Desacetilação Ensaios para desvendar a interação entre Sirtuins (SIRT2) e Proteína-substratos específicos

O objetivo geral deste protocolo é executar ensaios de desacetilação in vitro e in vivo para estabelecer o papel das proteínas como substratos específicos de desacetilação para as sirtuínas. Apesar do número crescente de proteínas encontradas acetiladas, defendendo uma presença generalizada de acetilação, enzimas específicas que regulam essas modificações ainda não foram identificadas para a maioria dessas proteínas. A principal vantagem desses ensaios é que, ao estabelecer uma proteína como um substrato legítimo de uma desacetilase específica, novos papéis e funções da desacetilase podem ser desvendados.

Embora este método possa fornecer informações sobre a identificação do substrato específico da sirtuína 2, ele também pode ser aplicado, com pequenas modificações, em outros membros da família das sirtuínas. Para iniciar este procedimento, prepare uma placa de cultura de 10 centímetros de células T HEK 293 em oito mililitros de DMEM, com 10% de FBS em antibióticos para que as células fiquem cerca de 70% confluentes após o crescimento durante a noite. No dia seguinte, cotransfectar as células com o seguinte: quatro microgramas de lentivector, expressando GFP e SIRT2 marcado com FLAG, quatro microgramas de vetor de embalagem e 0,5 microgramas de vetor de envelope.