Name: Wet Chemistry and Peptide Imobilização em Polytetrafluoroethylene para Melhoria de adesão celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Aprenda a modificar superfícies de PTFE por química úmida para melhorar biocompatibilidade em biomateriais médicos. Este método simplificado requer equipamento mínimo e pode ser aplicado em engenharia de tecidos.

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Os autores gostariam de agradecer a ajuda de Walter Scholdei (Max-Planck-Institute for Polymer Research, Mainz, Alemanha.

1. Preparação de sódio naftaleneto Activar Solution e ativação de superfície Nota: Realizar reações em um exaustor bem ventilado. Siga as regras gerais para lidar com solventes altamente inflamáveis ​​e corrosivos metais como o sódio metálico. Naftaleno tem um cheiro muito desagradável (naftalina), mesmo em quantidades muito pequenas! Se não for indicado de outro modo as reacções são realizadas à temperatura ambiente. A azida de sódio é altamente tóxico! THF (99,9%, ver Lista de Materiais) foi armazenada ao longo de aproximadamente 20% (em volume) de crivo molecular. Destila-se THF com um teor de água perceptível ao longo de sódio. A formação de naftaleneto de sódio não ocorre se pequenas quantidades de água estão presentes. <ol><li> A uma solução de 1,4 g (10,9 mmol) de naftaleno em 20 ml de tetra-hidrofurano (THF, seco sobre peneiro molecular de 3 Á), adicionar 0,25 g (10,9 mmol) de metal de sódio em uma garrafa de vidro de 100 ml com tampa de rosca equipado com um PTFE revestido barra de agitação magnética. Nota: dissolução pode ser grandemente aumentada através do corte do de sódio em pedaços pequenos e aquecimento moderado (35 - 40 ° C). A solução final tem uma cor ligeiramente esverdeada escura e podem ser armazenadas em condições rigorosamente seco. </li><li> Punch out discos de PTFE de 12 mm de diâmetro a partir de material de folha de espessura de 0,5 mm. Mark um lado (por exemplo, usando uma carta carimbo de soco) e limpo, com iso-propanol. </li><li> Incubar PTFE-amostras individualmente na solução de activação (passo 1.1) para 1 - 2 min usando uma pinça. Nota: A mudança de cor do branco ao marrom escuro indica o sucesso do tratamento. </li><li> Subsequentemente lavar duas vezes com THF e depois com iso-propanol. Nota: A solução naftaleneto se esgota quando sua cor muda para um castanho claro aguado. naftaleneto solução não utilizada (possivelmente contendo sódio metálico) tem de ser decomposto por adição lenta de iso-propanol antes da sua eliminação. </li><li> Oxidar amostras tratadas em peróxido de hidrogénio (30%) contendo 20% (w / v) de ácido tricloroacético, durante 3 h. lavarcom água e seco. A superfície agora tem uma aparência leve acastanhada. Nota: A activação e o resultado de oxidação em uma molhabilidade drasticamente aumentada da superfície. Esta descoberta foi examinada em detalhe anteriormente 14. </li><li> Tratar discos oxidados com 50% (v / v) de diisocianato de hexametileno (HMDI) em THF seco durante 2 h, lavar com THF e deixar secar. </li><li> Hidrolisar amostras com isocianato em água por 2-3 horas e seco. Nota: A superfície de PTFE amino-funcionalizado final é muito mais estável do que as amostras de rolamento isocianato e é compatível com muitos agentes de ligação cruzada standard para acoplamento adicional. </li></ol> 2. Peptide Imobilização <ol><li> Prepara-se uma solução de 20% (v / v) de éter de diglicidilo de dietilenoglicol (diepóxido) em 50 mM de tampão carbonato, pH 9. </li><li> Colocar os discos aminado com o lado marcados individualmente para uma placa de 24 poços e adicionar 1,5 ml da solução de epóxido. Assegurar uma cobertura completa das amostras. Incubar durante 2 horas e lavar duasvezes com água e uma vez com tampão de carbonato. </li><li> Adicionar 50 ul de uma solução a 0,5 mg / ml de péptido (por exemplo, REDV) em 50 mM de tampão carbonato, pH 9 contendo 0,01% de NaN 3, ao fundo dos poços individuais de uma placa de 24 poços frescas e colocar cuidadosamente os discos de cabeça funcionalizado com epoxi -down (isto é, marcada voltado para baixo) para a gota de solução de péptido. Certifique-se de que o espaço entre a parte inferior do poço e o disco de PTFE é completamente molhado devido à acção capilar. </li><li> Incubar numa câmara húmida (por exemplo, qualquer caixa de plástico lacrado com uma tampa de fecho estanque) com atmosfera húmida (por colocação de papel de tecido húmido na parte inferior) durante pelo menos 3 horas ou durante a noite. Nota: Embora o motivo REDV pode ser considerado como bem caracterizado, uma sequência de aminoácido codificado ou inverso pode ser incluído como um controlo negativo adicional. </li><li> Lavar três vezes com água e esterilizar em 50% de iso-propanol / água durante pelo menos 30 min. Antes da sementeira, célula RinsÊ O amostras em solução salina estéril tamponada de fosfato (PBS). </li></ol> Sementeira 3. celular <ol><li> HUVECs crescem utilizando procedimentos de cultura celular padrão 17,18. </li><li> Colocar as amostras de peptídeos conjugados com o lado alterado em um placas de 24 poços. Use discos de PTFE não tratado como um controlo. </li><li> Semente de 5 x 10 4 HUVEC em 2 ml de meio por poço e incubar durante 4 horas a 37 ° C e CO2 a 5% numa incubadora. </li><li> Retire os discos, lavar cuidadosamente para remover células não ligadas e transferir para um placa de 24 poços fresco. Adicionar 2 ml de meio fresco e incubação durante o período desejado (por exemplo, 24 horas, 1 W, etc.). Mudança do meio de dois em dois dias. </li><li> Prepara-se uma solução stock de 1 mg / ml de Calcein-AM em sulfóxido de dimetilo (DMSO). </li><li> Após o crescimento as células de remover o meio, lava-se com PBS e adicionar PBS contendo 1 ul / ml de mancha calceína-AM (por exemplo, 1 ul de uma solução de stock por ml de PBS). Agite suavemente e incubate a 37 ° C durante 45 min no escuro. </li><li> Lava-se com PBS e imediatamente tomar micrografias num microscópio de fluorescência equipado com filtros FITC padrão (Ex 488 nm, Em 515 nm). Use ampliação de 100 vezes. Execute triplicados de não modificada, bem como amostras tratadas. </li><li> Utilizando o software ImageJ determinar a área colonizados pelas células. Alternativamente contar as células manualmente ou usar ImageJ. Ambos os métodos lhe dará informações semelhantes sobre a ligação e crescimento de células nas respectivas superfícies. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A descrição detalhada do protocolo de modificação da superfície de PTFE consiste em passos sucessivos começando com a eliminação de flúor a partir da espinha dorsal do polímero, como representado na Figura 6. Como resultado, uma camada é formada, que contém uma quantidade abundante de ligações duplas conjugadas carbono-carbono em acordo com a cor marrom escuro que se desenvolveu após tratamento naftaleneto. oxidação padrão com água oxigenada ácida produz uma superfície hidroxilada acompanhada por clarea...

Vários polímeros utilizados na medicina que tenham sido aprovados por algum tempo não apresentam biocompatibilidade melhorada, isto é, a falta de adesão célula-a adesividade, a indução de encapsulamento fibrótica e trombogenicidade, para mencionar alguns. As interacções entre o biomaterial e o sistema biológico ocorre principalmente na superfície do implante. Como consequência, a investigação centrou-se na modificação da superfície, a fim de criar propriedades apropriadas para uma aplicação desejada, deixando as propriedades de volume do material afectado. Politetrafluoroetileno (PTFE) como um polímero fisiologicamente inerte é utilizado em muitos campos médicos, tais como hérnia uma malha cirúrgica, portas médicos 2 e, o mais importante, os enxertos vasculares 3. Especialmente em situações de contacto de sangue a natureza hidrofóbica de PTFE faz com que a adsorção não específica dos componentes do plasma e como uma consequência a adesão de plaquetas, frequentemente resultando em thrombotieventos c e oclusão do enxerto 4. Além disso, o PTFE, como a maioria dos polímeros, não suporta a adesão celular e da cobertura que seria uma característica desejável para induzir a formação de uma camada de células endoteliais benéfico (ECS) no interior (luminal) da superfície do enxerto vascular 5. A endotélio biomimética é esperado para cumprir muitas das funções de seu equivalente natural, nomeadamente as suas propriedades antitrombogênicas 6. Uma estratégia geral biomimética modificação baseia-se no conceito de dotar exclusivamente com o material de células-adesividade, deixando as propriedades materiais a granel afectada. Além disso, a adesão de plaquetas pode ser reduzida através da incorporação de anti-adesivo (anti-incrustação) 7 atributos. Vários péptidos - principalmente derivados de proteínas da matriz extracelular - foram descritas que aumentam fortemente de adesão celular através da ligação a receptores celulares, que pertence à classe de integrinas 8. O serr exemplo conhecido a este respeito, é o péptido Arg-Gly-Asp (RGD) que interage com a maioria dos tipos de células. Outras sequências de aminoácidos são reconhecidas pelas integrinas exclusivamente expressa em células específicas. Por exemplo, Arg-Glu-Asp-Val (REDV) e Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR), foram encontrados para se ligarem a células endoteliais de uma forma específica 9. Imobilização covalente de tais péptidos foi levada a cabo numa multiplicidade de materiais inerentemente não aderentes, incluindo metais e polímeros 10,11. PTFE poroso, mais precisamente, de PTFE expandido (ePTFE) - juntamente com tereftalato de polietileno (PET) - é o material mais importante para a produção de enxertos vasculares 12. Técnicas físicas estabelecidas para os tratamentos apropriados, tais como a modificação de plasma 13 ou por métodos fotoquímicos 14, está dificultada pelo facto de que as estruturas porosas e / ou tubulares não são prontamente tratáveis ​​no interior dos poros ou o lúmen, respectivamente. química úmidaem PTFE é uma tarefa difícil devido à natureza altamente inerte do polímero contendo fluorin que resiste a ataques mais químicas 15. Neste artigo descrevemos um método relativamente fácil para uma estratégia de modificação covalente. Adaptado a partir de um processo para processar PTFE colável, grupos funcionais foram criados na superfície de materiais que servem como pontos de ancoragem para posterior conjugação de moléculas biologicamente activas.

<table><tbody><tr><td>Folha de PTFE 0.5 mm</td><td>Plástico Cadillac&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Peptídeo REDV</td><td>Genecust</td><td>n/a</td><td>síntese personalizada >95% de pureza</td></tr><tr><td>iso-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34965</td><td></td></tr><tr><td>tetrahidrofurano (THF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>peneira molecular 3 &</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208574</td><td></td></tr><tr><td>sódio metálico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>483745</td><td></td></tr><tr><td>fosfato tamponado salino (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>naftaleno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>147141</td><td></td></tr><tr><td>peróxido de hidrogênio 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95321</td><td></td></tr><tr><td>ácido tricloroacético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>éter diglicidílico de dietilenoglicol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17741</td><td></td></tr><tr><td>diisocianato de hexametileno (HMDI)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>52650</td><td></td></tr><tr><td>Calceína-AM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56496</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>azida de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>placas de 24 poços</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662 160</td><td></td></tr><tr><td>ATR-FTIR espectrofotômetro Nicolet Magna-IR 850</td><td>&nbsp; Microscópio</td> de fluorescência Nicolet <td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Olympus X-70</td><td>Olympus</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>células endoteliais da veia humbilical (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ePTFE enxerto vascular</td><td>Gore</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

wet chemistry and peptide imobilização em polytetrafluoroethylene para melhoria de adesão celular

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Dotando materiais de superfície com propriedades de células-adesivo é uma estratégia comum em pesquisa biomaterial e engenharia de tecidos. Isto é particularmente interessante para os polímeros já aprovados que têm uma utilização de longa data na medicina, pois estes materiais são bem caracterizadas e questões legais relacionadas com a introdução de polímeros sintetizados de novo podem ser evitadas. Politetrafluoroetileno (PTFE) é um dos materiais mais utilizados para a produção de enxertos vasculares, mas o polímero carece de promover a adesão celular características. Endotelização, ou seja, a cobertura completa dos enxertos superfície interior com uma camada confluente de células endoteliais é considerada chave para um desempenho óptimo, principalmente pela redução da trombogenicidade da interface artificial. Este estudo investiga o crescimento de células endoteliais em PTFE modificado com péptido e compara estes resultados com os obtidos no substrato não modificado. Acoplamento com opéptido de adesão celular endotelial Arg-Glu-Asp-Val (REDV) é realizada através da activação do polímero contendo fluorin usando o reagente de naftaleneto de sódio, seguido de passos subsequentes de conjugação. A cultura de células é realizado utilizando Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana (HUVECs) e excelente crescimento celular em material imobilizado-péptido é demonstrada ao longo de um período de duas semanas.

Os resultados dos passos de reacção químicos cruciais foram monitorizadas por espectroscopia de IV (Figura 1). A ativação inicial com naftaleneto de sódio gera ligações duplas - e, em menor medida - OH-funcionalidades. O sinal que indica C = ligações C desaparecer por oxidação, dando origem a uma superfície de rolamento quase exclusivamente grupos hidroxilo. Análise de novos passos de conjugação padrão não são mostradas aqui. As mudanças de cor devido à oxidação de activ...

A adesividade celular é a chave para muitas abordagens na pesquisa de biomateriais e engenharia de tecidos. Uma técnica passo a passo é apresentada usando química úmida para a modificação da superfície do importante polímero PTFE com peptídeos.

Wet Chemistry and Peptide Imobilização em Polytetrafluoroethylene para Melhoria de adesão celular

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um tratamento superficial baseado em química úmida para o polímero carbônico fluorado politetrafluoretileno, ou PTFE. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de biomateriais, como a forma de melhorar a biocompatibilidade de polímeros médicos. A principal vantagem desta técnica é que exige apenas um mínimo de equipamentos e é mais amplamente aplicável em comparação com outros métodos.A preparação da solução de naftaleneto de sódio exige condições rigorosamente anidras. Corte 0,25 gramas de sódio metálico em pequenos pedaços para facilitar a dissolução. Adicione o sódio metálico a uma solução de 1,4 gramas de naftaleno em 20 mililitros de tetrahidrofuran em um frasco de vidro de 100 mililitros com tampa rosqueável, equipado com um agitador magnético revestido com PTFE.Aqueça levemente a solução para melhorar ainda mais a dissolução. A solução final apresenta uma coloração escura, levemente esverdeada, e pode ser armazenada em condições rigorosamente secas. Recorte discos de PTFE de 12 milímetros de diâmetro a partir de folha com espessura de 0,5 milímetro.Marque um lado e limpe com isopropanol. Incube as amostras de PTFE individualmente na solução ativadora por um a dois minutos, utilizando pinça. A mudança de cor de branco para marrom escuro indica tratamento bem-sucedido.Posteriormente, lave duas vezes com THF e, em seguida, com isopropanol. Oxide as amostras tratadas em peróxido de hidrogênio a 30%, contendo ácido tricloroacético a 20%, durante três horas. Lave com água e seque.A superfície agora apresenta uma leve coloração acastanhada. Trate os discos oxidados com 50% HMDI em THF seco durante duas horas. Em seguida, lave com THF e deixe secar.Por fim, hidrolise as amostras contendo isocianato em água por duas a três horas e seque. Coloque cada disco aminado com o lado marcado voltado para cima nos poços individuais de uma placa de 24 poços. Adicione 1,5 mililitro da solução de epóxido, garantindo a cobertura completa das amostras.Após incubação por duas horas, lave duas vezes com água e uma vez com tampão carbonato. Nos fundos de poços individuais de uma placa nova de 24 poços, adicione 50 microlitros de 0,5 miligrama por mililitro de peptídeo e 50 milimolar de tampão carbonato, pH 9, contendo 0,1% de azida de sódio. Coloque cuidadosamente os discos funcionalizados com epóxi virados para baixo sobre as gotas da solução de peptídeo.Certifique-se de que o espaço entre o fundo de um poço e o disco de PTFE esteja completamente umedecido devido à ação capilar. Incube a placa por pelo menos três horas, ou durante a noite, em uma câmara úmida com atmosfera umidificada, obtida colocando papel-toalha umedecido no fundo da câmara. Após a incubação, lave três vezes com água e esterilize em água com 50% de isopropanol por pelo menos 30 minutos.Antes da semeadura celular, conforme descrito no protocolo textual, lave as amostras com solução salina tamponada com fosfato estéril. Os resultados das etapas cruciais da reação química foram monitorados por espectroscopia no infravermelho. A ativação inicial com naftalamida de sódio gera ligações duplas e, em menor extensão, funcionalidades hidroxilas.O sinal indicativo de ligações duplas de carbono desaparece após a oxidação, resultando em uma superfície que apresenta quase exclusivamente grupos hidroxila. As mudanças de cor devido à ativação e oxidação estão de acordo com a química esperada. Sistemas de ligações duplas conjugadas tendem a ser acastanhados, e a perda desses sistemas resulta em clareamento.Além disso, o possível resultado da ativação e oxidação sobre a morfologia da superfície foi investigado por meio de microscopia eletrônica de varredura. Praticamente nenhum efeito prejudicial do tratamento foi observado. A imobilização do peptídeo adesivo para células endoteliais, arginina, glutamina, ácido aspártico valina, na superfície do polímero, favorece o crescimento de células endoteliais.Enquanto praticamente nenhuma adesão e proliferação celulares ocorrem em material não tratado, a modificação apoia fortemente a colonização ao longo de um período de duas semanas. Exemplificado para uma aplicação clínica, a modificação foi realizada de forma idêntica em material original de um enxerto comercialmente disponível feito de politetrafluoroetileno expandido, com resultados semelhantes ao longo de um período de uma semana. Uma vez dominada, esta técnica leva cerca de 12 horas.Deve-se ter em mente que este procedimento é específico para PTFE. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender bem como ativar a superfície do PTFE e como imobilizar peptídeos em etapas subsequentes. Após este procedimento, outras moléculas, como polissacarídeos ou fatores de cordão, podem ser imobilizadas de maneira semelhante.Esteja ciente de que trabalhar com produtos químicos altamente tóxicos e corrosivos é perigoso, e que precauções padrão devem ser adotadas.

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Preparação de Thermoresponsive nanoestruturados Surfaces para Engenharia de Tecidos

A eletroforese capilar em solução livre é um método analítico rápido, barato e robusto que permite o monitoramento quantitativo de reações químicas em tempo real. Sua utilidade para análise rápida, conveniente e precisa é demonstrada aqui através da análise de enxerto de peptídeo covalente em filmes de quitosana para melhorar a adesão celular.

Eletroforese Capilar para monitorar Peptide Enxertia em quitosana Films em Tempo real

Diferentes métodos para manipular a arquitetura tridimensional em hidrogel à base de proteínas são avaliados aqui com respeito a propriedades do material. As redes se são acrescidas com um peptídeo de célula-adesivo, e sua viabilidade na cultura de pilha é avaliada usando duas linhas de células de modelo diferente.

Fácil manipulação das arquiteturas em hidrogel à base de proteínas para aplicações de cultura de células

Neste método, utilizamos a fotopolimerização e técnicas de química clique para criar padrões de proteína ou peptídeo na superfície de hidrogel de polietileno glicol (PEG), fornecendo imobilizada sinais bioativos para o estudo da resposta celular em vitro .

Padronização bioativas proteínas ou peptídeos em hidrogel usando fotoquímica para aplicações biológicas

Apresentado aqui é um protocolo para anexar peptídeo CD47 (pepCD47) a stents metálicos usando química polifosfosfonato. A funcionalidade dos stents metálicos utilizando pepCD47 impede o apego e ativação de células inflamatórias, melhorando assim sua biocompatibilidade.

Mitigação do apego de células transmitidas sanguíneas a implantes metálicos através da imobilização de peptídeos derivados do CD47

Este protocolo apresenta os procedimentos experimentais para realizar o ensaio da pegada de adesão para a imagem dos eventos de adesão durante a adesão rápida ao rolamento celular.

A adesão molecular de imagem em rolamento celular por ensaio de pegada de adesão

A litografia quase UV e a microscopia de força de tração são combinadas para medir forças celulares em hidrogéis micropatterados. A liberação induzida por luz direcionada de células únicas permite um alto número de medições na mesma amostra.

Controle da adesão celular usando técnicas de padronização de hidrogel para aplicações em microscopia de força de tração

Este protocolo descreve a síntese de peptídeos cíclicos penetrantes em células com ligações cruzadas aromáticas e a avaliação de sua permeabilidade através de barreiras biológicas.

Construção de Peptídeos Cíclicos Penetrantes em Células para Maior Penetração de Barreiras Biológicas

Este protocolo tem como objetivo avaliar peptídeos biofuncionais de automontagem quanto à adesão celular, morfologia organoide e expressão gênica por imunocoloração. Usaremos uma linha celular de câncer colorretal para fornecer uma maneira econômica de obter organoides para testes intensivos.

Fabricação e caracterização de organoides de câncer colorretal da linha celular SW1222 em matriz peptídica de automontagem ultracurta

Este protocolo apresenta três métodos de preparação rápidos e simples que utilizam condições ambientais para desencadear a automontagem de peptídeos em hidrogéis. Além disso, a caracterização de hidrogéis peptídicos é descrita, demonstrando que hidrogéis peptídicos mecanicamente estáveis podem ser formados sob essas condições diretas.

Preparação de hidrogéis de peptídeos automontados mecanicamente estáveis

Aprenda a modificar superfícies de PTFE por química úmida para melhorar biocompatibilidade em biomateriais médicos. Este método simplificado requer equipamento mínimo e pode ser aplicado em engenharia de tecidos.

Wet Chemistry and Peptide Imobilização em Polytetrafluoroethylene para Melhoria de adesão celular

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