Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

O objetivo geral deste procedimento é isolar cardiomiócitos primários viáveis de camundongos adultos para cultura e transdução de vetores adenovirais. Este método responderá a algumas das questões-chave no campo da pesquisa cardiovascular. Em particular, podemos ajustar o que impede que os cardiomiócitos de mamíferos adultos entrem e completem o ciclo celular.

A principal vantagem desta técnica é que um alto rendimento de cardiomiócitos adultos viáveis de camundongos pode ser obtido para cultura de longo prazo. A demonstração visual desse método é fundamental, pois os procedimentos de extração e canulação do coração são difíceis, mas devem ser realizados de forma rápida e eficiente. Para extrair o coração, comece tratando um camundongo adulto com cinco unidades internacionais de heparina por grama de peso corporal por injeção intraperitoneal.

Aguarde 20 minutos para permitir que a heparina circule para o coração. Em seguida, após a administração da anestesia, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé e aos reflexos da córnea e prenda os membros do animal a uma plataforma de cirurgia. Esterilize a área da incisão, com aplicação liberal de 70% de etinol e, em seguida, seque o cabelo com um lenço umedecido.

Em seguida, use uma pinça para levantar a pele logo abaixo do esterno e faça uma incisão lateral através da pele e do peritônio. Em seguida, usando hemostáticos, levante suavemente a caixa torácica através do esterno e use uma pequena tesoura de dissecção para estender a incisão em forma de V em direção ao axial. Corte a primeira costela e perfure o diafragma de cada lado, mantendo a caixa torácica levantada com os hemostáticos.

Usando uma pequena tesoura de íris, corte completamente o diafragma. Em seguida, use os hemostáticos para retrair a caixa torácica rostralmente e rapidamente, mas com cuidado, estenda a incisão através da caixa torácica em direção à axialmente em ambos os lados. Retraia totalmente a seção intermediária da caixa torácica, colocando os hemostáticos anexados para manter o tecido no lugar e remova o pericárdio com uma pinça fina.

Em seguida, use uma pinça curva para levantar suavemente o coração e transeccionar as veias e artérias anexadas. Lave o coração em tampão de perfusão gelado e, em seguida, transfira o coração para um pequeno pedaço de malha de 215 mícrons. Adicione tampão de perfusão gelado para retardar as contrações miocárdicas e coloque o prato sob um microscópio de dissecação.

Usando uma tesoura de íris fina, apare qualquer tecido não cardíaco de acesso. Em seguida, aorta se aproxime da artéria braquiocefálica, tomando cuidado para não deixar bolhas ou detritos de tecido entrarem na abertura. Para canular o coração, encha a placa de Petri com tampão de perfusão gelado até que a solução suba acima da abertura da cânula de calibre 18.

Em seguida, mantendo a ponta da cânula e da aorta abaixo da superfície do tampão, coloque a aorta na cânula até que a ponta da agulha esteja distal à válvula aórtica. Deslize uma sutura de seda 7-0 pré-amarrada pela haste da agulha de canulação até que a sutura esteja logo acima da ponta da agulha e aperte o nó com uma pinça fina. Coloque uma segunda sutura logo acima da primeira.

Em seguida, pressione lentamente a seringa até que 0,5 mililitros de tampão de perfusão tenham sido injetados através da vasculatura coronária. Depois de remover a seringa, conecte a cânula à porta de saída de perfusão. No final da perfusão, use uma pinça para remover o coração da cânula e coloque o coração em uma placa de Petri vazia.

Usando uma tesoura de íris fina, apare rapidamente o tecido extraventricular e lave os ventrículos em uma nova placa de Petri contendo tampão de perfusão. Após a lavagem, transfira os ventrículos para uma placa de Petri seca e coloque em um capuz estéril. Colete 7,5 mililitros de tampão de digestão da camisa de calor do sistema de perfusão e adicione 2,8 microlitros de cloreto de cálcio molar.

Misturar a solução por inversão. Em seguida, adicione dois a três mililitros do tampão de digestão suplementado com cloreto de cálcio aos ventrículos. Usando uma pinça fina, tritchera rapidamente o tecido ventricular até que a maioria das peças seja menor que um milímetro cúbico e adicione o tampão de digestão suplementado com cloreto de cálcio restante aos tecidos dissociados.

Misturar os fragmentos por agitação suave. E incube-os a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono com agitação contínua a cada dois minutos até que um número suficiente de cardiomiócitos tenha sido liberado. Em seguida, retorne o prato para a capela de fluxo laminar e use uma pipeta de transferência para dissociar suavemente o tecido.

Usando luvas estéreis, dobre a malha de 215 mícrons em um cone e segure-a sobre um tubo cônico de 50 mililitros. Pipetar a pasta de tecido para a malha e deixar o filtrado escorrer para o tubo. Seguido de uma lavagem com 7,5 mililitros de tampão de parada pré-aquecido.

Transfira a suspensão celular para uma cônica de 15 mililitros e deixe as células assentarem por gravidade por 15 minutos. Em seguida, use uma nova pipeta de transferência para remover cuidadosamente o sobrenadante até que apenas 50 a 100 microlitros de solução permaneçam acima das células. Adicione 10 mililitros de meio de cultura equilibrado pré-aquecido às células e misture por inversão suave.

Finalmente, após mais 15 minutos de incubação em temperatura ambiente, use uma nova pipeta de transferência para remover o sobrenadante das células sedimentadas, até que restem apenas 50 a 100 microlitros de meio. Imediatamente após o isolamento, os cardiomiócitos mantêm uma aparência principalmente em forma de bastonete com sarcômeros intactos e uma membrana externa afiada sob iluminação de campo claro. A imunomarcação para marcadores sarcoméricos específicos de cardiomiócitos, como alfa actinina, revela um padrão distinto de bandas sarcoméricas.

Após vários dias em cultura, os cardiomiócitos assumem uma morfologia arredondada. Dentro de uma a duas semanas, os cardiomiócitos vivos se ligam ao substrato e começam a se espalhar. A transdução com adenovírus, como observado nesses cardiomiócitos positivos para GFP, pode ser usada para atingir uma forte expressão gênica dentro de 48 a 72 horas.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em quatro horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de obter uma canulação segura e livre de bolhas de ar para profundir eficientemente a vasculatura coronária. Após este procedimento, outros métodos, como imunocoloração ou imagem ao vivo, podem ser realizados para responder a perguntas como por que os cardiomiócitos de mamíferos adultos são resistentes à divisão celular?

Não se esqueça de que trabalhar com adenovírus pode ser extremamente perigoso, portanto, as precauções apropriadas devem ser seguidas, como trabalhar em um gabinete de biossegurança de classe dois.