Os ensaios para a degradação de proteínas em células deformadas

Este relatório descreve protocolos para medir as taxas de degradação de proteínas mal dobradas por ensaios baseados em western blot ou fluorescência. Os métodos podem ser aplicados à análise de outras proteínas mal dobradas e para triagem de alto rendimento.

O objetivo geral deste ensaio é medir as taxas de degradação celular de proteínas mal dobradas. Proteínas mal dobradas estão associadas a muitas doenças neurodegenerativas. Este ensaio ajuda a investigar os sistemas de controle de qualidade de proteínas celulares que são protetores contra proteínas aberrantes.

Proteínas propensas a dobramento incorreto podem existir em diferentes formas nas células. Ao combinar o fracionamento celular com a perseguição do método ciclohexano, a principal vantagem dessa técnica é medir especificamente a meia-vida das espécies mal dobradas. Usamos duas proteínas modelo como exemplos.

Uma proteína poliglutamato altamente propensa à agregação, Atxn1 82Q e um mutante de luciferase nuclear conformacionalmente instável. O protocolo também pode ser aplicado a outras medições de proteínas mal dobradas. Para realizar um ensaio de degradação para Atxn1 82Q GFP, plaquear aproximadamente 3x10^5 células HeLa em placas de 35 milímetros com meio DMEM e 10%FBS.

Incubar as células durante a noite para que atinjam 40 a 60% de confluência no momento da transfecção. Quatro a cinco horas após a transfecção das células com Atxn1 82Q GFP PRK5, sob um microscópio de florescência, use um comprimento de onda de excitação de 450 a 490 nanômetros para examinar as células vivas quanto à expressão de GFP nos núcleos, caracterizada pela presença de manchas difusas e pequenas de sinais de GFP. Pouco antes do tratamento com cicloheximida, colha um prato de células removendo o meio e usando três mililitros de PBS gelado para lavar as células duas vezes.

Em seguida, congele o prato em gelo seco. Para as placas de células restantes, remova o meio por aspiração a vácuo e adicione dois mililitros de DMEM fresco contendo 50 microgramas por mililitro de cicloheximida. Adicione também 10 micromolares do inibidor de proteassoma, MG132 a uma placa.

Incube as células tratadas por quatro, oito, 12 e 16 horas antes de congelar em gelo seco. Após a colheita das células tratadas com MG132 em 16 horas, raspe as células congeladas de todas as placas em 150 microlitros de tampão de lise celular gelado e incube no gelo por 30 minutos. Centrifugue os lisados em uma centrífuga de bancada a 17.000x g e quatro graus Celsius por 15 minutos.

Em seguida, transfira o sobrenadante que contém proteínas solúveis MP40 para outro tubo. Enxágue os pellets adicionando suavemente aproximadamente 200 microlitros de 1x PBS aos tubos sem mexer nos pellets. Remova cuidadosamente o PBS por aspiração ou pipeta, ressuspenda os pellets em 150 microlitros de tampão de pellets gelados e depois incube-os no gelo por 15 a 30 minutos.

Em seguida, adicione 75 microlitros de tampão de ebulição 3x nas frações solúveis MP40 e nas frações insolúveis MP40 ressuspensas dos pellets. Em seguida, aqueça as amostras a 95 graus Celsius em um bloco de calor por cinco minutos. Adicione o tampão de carregamento de gel SDS a uma alíquota de frações solúveis e insolúveis MP40 fervidas.

Carregue volumes iguais de amostras coletadas de todos os pontos de tempo em um gel SDS-PAGE. Detecte Atxn1 82Q GFP solúvel em MP40 e SDS solúvel por Western blot usando anticorpo anti GFP e quimioluminescência aprimorada. Para examinar o Atxn1 82Q resistente a SDS da fração de pellets com um ensaio de retardo de filtro, configure um aparelho de gráfico de pontos segurando uma membrana de acetato de celulose de 0,2 mícron.

Em seguida, carregue 80 a 120 microlitros de amostras insolúveis MP40 fervidas em cada poço do aparelho de dot blot. Depois de filtrar as amostras através da membrana por vácuo, detecte agregados Atxn1 82Q GFP presos na membrana por immunoblotting anti-GFP. É fundamental usar um ensaio de retardo de filtro para examinar os níveis de forma resistente a SDS ao longo do tempo.

Isso ocorre porque a forma solúvel de SDS pode se transformar em uma forma resistente a SDS em vez de ser degradada. Neste exemplo, a forma resistente ao SDS é mínima e permanece em um nível semelhante ao longo do experimento de perseguição. Para realizar um ensaio de degradação, após uma transfecção noturna de células HeLa com NLS-luciferase-GFP, examine as células vivas sob um microscópio fluorescente invertido para expressão de GFP com um comprimento de onda de excitação de 450 a 490 nanômetros.

Pouco antes do tratamento com cicloheximida, colha uma placa de células removendo o meio e use três mililitros de PBS gelado para lavar as células duas vezes. Em seguida, congele o prato em gelo seco. Para as placas restantes, após remover o meio, adicione dois mililitros de DMEM fresco contendo 50 microgramas por mililitro de cicloheximida e adicione 10 micromolares do inibidor de proteassoma MG132 a uma placa.

Trate as células por 1,5, três, 4,5 e seis horas antes da colheita, conforme descrito, colhendo as células tratadas com MG132 em seis horas. Após a colheita do último ponto de tempo das células, raspe cada placa em 150 microlitros de tampão de lise celular gelada e incube no gelo por 30 minutos. Incubar as amostras em bloco de calor a 95 graus Celsius por cinco minutos, antes de realizar SDS-PAGE e Western blotting de acordo com o protocolo de texto.

Adicione tampão de carregamento de gel SDS aos lisados de células inteiras para uma concentração final de 2% SDS e 50 DTT milimolar. Após semear e transfectar células HeLa em placas de 96 poços de acordo com o protocolo de texto, 20 a 24 horas após a transfecção, examine as células quanto à expressão de GFP. Remova o meio, adicione aproximadamente 200 microlitros de 1x PBS a cada poço e, em seguida, aspire-o para remover o DMEM residual.

Adicione 60 microlitros de DMEM de baixa fluorescência com 5% FBS e 50 microgramas por mililitro de cicloheximida e adicione 10 micromolares MG132 a um conjunto de amostras. Com um leitor de placas de fluorescência, meça o sinal GFP, lendo as placas a cada hora por até oito a 10 horas. Exporte os dados e realize análises estatísticas de acordo com o protocolo de texto.

Em uma análise de estado estacionário, agregados nucleares Atxn1 82Q GFP microscopicamente visíveis podem ser observados em 30 a 50% das células HeLa 20 horas após a transfecção. Como visto aqui por Western blot, a meia-vida de Atxn1 82Q GFP na fração solúvel SDS é de cerca de cinco horas. Em contraste com uma ligeira ou nenhuma diminuição no Atxn1 82Q GFP na fração solúvel MP40 ao longo de 16 horas.

A degradação de Atxn1 82Q GFP é parcialmente inibida pelo tratamento de células com MG132. Essas imagens ilustram que 20 horas após a transfecção, os agregados GFP mutantes da NLS-luciferase DM tornam-se microscopicamente visíveis em cinco a 15% das células HeLa. Western blots revelaram que a meia-vida do SDS solúvel NLS-luciferase DM mutante GFP é de duas a três horas.

Além disso, a intensidade de florescência das células transfectadas também diminui com o tempo após o tratamento com cicloheximida. Aproximadamente seis horas após o tratamento com cicloheximida, a GFP mutante solúvel NLS-luciferase DM é amplamente degradada, sugerindo que a fluorescência restante é gerada a partir de espécies agregadas resistentes à degradação. Essas imagens de florescência confirmam que a GFP agregada, mas não difusa, permanece nas células nove horas após o tratamento com cicloheximida.

Bem, o ensaio baseado em immunblotting leva alguns dias para ser realizado. As taxas de degradação da proteína podem ser obtidas imediatamente após a perseguição da cicloheximida usando um ensaio baseado em fluorescência. Tanto os ensaios baseados em immunoblotting quanto os de fluorescência podem ser aplicados a estudos de outras proteínas mal dobradas.

Este último também é adequado para triagem de alto rendimento para identificar macromoléculas ou pequenos compostos que podem modular a degradação de proteínas mal dobradas. É importante lembrar que, para algumas proteínas mal dobradas, como Atxn1 82Q, a meia-vida só pode ser medida por meio de fracionamento celular e immunoblotting e isso ocorre porque as espécies mal dobradas que se degradaram rapidamente são apenas uma pequena parte da expressão geral de Atxn1 82Q. Para descobrir o mecanismo de controle de qualidade de uma proteína, os ensaios de degradação de proteínas precisam ser acoplados à análise dos níveis de estado estacionário dos agregados, bem como se eles são partições em diferentes frações celulares.

Outros experimentos, como ensaios de dobramento e agregação de proteínas in vitro, também podem ser realizados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir as taxas de degradação de proteínas de dobramento incorreto usando diferentes estratégias. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.