Wet Chemistry and Peptide Imobilização em Polytetrafluoroethylene para Melhoria de adesão celular

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um tratamento de superfície baseado em química úmida para o polímero de carbono floral politetrafluoretileno, ou PTFE. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos biomateriais, como melhorar a biocompatibilidade de polímeros médicos. A principal vantagem dessa técnica é que apenas é necessário um mínimo de equipamento e que o método é mais geralmente aplicável em comparação com outros métodos.

A preparação da solução de naftaleneto de sódio necessita de condições estritamente avermelhadas. Corte 0,25 gramas de sódio metálico em pedaços pequenos para aumentar a dissolução. Adicione o metal de sódio a uma solução de 1,4 gramas de naftelina em 20 mililitros de tetrahidrofurano em uma garrafa de vidro de 100 mililitros com tampa de rosca, equipada com uma barra de agitação magnética revestida com PTFE.

Aqueça modestamente a solução para aumentar ainda mais a dissolução. A solução final tem uma cor escura, ligeiramente esverdeada, e pode ser armazenada em condições estritamente secas. Perfure discos de PTFE de 12 milímetros de diâmetro a partir de material de folha de 0,5 milímetro de espessura.

Marque um lado e limpo é iso-propanol. Incubar amostras de PTFE individualmente na solução de ativação por um a dois minutos, usando uma pinça. A mudança de cor de branco para marrom escuro indica tratamento bem-sucedido.

Em seguida, enxágue duas vezes com THF e depois com iso-propanol. Oxidar as amostras tratadas em peróxido de hidrogênio a 30%, contendo ácido tricloroacético a 20% por três horas. Lave com água e seque.

A superfície agora tem uma leve aparência acastanhada. Trate os discos oxidados com 50% HMDI em THF seco por duas horas. Em seguida, enxágue com THF e deixe secar.

Finalmente, hidrolise as amostras contendo isocianato em água por duas a três horas e seque. Coloque cada disco aminado com o lado marcado para cima nos poços individuais de uma placa de 24 poços. Adicione 1,5 mililitros da solução epóxida, garantindo a cobertura total das amostras.

Depois de incubar por duas horas, lave duas vezes com água e uma vez com tampão de carbonato. No fundo de poços individuais de uma placa fresca de 24 poços, adicione 50 microlitros de 0,5 miligrama por mililitro de peptídeo e tampão de carbonato 50 milimolar, pH nove, contendo 0,1% de azida de sódio. Coloque cuidadosamente os discos funcionalizados com epóxi de cabeça para baixo sobre as gotas da solução peptídica.

Certifique-se de que o espaço entre o fundo de um poço e o disco de PTFE esteja completamente molhado devido à ação capilar. Incube a placa por pelo menos três horas ou durante a noite em uma câmara úmida com atmosfera umidificada, conseguida colocando papel de seda úmido no fundo da câmara. Após a incubação, lave três vezes com água e esterilize em água com isopropanol a 50% por pelo menos 30 minutos.

Antes da semeadura celular, conforme descrito no protocolo de texto, enxágue as amostras em solução salina tamponada com fosfato estéril. Os resultados das etapas cruciais da reação química foram monitorados por espectroscopia de infravermelho. A ativação inicial com naftalamida sódica gera ligações duplas e, em menor grau, funcionalidades de hidroxila.

O sinal que indica ligações duplas de carbono desaparece com a oxidação, produzindo uma superfície com quase exclusivamente grupos hidroxila. As mudanças de cor devido à ativação e oxidação estão de acordo com a química esperada. Espera-se que os sistemas de ligação dupla conjugados sejam acastanhados e a perda dos sistemas de ligação dupla resulta em clareamento.

Além disso, o possível resultado de ativação e oxidação na morfologia da superfície foi investigado por meio de microscopia eletrônica de varredura. Praticamente nenhum efeito prejudicial do tratamento foi observado. A imobilização do peptídeo adesivo das células endoteliais, arginina, glutamina, valina do ácido aspártico, na superfície do polímero, suporta o crescimento das células endoteliais.

Considerando que praticamente nenhuma adesão e proliferação celular ocorre em material não tratado, a modificação apóia fortemente a colonização por um período de duas semanas. Exemplificada para uma aplicação clínica, a modificação foi realizada de forma idêntica em material original de um enxerto comercialmente disponível feito de PTFE expandido com resultados semelhantes durante um período de uma semana. Uma vez dominada, essa técnica leva cerca de 12 horas.

Deve-se ter em mente que este procedimento é específico para PTFE. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como ativar o PTFE na superfície e como imobilizar peptídeos nas etapas subsequentes. Após este procedimento, outras moléculas, como polissacarídeos ou fatores de corda, podem ser imobilizadas de maneira semelhante.

Lembre-se de que trabalhar com produtos químicos altamente tóxicos e corrosivos é perigoso e que as precauções padrão devem ser tomadas.