Isolamento de exossomas a partir do plasma de indivíduos HIV-1 positivos

Durante a infecção pelo HIV, tanto os vírus quanto as microvesículas chamadas exossomos são produzidos por células infectadas por vírus. O objetivo geral deste procedimento é separar os exossomos das partículas virais em amostras de plasma de pacientes infectados pelo HIV. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos exossomos, como quais proteínas ou moléculas estão presentes nos exossomos produzidos durante a infecção pelo HIV.

Demonstrando o procedimento estará o Dr. Ming Bo Huang, instrutor do departamento de microbiologia, bioquímica e imunologia e membro do grupo de HIV / AIDS aqui na Moorehouse School of Medicine. Depois de coletar sangue humano e isolar o plasma de acordo com o protocolo de texto, adicione 10 mililitros de 1X PBS a 10 mililitros de plasma em um tubo de 15 mililitros. Centrifugue a amostra a 10.000 vezes G e quatro graus Celsius por 30 minutos para remover os detritos celulares.

Com uma pipeta serológica estéril, transferir o sobrenadante de plasma limpo para um tubo de ultracentrífuga limpo de 25 ml. Em seguida, centrifugue o plasma limpo a 200.000 vezes G e quatro graus Celsius por duas horas para separar as vesículas grandes. Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante e descarte os resíduos de risco biológico.

Usando um mililitro de PBS 1X, ressuspenda o pellet e incube em temperatura ambiente por 30 minutos, girando suavemente para desalojar e separar as partículas. Adicione 24 mililitros de PBS à solução do vírus do exossomo recém-ressuspensa em um tubo de ultracentrífuga de 25 mililitros e misture o tubo cinco vezes. Em seguida, gire novamente a 200.000 vezes G e quatro graus Celsius por duas horas antes de descartar a solução de lavagem PBS nos resíduos de risco biológico.

Para preparar gradientes de velocidade de seis a 18% de iodixanol, comece com uma solução estoque de 60% de reagente de iodixanol e use 1X PBS para diluí-lo para 6% e 18% Ligue o agitador e em um gradiente de câmara dupla, pipete 5,5 mililitros da solução a 18% na câmara agitada e 5,5 mililitros da solução a 6% na câmara do reservatório. Em seguida, abra a torneira, ligue a bomba e deixe cada solução fluir para um tubo de ultracentrífuga de 14 mililitros. Em seguida, coloque cuidadosamente um mililitro da solução do vírus do exossomo no topo de cada gradiente de 11 mililitros.

Em seguida, com um rotor de caçamba oscilante SW 40 Ti, centrifugue os gradientes a 250.000 vezes G e quatro graus Celsius por duas horas. Enquanto isso, rotule 12 tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Após a centrifugação, remova um mililitro do topo do gradiente e transfira para o tubo número um.

Em seguida, transfira as frações restantes de um mililitro para os tubos de dois a 12 em ordem sequencial. Faça o reagente do ensaio misturando 100 partes de 1X PBS, duas partes de substrato e cinco partes de indicador de cor. Em seguida, transfira 50 microlitros em duplicata de cada uma das 12 frações de gradiente de um mililitro para os poços de uma placa de microtitulação de 96 poços.

Prepare um conjunto de padrões fazendo primeiro uma solução estoque de ACHE de 2.000 miliunidades por mililitro em PBS. Em seguida, faça 11 diluições seriais duplas do estoque e adicione 50 microlitros de cada diluição, começando com 2.000 miliunidades por mililitro a um único poço de uma placa de microtitulação de 96 poços. Adicione 200 microlitros de mistura de reagentes de ensaio a cada poço de padrões e frações de gradiente e incube em um leitor de placas por 20 minutos para permitir o desenvolvimento da cor.

Finalmente, usando um leitor de microplacas de fluorescência, meça a atividade do ACHE em um comprimento de onda de 450 nanômetros. Realizar ensaios adicionais de acordo com o protocolo de texto. Como mostrado aqui, os exossomos isolados identificados pela atividade da ACHE segregaram em frações de densidade mais baixa de um a três no topo dos gradientes de iodixanol, enquanto as partículas virais identificadas pelo antígeno P24 do HIV segregaram nas frações de densidade mais alta de 10 a 12.

Esta tabela mostra a análise de exossomos e plasma não fracionado para 21 citocinas e quimiocinas usando um ensaio multiplex. Conforme indicado aqui, todas as 21 citocinas e quimiocinas foram detectadas em exossomos de indivíduos HIV-1 positivos e seus níveis foram significativamente elevados em comparação com o plasma e exossomos de controles negativos para HIV-1 zero um. Nesta figura, as células mononucleares do sangue periférico ou PBMCs de doadores não infectados foram expostas a exossomos agrupados de indivíduos HIV-1 positivos ou negativos.

Às 48 horas após a exposição, os níveis da marca de ativação, CD38, na superfície das células T CD4 positivas e CD8 positivas para memória virgens e centrais foram significativamente elevados se tivessem sido expostas a exossomos HIV-1 positivos em comparação com o tratamento HIV negativo. Durante o ensaio de acetilcolinesterase, é importante lembrar de proteger a placa da luz forte. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do HIV/AIDS explorarem o papel dos exossomos na infecção pelo HIV e na ativação imunológica.