A-alta conteúdo In Vitro Replicação plataforma de descoberta de células-β das ilhotas pancreáticas

desafios críticos para o campo de pesquisa do diabetes estão a compreender os mecanismos moleculares que regulam a replicação de células β dos ilhéus e desenvolver métodos para estimular a regeneração de células-β. Aqui um método de alto teor de rastreio para identificar e avaliar a actividade de promoção da replicação de células β de moléculas pequenas é apresentada.

O objetivo geral desta plataforma de triagem de replicação de células beta de alto conteúdo é facilitar a investigação das vias moleculares que restringem o crescimento de células beta. Este método pode ajudar a responder a questões importantes no campo da biologia celular beta. Como uma das principais moléculas e vias de sinalização que controlam a regeneração das células beta.

As principais vantagens desta técnica são que ela permite aumentar o rendimento da célula de revestimento para uma avaliação específica e o analista de dados automatizado de uma replicação de célula de ilhota primária. O emprego dessa técnica tem o potencial de se estender ao desenvolvimento da terapia regenerativa para diabetes. Uma doença com grande custo econômico e de saúde para nossa sociedade.

Comece usando uma seringa de 10 mililitros carregada com solução digestiva pancreática equipada com uma agulha de calibre 22 para chemular o ducto colédoco na junção dos ductos hepáticos cístico e comum ou apenas distal a ela. Apoiando o ducto biliar comum com um cabo de bisturi, injete lentamente 10 mililitros da solução. Depois que toda a colagenase foi administrada, usou uma pinça curva e uma tesoura para separar o pâncreas inflado do cólon descendente, intestinos, estômago e estria.

Em seguida, coloque até dois pancreatas em um tubo de 50 mililitros no gelo contendo cinco mililitros de solução de digestão pancreática. Quando todo o pâncreas tiver sido coletado, coloque os tubos de digestão em banho-maria a 37 graus Celsius por 15 minutos com um giro suave a cada três minutos. No final da digestão, agite vigorosamente os tubos verticalmente 10 vezes.

E adicione 10 mililitros de tampões de lavagem a frio às amostras. Agite vigorosamente os tubos mais cinco vezes e coloque-os no gelo. Em seguida, encha os tubos até um volume final de 50 mililitros com tampão de lavagem a frio e inverta os tubos cinco vezes.

Em seguida, gire os tecidos e despeje os sobrenadantes, tomando cuidado para não desalojar os pellets. Ressuspenda a pasta de tecido em 25 mililitros de tampão de lavagem seguido de vórtice suave. Repita as etapas de centrifugação e ressuspensão mais duas vezes.

Despeje as suspensões de tecido através de uma peneira de tecido de 30 malhas em um béquer estéril de 250 mililitros. Enxágue os tubos de digestão com mais 20 mililitros de tampão de lavagem e despeje as lavagens na malha para remover os tecidos pancreáticos e adiposos não digeridos. Divida o material filtrado entre dois novos tubos de 50 mililitros e peletize o tecido por centrifugação.

Em seguida, transvase o sobrenadante e inverta os tubos para drenar o excesso de tampão. Para purificar as ilhotas, adicione 20 mililitros de gradiente de densidade fria aos grânulos de tecido pancreático e pipete suavemente para cima e para baixo cinco vezes para ressuspender homogeneamente o conteúdo. Em seguida, sobreponha lentamente 10 mililitros de HBSS na parede de cada tubo de gradiente, tomando cuidado para manter uma interface líquida nítida e separar as células pancreáticas por centrifugação.

Use uma pipeta de 10 mililitros para transferir a camada de ilhotas da interface para novos tubos cônicos de 50 mililitros. Em seguida, lave as ilhotas em 40 a 50 mililitros de tampão de lavagem três vezes. Invertendo seus tubos para ressuspender os pellets entre cada centrifugação.

Após a lavagem final, coloque os tubos em uma capa de cultura de tecidos. Aspire o sobrenadante. E ressuspenda os pellets em seis mililitros de meio de ilhota.

Peneire as ilhotas de cada tubo em poços individuais de seis poços de placa de cultura de tecidos. E gire o prato para coletar as ilhotas no meio dos poços. Avalie a pureza das ilhotas ao microscópio.

Para purificar ainda mais as ilhotas, colete-as usando uma pipeta de um mililitro e transfira para o poço adjacente usando seis mililitros de meio de ilhota. Repita o giro das ilhotas, a coleta, a transferência e a avaliação microscópica até que mais de 90% de pureza seja alcançada. Em seguida, transfira as ilhotas para uma única placa de cultura de tecidos de 10 centímetros contendo 20 mililitros de meio de ilhota.

Depois que todas as ilhotas forem colhidas, coloque a placa de cultura em uma incubadora de cultura de tecidos durante a noite. Em seguida, cubra os poços de uma placa de 384 poços com 40 microlitros de 804G, meio condicionado por poço e coloque a placa na incubadora durante a noite. No dia seguinte, use um raspador de células para separar suavemente as ilhotas.

Em seguida, transfira as ilhotas para um tubo de 50 mililitros. Recolha os ilhéus por centrifugação. Em seguida, lave-os com 20 mililitros de p, b, s quente.

Centrifugue por um minuto. Aspire o sobrenadante. E ressuspenda o pellet em zero vírgula dois, cinco por cento de tripsina.

Incube as ilhotas por 10 minutos a 37 graus Celsius usando uma pipeta de um mililitro para aspirar e dispensar as ilhotas 10 vezes em cinco e 10 minutos. Após a segunda triteração, contar uma amostra de 20 microlitros das células das ilhotas tripsinizadas. Se os tecidos forem totalmente digeridos, suspenda as células dissociativas das ilhotas em quatro vírgulas cinco vezes dez elevado à concentração de quatro células por mililitro no meio de função das ilhotas.

Em seguida, use um aspirador coletor de 12 poços para remover o meio de condição 804G da placa de 384 poços previamente preparada. E peneire 70 microlitros de ilhotas por poço nas fileiras c a n nas colunas quatro a 21. Deixe as ilhotas aderirem na incubadora de cultura de tecidos por 48 horas.

Após dois dias, use o aspirador coletor de 12 poços para remover cuidadosamente o meio da ilhota e use uma pipeta de 12 canais para adicionar 35 microlitros de meio de função da ilhota a cada poço. Em seguida, transfira 35 microlitros das duas soluções compostas recém-preparadas de interesse para cada poço. E devolva as ilhotas à incubadora por mais 48 horas.

Após 48 horas, fixe, core e analise as culturas de ilhotas tratadas com composto usando uma plataforma automatizada de imagem de alto conteúdo. Em um experimento típico, a taxa de replicação das células beta DAPI, PD-1 e insulina positiva é determinada pela porcentagem de células beta que co-expressam Ki-67. A replicação de células alfa é medida como a porcentagem de células DAPI positivas, PD negativas, Glucagon positivas, Ki-67 que co-expressam.

Por exemplo, neste experimento representativo, observou-se que o Dipryridamole promove a replicação de células beta, mas não alfa. Esta técnica pode ser concluída em sete dias. Após este procedimento, compostos que na replicação das células beta podem ser estudados mais a fundo para revelar os mecanismos de ação.

Essa técnica tem possibilitado que pesquisas no campo da biologia celular beta identifiquem novos fatores e vias de sinalização que regulam o crescimento das células beta. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como testar a capacidade de pequenas moléculas de estimular seletivamente a regeneração de células beta.