Name: Síntese de termogelificantes poli (N-isopropilacrilamida) -graft-condroitina Composites Sulfato com alginato micropartículas para Engenharia de Tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Aprenda a avaliar propriedades adesivas e biocompatibilidade celular de hidrogéis termossensíveis com micropartículas de alginato para engenharia de tecidos do núcleo pulposo.

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Os autores gostariam de reconhecer com gratidão a ajuda do Dr. Jennifer Kadlowec no desenvolvimento do protocolo de ensaio de tração adesivo. Pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Artrite e doenças osteomusculares e de pele e do Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número 1R15 AR 063920-01. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Os autores não têm nada para revelar.

Há vários passos críticos em sintetizar o composto hidrogel-micropartículas e avaliar a sua força adesiva, inchaço capacidade e biocompatibilidade celular. polimerização de radical livre de PNIPAAm-g-CS requer metacrilaï¿½ï¿½o bem sucedida de sulfato de condroitina, a dissolução completa dos componentes de monómero, e das condições de reacção sem oxigénio. A razão de monómero para NIPAAm sulfato de condroitina metacrilado na mistura de reacção foi escolhida porque foi demonstrado, no nosso trabalho anterior, para gerar ...

Biomateriais injectáveis são aqueles que podem ser convenientemente entregues para o corpo como um líquido e solidificar in situ. Tais materiais têm sido extensivamente aplicado na medicina regenerativa, em que eles são utilizados para entregar células encapsuladas para o local afectado 1-4 e actuam como uma matriz extracelular temporária tridimensional para as células 5. Para o paciente, biomateriais injectáveis ​​são vantajosos porque os procedimentos cirúrgicos para implante são minimamente invasiva e a fase sólida pode preencher defeitos de forma irregular dos tecidos, eliminando a necessidade de implantes de tamanho personalizado. Injectabilidade pode ser conseguido através de uma variedade de mecanismos. Os factores externos, como pH, têm sido investigadas como um gatilho para a formação de geles que encapsulam as células e moléculas bioactivas 6-8. No entanto, o pH não pode ser o gatilho mais conveniente para utilizar em todos os ambientes fisiológicos. Outra alterna tradicionaltiva para atingir injectabilidade está usando polimerização in situ química ou reticulação. Um grupo desenvolvido um sistema redox solúvel em água composto por persulfato de amónio e N, N, N-tetrametiletilenodiamina, N &#39;, e é utilizado para a reacção de macrómeros compostas de polietileno glicol e poli (propileno) glicol 9,10. Zan et al. 11 redes quitosano injectáveis de álcool polivinílico reticulado com glutaraldeído desenvolvidos. Em tais sistemas, a citotoxicidade dos componentes reactivos deve ser considerada, especialmente para aplicações que envolvem o encapsulamento celular. Além disso, a polimerização exotérmica pode produzir temperaturas elevadas o suficiente para comprometer o tecido circundante, o que tem sido relatado para o osso polimérico cimentos 12,13. Ainda outros sistemas de polímeros injectáveis ​​têm sido desenvolvidos que exibem uma mudança do estado líquido para estado sólido com a temperatura como o gatilho. Conhecido como sistemas termogelificantes, estes são aqueonos soluções de polímero que não requerem estímulo químico, monómeros ou agentes de ligação cruzada para conseguir a formação in situ 14. Em vez disso, uma transição de fase que ocorre geralmente próxima da temperatura fisiológica induz a formação de uma rede tridimensional fisicamente reticulado. Poloxâmeros como Pluronic F127 estão entre os polímeros mais estudados para termogelificantes entrega da droga 15-17 e células encapsulamento 18,19. No entanto, é bem aceite que estes geles não possuem a estabilidade em condições fisiológicas. Estudos têm demonstrado o aumento da estabilidade usando extensores de cadeia ou agentes de reticulação químicos 20 21,22. No entanto, a utilização destes reagentes pode limitar o potencial dos materiais de encapsulamento de células. Poli (N-isopropilacrilamida) é um polímero sintético termogelificantes que tem recebido uma atenção significativa em engenharia de tecidos e entrega de droga 14. As soluções aquosas de poli (N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) exibem uma temperatura crítica inferior de solução (TCIS), tipicamente ocorrendo em torno de 32-34 ° C 23,24. Abaixo da TCIS, água hidrata cadeias de PNIPAAm. Acima da temperatura de transição, o polímero torna-se hidrofóbico, resultando numa separação de fases dramática 25-27 e formação de um gel sólido, sem o uso de monómeros ou agentes de reticulação tóxicos. No entanto, homopolímeros de PNIPAAm exibem pobres propriedades elásticas e mantenha pouco de água à temperatura fisiológica devido à hidrofobicidade 28. Neste trabalho, nós optar por incorporar sulfato de condroitina covalente na rede PNIPAAm, que oferece o potencial para degradabilidade enzimática 29, a actividade anti-inflamatória 30,31, e aumento da água e absorção de nutrientes 32. copolímeros de PNIPAAm com CS foram preparados no nosso laboratório por polimerização do monómero NIPAAm na presença de CS-metacrilato funcionalizado para formar copolímero enxertado (PNIPAAm-g-CS). BecAUtilize de baixa densidade de reticulação do copolímero, PNIPAAm-g-CS forma uma solução viscosa em água à TA, e um gel elástico à temperatura fisiológica devido à TCIS 29. As soluções de polímero se tornar fluido novamente após o arrefecimento abaixo da TCIS, devido à reversibilidade da transição. Nós demonstramos que PNIPAAm-g-CS tem o potencial para funcionar como uma estrutura de engenharia de tecidos, devido às propriedades mecânicas que podem ser adaptados, degradabilidade e citocompatibilidade com rim embrionário humano (HEK) 293 células 29. No entanto, em determinadas áreas de suporte de carga, tais como o disco intervertebral, andaimes de engenharia de tecidos devem possuir a capacidade de formar uma interface substancial com o tecido envolvente do disco para eliminar o risco de deslocamento 33. Esta interface é também necessário para uma adequada transmissão de força em toda a interface entre o implante e o tecido 33. Em nosso trabalho, temos que suspendeu amicropartículas lginate em soluções aquosas de PNIPAAm-g-CS e descobriram que a gelificação localiza as micropartículas, que proporcionam a adesão com o tecido circundante 34. Neste artigo, vamos delinear os passos para a preparação do termogelificantes, polímero adesivo. As técnicas convencionais para a caracterização de biomateriais, imagens de células, e os ensaios de viabilidade foram adaptados para ter em conta a sensibilidade à temperatura do polímero e a reversibilidade da transição de fase. O polímero injetável descrito neste trabalho tem grande potencial para aplicações de entrega de medicamentos e engenharia de tecidos fora dos descritos neste documento. Além disso, os métodos de caracterização descritos aqui podem ser aplicados a outros sistemas termogelificantes.

<table><tbody><tr><td>N-isopropilacrilamida, 99%, puro, estabilizado</td><td>Acros Organics</td><td>2210-25-5</td><td>Refrigere e remova o estabilizador com hexano</td></tr><tr><td>Sulfato de condroitina Um sal de sódio (da traqueia bovina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39455-18-0</td><td>Refrigere</td></tr><tr><td>Hexanos</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td>Armazene em um armário inflamável</td></tr><tr><td>50% (p/p) de hidróxido de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS254-1</td><td>Natureza cáustica</td></tr><tr><td>Anidrido metacrílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685</td><td>Vapores fortes; use em um exaustor</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td>Resfrie em uma geladeira antes de usar</td></tr><tr><td>Gás Nitrogênio</td><td>Praxair</td><td>7727-37-9 Número da</td><td>peça: NI 4.8, estilo de cilindro T, 99,998% de nitrogênio puro (o argônio pode ser usado como um gás inerte alternativo)</td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina, 99% extra puro</td><td>Acros Organics</td><td>110-18-9</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>Higroscópico e degrada na presença de água Comprimidos</td></tr><tr><td>salinos tamponados com fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944</td><td>Mantenha seco</td></tr><tr><td>Ácido algínico, sal de sódio</td><td>Acros Organics</td><td>177775000</td><td>Use calor para auxiliar na dissolução</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Óleo</td> de <td>canola Loja</td><td></td> local <td>Obtenha de uma loja local</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93773</td><td></td></tr><tr><td>70% (v/v) Isopropoanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>Orelhas de porco</td><td>Haine's Pork Shop</td><td></td><td>Obtenha de um açougueiro local</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Rim embrionário humano 293 células</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-1573</td><td>Armazene em nitrogênio líquido para uso a longo prazo</td></tr><tr><td>DMEM: 1x, glicose alta, sem piruvato</td><td>Life Technologies</td><td>11965126</td><td>Refrigerar</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td>Refrigerar</td></tr><tr><td>Penn Strep: 10,000 U/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Refrigerar</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA: 0,5%, 10x</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td>Refrigerar</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>AAA44571-K7</td><td></td></tr><tr><td>Kit de viabilidade de células vivas/mortas</td><td>Life Technologies</td><td>L3224</td><td>Sensível à luz, mantenha congelado</td></tr><tr><td>Kit de viabilidade de células XTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TOX2-1KT</td><td>Sensível à luz, mantenha congelado</td></tr><tr><td>Limpar DMEM: 1x, glicose alta, sem fenol</td><td>Life Technologies</td><td>21063-029</td><td>Refrigerar</td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS: 1x</td><td>Life Technologies</td><td>14190136</td><td>Refrigerar</td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>EMD</td><td>SX0445-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de deslocamento positivo</td><td>BrandTech Scientific, INC</td><td>2702904</td><td>Dispensa 100 - 500 &micro; l e vem com pontas acopláveis</td></tr><tr><td>nº 3. Cabo de bisturi de aço inoxidável</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2896</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas cirúrgicas estéreis Miltex</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-440</td><td>Tamanho 10</td></tr><tr><td>Homogeneizador de gemas de potência</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-451-660</td><td>Modelo # 125</td></tr><tr><td>Almofariz e pilão de porcelana</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z247464</td><td>Capacidade para 50 ml</td></tr><tr><td>FreeZone 1 L sistema de liofilização de bancada</td><td>Labconco</td><td>7740020</td><td>Congele as amostras antes de usar</td></tr><tr><td>Bomba de palhetas rotativas selada</td><td>a óleo Edwards</td><td>A65301906</td><td>Modelo # RV5</td></tr><tr><td>Agitador orbital de incubação</td><td>VWR</td><td>12620-946</td><td>Modelo # 980153</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de bancada</td><td>Forma Scientific, INC</td><td></td><td>Modelo # 5682</td></tr><tr><td>Fornos aquecidos</td><td>VWR</td><td></td><td>Modelo # 1235PC</td></tr><tr><td>2 N medidor de força</td><td>Shimpo</td><td>FGV-0.5XY</td><td>Modelo # FGV-0.5XY</td></tr><tr><td>E-force test stand</td><td>Shimpo</td><td>FGS-200PV</td><td>Modelo # FGS-200PV</td></tr><tr><td>Centrífuga de balde oscilante para cultura de tecidos</td><td>Beckman Coulter</td><td>366830</td><td>Modelo #6S-6KR</td></tr><tr><td>Microcentrífuga para cultura de tecidos</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Modelo #5415C</td></tr><tr><td>Conjunto de hemacitômetros</td><td>Hausser Scientific</td><td>3720</td><td>Requer vidro de cobertura de substituição desliza</td></tr><tr><td>Aquecedor de slides</td><td>Lab Scientific</td><td>XH-2022</td><td>Modelo # XH-2002</td></tr><tr><td>Lâmpada de aquecimento portátil</td><td>Underwriters Laboratories</td><td></td><td>Ajuda a manter a temperatura do polímero em 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente invertido</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Modelo Axiovert 25 CFL</td></tr><tr><td>Banho-maria aquecido</td><td>VWR</td><td></td><td>Modelo # 1235PC</td></tr><tr><td>Plataforma de balanço</td><td>Série VWR</td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>Leitor de placas de microtitulação Multiskan FC</td> Incubadora de cultura de células <td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Tipo 357</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td></td><td>Modelo # 2350T</td></tr><tr><td>Purificador gabinete de biossegurança classe II</td><td>Labconco</td><td></td><td>Delta Series</td></tr></tbody></table>

síntese de termogelificantes poli (n-isopropilacrilamida) -graft-condroitina composites sulfato com alginato micropartículas para engenharia de tecidos

Synthesis of Thermogelling Poly(N-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering

Biomateriais injectáveis são definidos como materiais implantáveis que podem ser introduzidos no corpo como um líquido e solidificar in situ. Tais materiais oferecem as vantagens clínicas de serem implantados minimamente invasiva e facilmente formando sólidos de preenchimento de espaço em defeitos de forma irregular. biomateriais injetáveis ​​têm sido amplamente investigados como suportes para engenharia de tecidos. No entanto, para a reparação de determinadas zonas de suporte de carga no corpo, tais como o disco intervertebral, andaimes devem possuir propriedades adesivas. Isto vai minimizar o risco de deslocamento durante o movimento e assegurar o contacto íntimo com o tecido circundante, fornecendo a transmissão adequada das forças. Aqui, descrevemos a preparação e caracterização de um andaime composto por termicamente sensíveis poli (N-isopropilacrilamida) sulfato de condroitina -graft-(PNIPAAm-g-CS) e micropartículas de alginato. O copolímero de PNIPAAm-g-CS forma uma solução viscosa em água à TA, em que alginate as partículas são suspensas para aumentar a adesão. Acima da temperatura crítica inferior de solução (TCIS), cerca de 30 ° C, o copolímero forma um gel sólido em volta das micropartículas. Temos adaptado biomateriais procedimentos normalizados de caracterização para tomar em consideração a transição de fase reversível de PNIPAAm-g-CS. Os resultados indicam que a incorporação de 50 ou 75 mg / ml de partículas de alginato em 5% (w / v) de soluções PNIPAAm-g-CS quadruplicar a resistência à tracção adesiva de PNIPAAm-GCS sozinhos (p &lt;0,05). A incorporação de micropartículas de alginato também aumenta significativamente a capacidade de inchamento de PNIPAAm-g-CS (p &lt;0,05), ajudando a manter um gel de enchimento dentro do espaço de defeitos de tecidos. Finalmente, os resultados do ensaio in vitro kit de toxicologia, 2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -2H-tetrazólio-5-carboxanilida (XTT) e ensaio de viabilidade vivo / morto indicam que o adesivo é capaz de suportar a sobrevivência e proliferação de encapsulado de rim embrionário humano (HEK) 293 Cells mais de 5 dias.

Um co-polímero enxertado de resposta térmica foi sintetizado com sucesso e caracterizado pela sua força bioadesiva, propriedades de intumescimento, e em citocompatibilidade vitro. Nós escolhemos para investigar alginato devido às suas propriedades mucoadesivas bem estabelecidos. As micropartículas de alginato, com um diâmetro médio de 59,7 ± 14,9 uM, foram misturados com 5% (w / v) PNIPAAm-g-CS, em concentrações de 25, 50, e 75 mg / ml. Estas concentrações foram baseado...

Um andaime engenharia de tecidos injectáveis ​​compostas de poli (N-isopropilacrilamida), sulfato de condroitina--graft (PNIPAAm-g-CS) molecular contendo micropartículas de alginato foi preparada. A força de aderência, propriedades e inchaço na biocompatibilidade in vitro são analisadas neste estudo. As técnicas de caracterização desenvolvidos aqui podem ser aplicados a outros sistemas termogelificantes.

Síntese de termogelificantes poli (N-isopropilacrilamida) -graft-condroitina Composites Sulfato com alginato micropartículas para Engenharia de Tecidos

Injectable biomaterials are defined as implantable materials that can be introduced into the body as a liquid and solidify in situ. Such materials offer ...

O objetivo geral desta metodologia é avaliar tanto as propriedades adesivas quanto a biocompatibilidade celular do compósito de hidrogel proposto para engenharia de tecidos do disco intervertebral do núcleo pulposo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de engenharia de tecidos, como por exemplo como projetar e preparar hidrogéis termorreversíveis com propriedades bioadesivas para encapsulamento celular. A principal vantagem desta técnica é que somos capazes de demonstrar estudos in vitro com um compósito injetável e termossensível para avaliar seu uso como possível substituto do núcleo pulposo.No presente estudo, avaliamos um novo suporte de hidrogel realizando testes mecânicos de tração e ensaios de viabilidade celular. Os ensaios de biocompatibilidade serão demonstrados por Emily Schmidt, Mark Dittmer, Edward Goldschmidt e Frantzeska Giginis, alunos dos departamentos de Ciências Biológicas e Bioquímica. Antes da síntese do hidrogel bioadesivo, purifique o monômero NIPAAm e o mCS, conforme descrito no protocolo textual.Em seguida, co-dissolva 10 gramas de NIPAAm purificado e 2,209 gramas de mCS em 232 mililitros de água desionizada. Remova o oxigênio da solução utilizando gás nitrogênio inerte. Mantenha um fluxo de gás vigoroso, porém baixo, para evitar transbordamento da solução por 15 minutos.Continue purgando a solução com gás nitrogênio e adicione 0,976 mililitros de TEMED. Em seguida, inicie a reação de polimerização misturando 97,6 miligramas de persulfato de amônio. Misture a solução por aproximadamente 20 segundos e, rapidamente, feche o recipiente para evitar a entrada de ar.Deixe a solução polimerizar sob luz fluorescente por 24 horas antes de processar a amostra em um pó fino, conforme descrito no protocolo textual. Prepare uma mistura de óleo e água combinando 100 mililitros de óleo de canola, um mililitro de TWEEN 20 e 20 mililitros de alginato a 2%. Emulsifique a mistura por 10 minutos com um homogeneizador a 15.000 RPM.Além disso, misture com um agitador magnético a 200 RPM para criar micropartículas grandes ou a 2.000 RPM para criar micropartículas pequenas. Aspire a solução de cloreto de cálcio a 2% usando uma seringa com ponteira de agulha de 18 gauge. Adicione lentamente o cloreto de cálcio gota a gota à emulsão.Após permitir que as micropartículas sofram reticulação por 10 minutos, distribua uniformemente o lote de micropartículas em tubos cónicos de 50 mililitros com tampa. Centrifugue a 1.400 ×g por dois minutos para remover a camada inicial de óleo de canola antes de lavar e liofilizar as micropartículas conforme descrito no protocolo textual. Utilize o pó polimérico liofilizado resultante para preparar uma solução de PNIPPAm enxertado em CS a 5% peso/volume, dissolvendo primeiro 50 miligramas de pó de hidrogel em um mililitro de solução salina tamponada com fosfato 1X, ou PBS.Agite a solução utilizando um vórtex antes de resfriá-la em geladeira a quatro graus Celsius por 24 horas. Após a formação da solução viscosa, prepare um compósito homogêneo adicionando 25 ou 50 miligramas de micropartículas de alginato liofilizadas à solução de hidrogel e agitando em vórtex. Armazene o compósito em geladeira a quatro graus Celsius para uso posterior.Antes de realizar os testes de tração, extraia o substrato de cartilagem de uma orelha de porco, conforme detalhado no protocolo textual. Em seguida, fixe o medidor de força ao braço do suporte de teste. Coloque uma placa aquecedora sobre o suporte de força e ajuste a temperatura para 50 graus Celsius.Em seguida, fixe um pedaço de cartilagem de um centímetro por um centímetro ao bloco de aço inoxidável com cola de cianoacrilato e um par de pinças. Cole um pedaço adicional de cartilagem ao cilindro de Delrin e prenda o cilindro ao medidor de força. É muito importante que ambas as superfícies de cartilagem fiquem voltadas uma para a outra e entrem em contato com o hidrogel.Coloque o banho de água de plexiglás sobre a placa aquecedora e insira o bloco de aço inoxidável com o substrato de cartilagem dentro do banho. Abaixe o braço do suporte de teste e alinhe ambos os substratos de cartilagem um com o outro. Em seguida, levante o braço, deixando espaço suficiente para aplicar o hidrogel.Com uma pipeta de deslocamento positivo, distribua 200 microlitros do hidrogel bioadesivo na peça inferior da cartilagem. Abaixe o braço do suporte de força a uma taxa de um mililitro por minuto até que o hidrogel entre em contato com a peça superior da cartilagem e exerça uma força de pré-carga de 0,001 newtons. Despeje a solução salina a 37 graus Celsius na cuba até que o volume atinja o nível d'água designado.Verifique a temperatura da solução com um termopar. Após deixar o hidrogel endurecer por um total de cinco minutos, levante o braço a uma velocidade de dois milímetros por minuto. O teste é concluído quando o bioadesivo se desprende do substrato de cartilagem ou quando ocorre uma queda significativa na força, indicando falha.Colete os dados registrados e levante o braço do suporte de teste. Remova o cilindro de Delrin do medidor de força. Despeje a solução salina no recipiente anterior e aqueça novamente a 37 graus Celsius.Calcule as tensões, conforme descrito no protocolo no texto. Antes de realizar o ensaio Live/Dead com CS enxertado com PNIPAAm, prepare células de rim embrionário humano, ou células HEK 293, conforme detalhado no protocolo no texto. Crie monocamadas de controle positivo pipetando múltiplos volumes de 300 microlitros da mistura celular em uma placa de 24 poços para gerar quatro a seis amostras replicadas.Mantenha a mesma concentração celular re-suspendendo as células em aproximadamente dois mililitros de CS com enxerto de PNIPAAm para cada amostra replicada. Pipete a mistura de polímero e células para cima e para baixo usando uma pipeta serológica até ficar homogênea. Se for semear com micropartículas de alginato, transfira dois mililitros da suspensão celular de CS com enxerto de PNIPAAm para uma placa de cultura de 35 milímetros e introduza 200 miligramas de partículas na mistura.Pipete a mistura celular para cima e para baixo usando uma pipeta serológica até ficar homogênea. Em seguida, com uma pipeta serológica, distribua múltiplos volumes de 300 microlitros da mistura polimérica celular em cada um dos poços para controle morto, CS enxertado com PNIPAAm e CS enxertado com PNIPAAm com micropartículas de alginato, gerando quatro a seis amostras replicadas. Incube a placa a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos e permita que o CS enxertado com PNIPAAm transite de líquido para gel. O polímero forma um disco branco opaco. Posicione um aquecedor de lâminas na capela e ajuste a temperatura para 37 graus Celsius. Use o aquecedor de lâminas para manter a temperatura da placa de poços e pipete 600 microlitros de meio pré-aquecido em cada poço.Para evitar ainda mais a transição do polímero para o estado líquido, posicione uma lâmpada com lâmpada fluorescente acima da placa para aquecer o ar acima dela. Incube as células por cinco dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após decorridos cinco dias, remova o meio dos poços da monocamada, do CS enxertado com PNIPAAm e do CS enxertado com PNIPAAm com micropartículas de alginato.Lave todos os poços cuidadosamente, mas suavemente, com PBS e, em seguida, remova o PBS. Deixe os discos de hidrogel contendo micropartículas de alginato liquefazerem à temperatura ambiente e adicione dois mililitros de citrato de sódio 50 milimolar a cada um dos poços. Remova o meio dos poços com células mortas.Deixe os discos de hidrogel liquefazerem à temperatura ambiente e adicione 300 microlitros de metanol 70% a cada poço antes de incubar a placa por 45 minutos a 37 graus Celsius. Remova as soluções de citrato de sódio e metanol dos poços e pipete cada uma das suspensões de hidrogel para tubos microcentrífugos individuais. Centrifugue os tubos a 2.000 × g por 10 minutos para separar as células da suspensão de hidrogel.Remova cuidadosamente a suspensão pipetando a solução do tubo cônico, deixando para trás o pellet celular. Re-suspenda o pellet em 300 microlitros de PBS e transfira para a placa de poços original. Em seguida, adicione 300 microlitros da mistura de corante Vivos/Mortos a cada um dos poços.Cubra a placa de poços com papel alumínio e incube por 45 minutos em agitador, à temperatura ambiente, antes de analisar todas as amostras em um microscópio de fluorescência invertido com objetiva de 10X. Aqui são apresentados resultados representativos de resistência à tração tanto para o CS enxertado com PNIPAAm quanto para o CS enxertado com PNIPAAm com diferentes formulações de micropartículas de alginato. A resistência à tração do CS enxertado com PNIPAAm quadruplicou com a adição de 50 ou 75 miligramas por mililitro de micropartículas de alginato.Como esperado, o copolímero PNIPAAm enxertado em CS contrai e reduz seu volume acima de sua temperatura crítica inferior de solução. A introdução de micropartículas dentro do hidrogel confere um efeito de inchamento ao longo de um período de sete dias em PBS. Células HEK 293 encapsuladas tanto no copolímero PNIPAAm enxertado em CS quanto no copolímero PNIPAAm enxertado em CS com micropartículas de alginato mostraram fluorescência celular ativa utilizando corante Live/Dead após um período de cinco dias.Esses resultados podem ser comparados aos poços dos controles positivo e negativo. Em paralelo, um ensaio quantitativo foi utilizado para confirmar a imagem Live/Dead, o qual não mostrou diferenças significativas na viabilidade celular entre o CS enxertado com PNIPAAm, o CS enxertado com PNIPAAm com micropartículas de alginato e o monocamada controle. Um compósito de hidrogel composto por poli(N-isopropilacrilamida) termossensível enxertada com sulfato de condroitina e micropartículas de alginato foi criado para substituição do núcleo pulposo.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que o compósito é sensível à temperatura e se liquefaz abaixo de sua temperatura crítica inferior de solução. Uma vez dominado, testes mecânicos de tração podem ser realizados com facilidade, desde que se pratique uma precisão cuidadosa. Estudos de inchamento revelam a capacidade de um hidrogel de reter água.No entanto, esses testes devem imitar o ambiente nativo in vivo. A viabilidade celular dos géis termossensíveis pode ser confirmada e avaliada por meio de uma combinação de marcadores fluorescentes e reagentes produtores de metabolitos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como os injetáveis termossensíveis são aplicados nos discos intervertebrais e na engenharia de tecidos, e de que forma os compósitos podem realçar certas propriedades do material.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nas seções seguintes, que definirá procedimentos para a preparação de microesferas de alginato para uso em aplicações biomédicas. Nós especificamente ilustram uma técnica para a criação de várias camadas de alginato microesferas para a dupla finalidade de célula e de encapsulamento proteína como um tratamento potencial para a diabetes tipo 1.

Geração de alginato Microesferas para aplicações biomédicas

Um bioprinter foi usada para criar hidrogéis modeladas com base num molde de sacrifício. O molde foi poloxâmero backfilled hidrogel com um segundo e, em seguida eluiu-se, deixando espaços vazios que foram preenchidos com uma terceira hidrogel. Este método utiliza eluição rápida e boa capacidade de impressão de poloxamero para gerar arquiteturas complexas de biopolímeros.

Impressão de Moldes reversa Thermoresponsive para a Criação de Patterned hidrogéis de dois componentes para Cultura de Células em 3D

Apresentamos um protocolo para sintetizar micro-hidrogéis Janus compostos inteiramente do mesmo material base, poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm), com uma estrutura claramente compartimentada baseada na separação de fases de uma solução supersaturada de monômero NIPAAm. Os microhidrogéis Janus sintetizados apresentam propriedades únicas, como termorresponsividade anisotrópica e capacidade de carga organofílica/hidrofílica.

Síntese de Poli (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Janus Microhydrogels para anisotrópica Thermo-resposta e Organophilic / Carregando Capability hidrofílico

Os andaimes para engenharia de tecidos precisam recapitular o complexo microambiente bioquímico e biofísico do nicho celular. Aqui, mostramos o uso de fibras de complexação de polieletrólitos interfaciais como uma plataforma para criar andaimes poliméricos compostos e multicomponentes com liberação bioquímica sustentada.

Andaimes de mistura de fibras Interfacial polieletrólito para lançamento Temporalmente controlada de biomoléculas

O reparo da cartilagem representa um desafio médico não atendido e as abordagens baseadas em células para projetar a cartilagem articular humana são uma solução promissora. Aqui, descrevemos os hidrogéis biomiméticos tridimensionais (3D) como uma ferramenta ideal para a expansão e maturação de condrócitos articulares humanos.

3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

Engenharia e análise de tecidos de suporte de carga com populações de células heterogêneas ainda são um desafio. Aqui, descrevemos um método para criar discos de hidrogel de alginato em duas camadas como uma plataforma para co-cultura de diversas populações de células dentro de uma construção.

Em camadas de alginato Constrói: Uma Plataforma para Co-cultura de populações de células heterogéneas

Apresentamos um protocolo para a síntese de hidrogéis funcionalizados com RGD como dispositivos para liberação de células e fármacos. O procedimento envolve cicloadição de alcino-azida catalisada por cobre (CuAAC) entre ácido poliacrílico modificado com alcino (PAA) e um derivado RGD-azida. Os hidrogéis são formados por policondensação assistida por micro-ondas e suas propriedades físico-químicas são investigadas.

A Síntese de hidrogéis RGD-funcionalizado como uma ferramenta para aplicações terapêuticas

Apresentado aqui é um simples de usar, Core/Shell, tridimensional bioprinting set-up para uma etapa de fabricação de andaimes ocas, adequado para a engenharia de tecidos vasculares e outras estruturas tubulares.

Núcleo/Shell impressão scaffolds para engenharia de tecidos de estruturas tubulares

O presente protocolo descreve um método não baseado emulsão para a fabricação de microgéis de genipin quitosano. O tamanho desses microgésis pode ser precisamente controlado, e eles podem exibir inchaço dependente de pH, degradar in vivo, e ser carregados com moléculas terapêuticas que liberam ao longo do tempo de forma sustentada, tornando-os altamente relevantes para aplicações de engenharia de tecidos.

Fabricação de microgéis chitosan-genipin controlados por tamanho e sem emulsão para aplicações de engenharia de tecidos

Este protocolo descreve um conjunto de métodos para sintetizar os blocos de construção de microgel para andaime de partículas de annealed microporoso, que podem ser usados para uma variedade de aplicações de medicamentos regenerativos.

Síntese Microfluiídica de Blocos de Construção de Microgel para andaime de partículas recíprocas microporosas

Este trabalho apresenta um novo método para a síntese de hidrogéis de matriz extracelular de cartilagem decelularizada (DC-ECM). Os hidrogéis DC-ECM têm excelente biocompatibilidade e fornecem um microambiente superior para o crescimento celular. Portanto, podem ser arcabouços celulares ideais e sistemas de liberação biológica.

Síntese de Hidrogéis de Matriz Extracelular de Cartilagem Descelularizada

Aprenda a avaliar propriedades adesivas e biocompatibilidade celular de hidrogéis termossensíveis com micropartículas de alginato para engenharia de tecidos do núcleo pulposo.

Síntese de termogelificantes poli (N-isopropilacrilamida) -graft-condroitina Composites Sulfato com alginato micropartículas para Engenharia de Tecidos (Vídeo) | JoVE Journal

Síntese de termogelificantes poli (N-isopropilacrilamida) -graft-condroitina Composites Sulfato com alginato micropartículas para Engenharia de Tecidos

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