Ensaiar comportamentos alimentares predadores em Pristionchus E outros nematóides

O objetivo geral desses procedimentos é analisar de forma confiável comportamentos alimentares complexos em nematóides predadores usando vários novos ensaios. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia comportamental, como a regulação de novos comportamentos complexos e, de fato, também a evolução. As principais vantagens dessas técnicas é que elas fornecem métodos rápidos e facilmente repetidos, a fim de observar e quantificar comportamentos alimentares predatórios em nematóides, incluindo o organismo modelo satélite, Pristionchus pacificus.

Para visualizar as morfologias da boca do nematóide, primeiro imobilize os vermes com um tratamento anestésico suave em uma almofada de 2% de agarose recém-feita. Para fazer uma almofada, adicione cuidadosamente 10 microlitros de uma solução de azida de sódio a 10% a três mililitros de agarose derretida e misture bem. A azida sódica é reativa e tóxica, portanto, tome as devidas precauções.

Em seguida, coloque pelo menos 300 microlitros da mistura no meio de uma lâmina de microscópio de vidro padrão e use outra lâmina para achatar a agarose. Deixe a corrediça superior na posição até que a almofada esteja prestes a ser usada. Para preparar a almofada para uso, remova a corrediça superior e adicione uma gota de M9. Em seguida, pegue duas ou três minhocas, coloque-as na gota e aplique cuidadosamente uma lamínula.

Observe os vermes com óptica Nomarski 63x para categorizar suas identidades de morfologia. Um dente dorsal aumentado, um dente subventral adicional ou uma abertura boca larga aumentada são características de um animal euriestomatoso. Considerando que um único dente dorsal e uma abertura bucal mais estreita indicam um animal estenostomatoso.

Dentro de cinco minutos, remova os nematóides da almofada anestésica. Deslize suavemente a lamínula e transfira-a para uma nova placa MGM. Espere até que eles mostrem um comportamento móvel antes de qualquer análise adicional.

Com mais experiência, o morfo pode ser testado sem tratamento anestésico. Transfira 10 a 20 nematóides de uma placa de cultura padrão para uma placa fresca semeada com um gramado bacteriano de OP50 para fenotipagem rápida da forma bucal usando um microscópio estéreo com alta ampliação. Em seguida, detecte diferenças no tamanho e largura da boca.

Nessa ampliação, nenhuma estrutura semelhante a um dente é observável, portanto, identifique os morfos da boca com base em suas larguras. Assim, distinga bocas largas de bocas estreitas. Faça as placas de ensaio cultivando uma grande quantidade de larvas de nematóides de presas selecionadas, como C.elegans em estágio larval ou uma presa ecologicamente relevante apropriada.

Deixe quatro ou mais placas de presas morrerem de fome para coletar as larvas L1. Posteriormente, lave as placas com M9 e passe a coleta por dois filtros de 20 mícrons. Apenas as pequenas larvas devem permanecer na solução.

Pellet as larvas a 377 g por um minuto. Remover o sobrenadante M9 para um copo de resíduos e retirar uma alíquota de três microlitros de pellet de minhoca puro. Deposite os vermes no centro de uma placa MGM de seis centímetros sem E.coli e deixe-os se espalhar por cerca de meia hora.

Mais tarde, use as larvas para o ensaio de mordida. Transfira os predadores para a placa de ensaio com o mínimo possível de bactérias OP50. Para P.pacificus, adicione cinco predadores ao prato.

Aguarde 15 minutos para permitir que os animais transferidos se recuperem do estresse. Após 15 minutos, os vermes devem se mover normalmente ou podem ter sido danificados. Agora observe e registre eventos distintos de um dos predadores por 10 minutos.

A mordida é caracterizada pelo predador restringindo o movimento da presa. A morte ocorre quando a cutícula da presa está aberta. A alimentação é caracterizada por um consumo observável das entranhas da presa.

Observe pelo menos 10 nematóides predadores individuais para garantir a precisão. O bombeamento faríngeo e o movimento dentário podem ser observados sob a óptica Nomarski com ampliação de 40 a 63x e registrados com uma câmera de alta velocidade a 50 hertz. Depois de gravar clipes de 15 segundos de pelo menos 20 animais, os vídeos podem ser analisados de forma confiável.

O bombeamento é observado no corpo, localizado no meio da faringe. O movimento dentário é detectável na abertura da boca e só é observado a partir do dente dorsal. Após duas horas de predação, examine o prato em busca de cadáveres vazios.

Identifique os cadáveres por sua ausência de motilidade e defeitos morfológicos óbvios, incluindo vazamento de vísceras ou fragmentos de vermes ausentes. Após a identificação bem-sucedida da morfologia bucal apropriada em P. pacificus, foram observadas diferenças claras entre os animais eurystomatous e estenostomatoso. Apenas animais euristomatosos se envolveram em comportamento de matança.

Além disso, as diferenças na atividade dentária e no bombeamento faríngeo de animais euristamatosos em bactérias e presas também são evidentes. Durante a alimentação predatória, a taxa de bombeamento é reduzida abaixo da observada durante a alimentação bacteriana e o movimento dentário é uniforme com o bombeamento faríngeo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como combinar esses diferentes ensaios para caracterizar comportamentos alimentares predatórios complexos em nematóides, incluindo no organismo modelo satélite Pristionchus pacificus.