Estudar o papel dos macrófagos alveolares em câncer de mama metastático

Aqui descrevemos o modelo e a abordagem para estudar as funções dos macrófagos alveolares pulmonares na metástase do câncer. Para demonstrar o papel dessas células na metástase, foi utilizado o modelo singênico (4T1) de câncer de mama em conjunto com a depleção de macrófagos alveolares com lipossomas de clodronatos.

O objetivo geral desses experimentos é determinar o papel dos macrófagos alveolares pulmonares na metástase do câncer usando um modelo singenaico de câncer de mama. Este método pode responder a algumas das questões-chave nos campos de imunologia tumoral e metástase de câncer, como por que os pulmões são um dos alvos mais comuns são as metástases hepatogênicas do câncer. A principal vantagem deste método é que ele usa um modelo de câncer de mama muito bem estabelecido com método muito específico dos micrófagos alveolares pulmioários.

Demonstrando este procedimento estará Surya Kumari Vadrevu, um pesquisador associado em meu laboratório. No dia da injeção de células tumorais, primeiro coloque um camundongo raspado e anestesiado em uma almofada cirúrgica. Em seguida, aspire uma vez 10 até a quinta célula tumoral em 100 microlitros de PBS em uma seringa de insulina de cinco mililitros de ponto zero equipada com uma agulha de calibre 29.

Em seguida, use o polegar e o indicador para levantar a pele perto do segundo e terceiro mamilo e insira a agulha sob a pele na almofada de gordura mamária logo abaixo do terceiro mamilo. Lentamente, injete subcutaneamente as células para formar uma bolha sob a pele e devolva o animal à sua gaiola com monitoramento até que esteja totalmente recuperado. Quatro a cinco dias após a inoculação, para medir os tumores, palpagt o local do tumor e use um paquímetro para usar os diâmetros maior e menor dos tumores para determinar o volume do tumor.

Para obter imagens das células 41GFP injetadas, coloque o camundongo anestesiado em um estágio móvel dentro do gerador de imagens e obtenha imagens do local do tumor por microscopia de fluorescência. Em um gabinete de biossegurança de fluxo de ar laminer, seis dias após a injeção de células tumorais, vórtice os lipossomas para distribuir uniformemente as partículas e aspirar 60 microlitros da suspensão em uma ponta de pipeta estéril. Coloque a ponta perto da narina do animal inoculado com tumor anestesiado e libere lentamente cinco microlitros da solução do lipossomo, permitindo que o camundongo inale a gota.

É fundamental administrar a solução de lipossomas lentamente, mantendo o nível adequado de anestesia para permitir que o animal respire regularmente durante o parto. Quando todos os 60 microlitros tiverem sido administrados, permita que o camundongo se recupere totalmente e devolva o animal à sua gaiola. Para contar e pontuar as metástases da superfície pulmonar, coloque os pulmões sob o microscópio de dissecção e concentre a objetiva até que uma visão clara da superfície pulmonar seja obtida.

Em seguida, conte manualmente as metassoses nos lados anterior e posterior de ambos os pulmões e obtenha imagens dos tumores por microscopia de fluorescência. Depois de contar e visualizar as metástases, use tesouras cirúrgicas e fórceps para picar o pulmão e transfira os pedaços de tecido para um tubo cônico de 15 mililitros contendo três mililitros de tampão de digestão. Teste os fragmentos em um agitador rotativo em uma incubadora a 37 graus Celsius por 40 minutos e, em seguida, tritere a pasta para dissociar o tecido.

Em seguida, filtre a suspensão de tecido através de um filtro de 40 mícrons para remover quaisquer aglomerados, pressionando os pedaços maiores através do filtro com um êmbolo de seringa, conforme necessário. Quando uma suspensão unicelular for alcançada, colete as células por centrifugação e lise os glóbulos vermelhos com tampão ACK por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave o pellet duas vezes em oito mililitros de RPMI.

Após a segunda centrifugação, suspendemos as células em três mililitros de meio RPMI completo para contagem e giramos as células novamente. Agora dilua as células para uma vez 10 elevado à sexta célula por 100 microlitros de concentração de tampão FAX e transfira elócitos de 100 microlitros de células para poços individuais de uma placa de 96 poços com fundo em V. Colete as células no fundo dos poços por centrifugação e, em seguida, vire a placa para deixar o tampão escorrer.

Bloqueie as células com 100 microlitros de bloco CD16 CD32 FC por 15 minutos a quatro graus Celsius e centralize a placa novamente. Em seguida, vire a placa para remover o sobrenadante, como acabamos de demonstrar, e adicione o coquetel de anticorpos de interesse aos poços apropriados. Após 30 minutos a quatro graus Celsius, pulverize as células por centrifugação, seguida de uma lavagem com 200 microlitros de tampão FAX.

Em seguida, ressuspenda os pellets em 200 microlitros de PBS fresco e core as amostras com corante de viabilidade por 20 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave as células em mais 200 microlitros de PBS e fixe as amostras em 100 microlitros de paraformaldeído a um por cento para armazenamento a quatro graus Celsius. Imediatamente antes da sua análise, transferir as suspensões celulares para tubos de citometria de fluxo de polipropileno.

A injeção de células tumorais 4T1GFP na almofada de gordura mamária leva à formação de tumores de camundongos que recapitulam a disseminação metastática do câncer de mama humano, como evidenciado pelas metástases de formação rápida observadas nos pulmões. A transfecção estável de células 4T1 com GFP facilita o rastreamento de células tumorais metastizantes e a quantificação da carga metastática. A hastologia de rotina, em conjunto com algoritmos de patologia digital, também fornece uma boa ferramenta para quantificar e verificar metástases.

Além disso, a análise cicométrica de fluxo multicolorida permite a caracterização até mesmo de populações de células raras, como macrófagos alveolares CD11b negativos, CD11c F80 positivos. A depleção do biclotrenato pode ser confirmada pela ausência dessas células CD11c F480 positivas nos pulmões dissociados de animais tratados com lipossomas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como injetar células tumorais na almofada de gordura mamária, monitorar o crescimento e metástase do tumor e esgotar os macrófagos alveolares e preparar as células pulmonares para análise cicométrica de fluxo.