a pele tão perto quanto possível estéril para evitar contaminação. </li><li> Picar a pele usando lâminas de barbear e tesouras de dissecação em um prato estéril até que a amostra é de uma consistência uniforme com 2-3 mm peças. </li><li> Preparar tubos de 50 mL cónico contendo 20 ml de colagenase IV a uma concentração de 1 mg / ml em DMEM. Dividir a derme para os tubos na base de cinco ratinhos por tubo. </li><li> Agitar vigorosamente enquanto incubando amostras a 37 ° C durante 1 hora em banho-maria ou uma ou forno. </li><li> Retirar amostras da incubadora e passar através de uma seringa de 10 ml, sem uma agulha 3-5x num hote estéril. </li><li> Coloque as amostras de volta na incubadora a 37 ° C e agitar vigorosamente durante mais 30 min. </li><li> Em um capuz estéril, Pipetar as amostras cima e para baixo 3-5x com uma pipeta 10 ml. Pipetar a amostra através de um filtro de 100 um para um novo tubo de 50 ml. </li><li> Passa 20 ml de meio DMEM FBS a 10% através do mesmo filtro de maximizar o rendimento celular e levar o volume total a 40 ml. Centrifugar a 300 g durante 8 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante com uma pipeta de vidro estéril, tomando muito cuidado para primeiro remover a camada superior de gordura antes da restante sobrenadante. Nota: Esta etapa é fundamental para reduzir a contaminação dos adipócitos. </li><li> Ressuspender as pelotas em 20 ml de DMEM FBS a 10%. </li><li> Passar a suspensão de célula / meio DMEM por meio de um filtro de 70 um. </li><li> Lavar o filtro com 10 ml de DMEM FBS a 10% e centrifuga-se a suspensão foi filtrada a 300 g durante 8 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante utilizando uma pipeta de vidro estéril, mais uma vez tendo o cuidado de remover qualquer primeira camada de gordura restante. </li><li> Se há contaminação significativa de RBC (o sedimento é visivelmente vermelho), re-suspender as pelotasem 20 ml de tampão de lise ACK e incubar durante 5 min à TA. Caso contrário, pule para a etapa 24. </li><li> Adicionar um volume igual (20 ml) de tampão de FACS (PBS, 10% de FBS, 0,1% de azida de sódio), em seguida, misturar, e de lado manter uma alíquota de 5 ml, como um controlo não corado. Centrifuga-se o restante amostra a 300 g durante 8 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e colocar pellet no gelo. As células podem ser congeladas para baixo neste ponto, se o tempo de FACS não está disponível. </li></ol> 2. Isolamento de fibroblastos por FACS <ol><li> Faça 500 mL de mistura de incubação de anticorpos para cada linhagem pellet. Para fazer isso, em primeiro lugar a adição de 475 ul de tampão FACS contendo ADNase (10 ug / ml) para um tubo, e em seguida, adicionando-fluororo conjugado CD31 (1: 100), CD45 (1: 200), Tie2 (1:50), Ter -119 (1: 200), e EpCAM (1: 100) de anticorpos para alcançar a respectiva diluição para cada anticorpo. </li><li> Re-suspender cada sedimento em 500 ul de mistura de incubação de anticorpo e linhagem esta suspensão incubar em gelo durante 20 min. </li><li> Adicionar 5ml de FACS tampão contendo DNase (10 ug / ml) à amostra e misturar suavemente. Centrifugar a 300 g durante 8 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e lavar o sedimento de células com tampão de SCAF contendo 5 ml de ADNase (10 ug / ml) e centrifuga-se utilizando as mesmas condições que no passo 26. </li><li> Ressuspender o sedimento em tampão FACS contendo 500 ul de ADNase (10 ug / ml) e posto de lado de uma alíquota de 50 ul de controlo como um corante de viabilidade. </li><li> Adicionar corante de viabilidade de escolha para a amostra que permanece na concentração indicada para o corante escolhido. </li><li> Realizar análise FACS 31 e triagem para a viabilidade Dye- / CD31- / CD45- / Tie2- / Ter-119- células / EpCAM- (ver Figura 2A). Ordenar directamente em tampão de SCAF. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo descrito neste manuscrito oferece um meio para isolar fibroblastos pela triagem baseada em FACS, em comparação com os métodos existentes, o que quer para seleccionar uma subpopulação ou necessitam de tempo em cultura de células antes de análises subsequentes. O tempo necessário desde a colheita da pele para a triagem de fibroblastos é de cerca de 6 horas; No entanto, o número de ratos utilizados na colheita vai influenciar esta estimativa. Vários pontos do protocolo requer um cui...

Os fibroblastos são frequentemente definidas morfologicamente como células fusiformes que aderem aos substratos de plástico. Os fibroblastos são o tipo de célula princípio responsável pela síntese e remodelação da matriz extracelular em embrionárias e adultas órgãos 1. Os fibroblastos são, portanto, essencial para o desenvolvimento dos mamíferos e contribuir substancialmente para o meio extracelular, que influencia o comportamento do vizinho tipos de células presentes em cada tecido e órgão. Os fibroblastos são também o tipo de célula principal por trás de um conjunto diversificado de condições médicas que causam enorme fardo clínico. Actividade patológica de fibroblastos prejudica a função do tecido normal e inclui tecido e fibrose dos órgãos (tais como fígado e pulmão), a cicatrização a seguir a cicatrização cutânea da ferida, aterosclerose, esclerose sistémica, e a formação de placas de ateroma após a lesão do vaso sanguíneo 2-5. Cicatrização de feridas em particular, tanto de forma aguda e crônica, envolve deposition de tecido cicatricial que nem se assemelha nem funções como o tecido normal circundante ele, e leva a morbidade significativa em diversos estados patológicos. Após lesão, existe uma transição de fibroblastos para miofibroblastos, em seguida, que segregam os componentes da ECM estruturais, exercem efeitos parácrinos em tipos de células vizinhas, e restabelecer a estabilidade mecânica através do depósito de tecido cicatricial 6. Em tecidos cutâneos existe variação significativa na qualidade de reparação de feridas através do tempo de desenvolvimento e entre os locais anatômicos. Nos dois primeiros trimestres de vida do feto cura sem cicatrizes; No entanto, a partir do terceiro trimestre e em toda a vida adulta, cura dos humanos com uma cicatriz. , Para além específica para a idade, cicatrização de feridas em diferenças existem específica do local. Feridas na cavidade oral remodelar com formação de cicatriz mínima 7,8, enquanto a deposição de tecido cicatricial dentro de feridas cutâneas é significativa 9. A controvérsia persiste concerning a influência relativa do ambiente contra as propriedades intrínsecas dos fibroblastos locais sobre os resultados da cicatrização de feridas em relação à idade e localização 10,11. Dadas as diferenças significativas na cicatrização de rato oral versus derme cutâneas e embrionário antes (E15) vs. depois embrionário (E18) derme, é provável que existem diferenças intrínsecas nas populações de fibroblastos em determinadas idades e de desenvolvimento entre os vários locais anatômicos . Em 1986, Harold F. Dvorak postulou tumores são feridas que não cicatrizam 12. Dvorak concluir-se que os tumores se comportam como feridas no corpo e induzir a sua estroma através da activação da ferida resposta do hospedeiro de cura. Numerosos estudos têm investigado uma vez que a contribuição de fibroblastos para a progressão de carcinomas 13-15, mas, como no caso da cicatrização de feridas, a identidade e origem embrionária dos fibroblastos que contribuem para o compartimento estromal da CA cutânearcinomas não foi adequadamente definido. A resposta a esta questão não tem relevância médica dada estudos recentes expondo a fibroblastos associado ao tumor como um alvo potencialmente eficaz para a terapia anti-câncer 16. Identificar e prospectivamente isolar linhagens de fibroblastos dotados de potencial fibrogenic in vivo é um passo essencial para efetivamente manipular sua resposta à lesão através de uma ampla gama de estados agudos e crônicos. Em 1987, Cormack demonstrou duas subpopulações de fibroblastos, uma residindo dentro de uma e a papilar na derme reticular 17,18. Uma terceira subpopulação foi encontrado associado com folículos pilosos na região papila dérmica do folículo 19,20. Quando cultivadas, essas diferenças subtipos de fibroblastos apresentam em potencial de crescimento, morfologia e crescimento / fator de citocinas perfis 21-24. Até o momento, estudos examinando fibroblastos eleterogeneity pela maior parte não caracterizar adequadamente a diversidade de desenvolvimento e funcional entre fibroblastos in vivo. Isto é, em parte, é um resultado de uma dependência de populações fibroblastos cultivadas e o efeito de homogeneização de cultura de células ou selecção positiva sobre a base de um receptor da superfície da auto não expresso por todos os fibroblastos 25. Um estudo recente de nosso laboratório demonstraram um marcador de superfície profunda e mudança de transcrição em fibroblastos incultos cultivadas vs. isoladas pela metodologia de isolamento à base de FACS apresentada neste manuscrito 26. Subsequentemente, foi identificada uma linhagem de fibroblastos específica no interior da derme dorsal de murino e determinaram que esta linhagem, definida pela expressão embrionária de Engrailed-1, é o principal responsável pela deposição de tecido conjuntivo na pele dorsal. As funções de linhagem durante ambas as formas aguda e crônica da fibrose incluindo a cicatrização de feridas, formação de estroma câncer, eradiação induzida fibrose 27. A caracterização de linhagens de fibroblastos distintas tem implicações críticas para terapias destinadas a modulação do comportamento fibrogenic. Ao invés de usar protocolos existentes que se baseiam em manipulação in vitro, para obter o isolamento de células 28,29, o protocolo de colheita (Figura 1) descrito aqui vai ajudar análises informativos rendimento de fibroblastos que capturam mais precisamente fenótipo e o comportamento in vivo.

<table><tbody><tr><td>Fórceps cirúrgico</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650916</td><td></td></tr><tr><td>Micro-tesoura</td><td>Kent Scientific</td><td>INS600127</td><td></td></tr><tr><td>Solução de preparação de iodopovidona</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Nair (creme depilatório)</td> <td>Church and Dwight Co.</td><td></td><td></td>22600267058</tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Elastase</td><td>Abcam</td><td>ab95133</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK)</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m filtros</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m filtros</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; Filtros</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BioLegend</td><td>102421</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>103125</td><td></td></tr><tr><td>Tie2</td><td>BioLegend</td><td>124005</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119</td><td>BioLegend</td><td>116233</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (CD326)</td><td>eBioscience</td><td>48-5791</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>iodeto de propídio (coloração de viabilidade PI)</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de fibroblastos de murino dérmica por facs

 Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Os fibroblastos são o tipo de célula princípio responsável pela secreção de matriz extracelular e são um componente essencial de muitos órgãos e tecidos. Fibroblastos fisiologia e patologia subjacente um espectro de entidades clínicas, incluindo fibroses em múltiplos órgãos, cicatrizes hipertróficas seguintes queimaduras, perda da função cardíaca após isquemia, e a formação de estroma cancro. No entanto, os fibroblastos continuam a ser um tipo de célula mal caracterizada, em grande parte devido à sua heterogeneidade inerente. Métodos para o isolamento de fibroblastos existentes requerem tempo em cultura de células que influencia profundamente o comportamento das células e fenótipo. Consequentemente, muitos estudos que investigam a biologia de fibroblastos confiar manipulação in vitro e não capturar com precisão o comportamento de fibroblastos in vivo. Para superar este problema, desenvolveu-se um protocolo baseado em FACS para o isolamento de fibroblastos a partir de pele dorsal de ratinhos adultos que não necessita de cultura de células, assim preserving a transcrição fisiológico e proteômica perfil de cada célula. Nossa estratégia permite a exclusão de linhagens não-mesenquimais através de um portão negativo linhagem (Lin -) em vez de uma estratégia de seleção positiva para evitar a pré-selecção ou enriquecimento de uma subpopulação de fibroblastos expressando marcadores de superfície específicos e ser o mais abrangente possível através deste heterogêneo tipo de célula.

A validade desta abordagem (Figura 1) foi verificada em um número de maneiras, que podem ser examinados em pormenor na nossa publicação recente 27. Estes incluem imunocitoquímica de células classificadas e célula de massa e análise de transcrição única célula de células recém-ordenados. Classificando fibroblastos diretamente, em vez de depender de cultura com mais precisão capta a sua in vivo fenótipo. Usando uma abordagem de linhagem negativa depleção (Figura 2A), em vez de uma abordage...

O comportamento dos fibroblastos está subjacente a um espectro de entidades clínicas, mas permanecem mal caracterizados, em grande parte devido à sua heterogeneidade inerente. A pesquisa tradicional de fibroblastos depende da manipulação in vitro, mascarando o comportamento dos fibroblastos in vivo. Descrevemos um protocolo baseado em FACS para o isolamento de fibroblastos de pele de camundongo que não requer cultura de células.

Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar fibroblastos utilizando FACS, evitando assim o cultivo in vitro, o qual já foi demonstrado causar uma alteração fenotípica nessas células. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia do desenvolvimento e na cicatrização de feridas, como identificar os subtipos de fibroblastos envolvidos na formação de cicatrizes e na fibrose. A principal vantagem desta técnica é que experimentos in vitro são evitados, já que a aderência ao plástico altera o fenótipo do fibroblasto.Este método não só pode fornecer informações sobre fibroblastos dérmicos, mas também pode ser aplicado a outros sistemas, como fibroblastos peritoneais e aderências abdominais. Comece fazendo a depilação e a remoção dos pelos da pele dorsal do camundongo de interesse. Em seguida, submerja o camundongo despelado em etanol 70% e coloque o animal sobre uma superfície limpa e estéril para secar.Em seguida, começando na base da cauda, use uma pinça para levantar a pele e faça um corte transversal com tesoura de dissecação. Depois, dissecar ao longo do plano suprafascial para colher o tecido dorsal. Quando um pedaço de pele de 60 por 100 milímetros tiver si

murine-dermal-fibroblast-isolation-by-facs

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Os fibroblastos de câncer associados (FAC) facilitar tumor iniciação, crescimento e progressão através de sinalização que promove a proliferação, angiogênese e inflamação. Descrevemos aqui um método para isolar populações puras de fibroblastos normais e cafés de rato fresca e tecidos humanos por selecção de células, utilizando PDGFRα como um marcador de superfície.

Isolamento de fibroblastos normais e associados ao câncer de tecidos frescos, classificando células activadas por fluorescência (FACS)

Este vídeo descreve o método rápido para isolar e cultivar os melanócitos e fibroblastos simultaneamente da pele do filhote de camundongo pós-natal. Essas células podem ser mantidas e manipuladas in vitro para estudar a biologia celular da pele, cicatrização de feridas e melanoma.

Cultura Rápida de Melanócitos Murinos Primários e Fibroblastos: Isolamento de Melanócitos e Fibroblastos de Amostra de Pele Murina Inteira

Um modelo ideal para estudar a biologia de células-tronco adultas é o folículo piloso de camundongo. Aqui apresentamos um protocolo para isolar diferentes populações de folículos pilosos, células-tronco e queratinócitos epidérmicos, empregando digestão enzimática da pele dorsal de camundongos seguida de análise FACS.

Isolando células-tronco do folículo piloso e epidérmico queratinócitos da Dorsal rato Pele

Este manuscrito descreve um protocolo FACS-baseado para a isolação de fibroblasto Papillary e reticular da pele humana. Contorna a cultura in vitro que era inevitável com o protocolo comumente usado da isolação através das culturas do explante. Os subconjuntos emanando do fibroblasto são funcionalmente distintos e indicam a expressão e a localização diferenciais do gene dentro da derma.

Isolamento de fibroblastos papilares e reticular da pele humana por triagem celular ativada por fluorescência

Este protocolo esboça um método rápido para gerar simultaneamente culturas do melanócito e do fibroblasto da pele de 0-4 ratos velhos do dia. Estas culturas primárias podem ser mantidas e manipuladas in vitro para estudar uma variedade de processos fisiologicamente relevantes, incluindo biologia celular da pele, pigmentação, cicatrização de feridas e melanoma.

Geração rápida de culturas de melanócitos e fibroblastos de Murina primária

Nós apresentamos um protocolo para isolar fibroblastos adultos preliminares em uma maneira fácil, rápida e de confiança, performable por novatos (por exemplo, estudantes). O procedimento combina a digestão enzimática do tecido e a agitação mecânica com ondas ultra-sônicas para obter fibroblastos primários. O protocolo pode facilmente ser adaptado às exigências experimentais específicas (por exemplo, tecido humano).

Isolação adulta preliminar ultra-som-aumentada do fibroblasto

A reprogramação celular requer a introdução de genes-chave, que regulam e mantêm o estado celular pluripotente. O protocolo descrito permite a formação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) colônias de fibroblastos dérmicos humanos sem métodos virais/integradores, mas usando RNAs não modificados (NM-RNAs) combinados com fatores de evasão imunológica reduzindo os mecanismos de defesa celular.

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

A obtenção de uma população pura de fibroblastos é crucial para estudar seu papel na reparação de feridas e fibrose. Descrito aqui é um método detalhado para isolar fibroblastos e miofibroblastos de corações de camundongos ilesos e feridos seguido susceptência de sua pureza e funcionalidade por imunofluorescência, RTPCR, triagem celular assistida por fluorescência, e contração de gel de colágeno.

Isolamento e Caracterização de Fibroblastos Cardíacos Adultos e Miofibroblastos

Este artigo descreve um método baseado em cultura explant para o isolamento e cultivo de células musculares humanas aórticas humanas primárias e específicas do paciente e fibroblastos dérmicos. Além disso, é apresentado um novo método para medir a contração celular e a análise subsequente, que pode ser usado para estudar diferenças específicas do paciente nessas células.

Isolamento de células musculares lisas aórticas específicas do paciente primário e medidas de contração em tempo real semiquantitativas in vitro

Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

Este protocolo descreve um método otimizado para dissociar glândulas lacrimais de camundongos envelhecidos para obter células individuais viáveis para sequenciamento de RNA unicelular. Digestão enzimática sequencial e manuseio suave preservam a integridade celular, resultando em suspensões de alta qualidade adequadas para isolamento específico por tipo celular e análise transcriptômica de alterações associadas ao envelhecimento nas populações de glândulas lacrimais.

Protocolo para Dissociação de Célula Única, Sequenciamento de RNA e Isolamento de Células Mioepiteliais e Fibroblastos das Glândulas Lagrimais e Salivares Envelhecidas

Aprenda a isolar fibroblastos dérmicos de murinos por FACS sem cultura in vitro, preservando o fenótipo nativo. Este método avança o estudo da biologia do desenvolvimento e cicatrização de feridas.

Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS

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