Do gânglio espiral Neuron Explant Cultura e Eletrofisiologia em multi-eléctrodos Arrays

Apresentamos um protocolo para cultivar explantes primários de neurônios do gânglio espiral murino em matrizes de múltiplos eletrodos para estudar perfis de resposta neuronal e otimizar parâmetros de estimulação. Tais estudos visam melhorar a interface neurônio-eletrodo do implante coclear para beneficiar a audição dos pacientes, bem como o consumo de energia do dispositivo.

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como cultivar e registrar a atividade eletrofisiológica de neurônios auditivos em matrizes de múltiplos eletrodos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa auditiva, como caracterizar a propriedade eletrofisiológica dos neurônios auditivos e a estimulação pelas áreas dos eletrodos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o registro simultâneo extracelular não invasivo da atividade neuronal de um grande número de neurônios auditivos.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia. Na verdade, eles podem ser usados para implementar a interface de eletroneurônios de suas próteses, como o implante coclear, para restaurar a audição em pacientes surdos. Para iniciar este procedimento, prepare a solução de revestimento ECM descongelando primeiro a mistura ECM no gelo.

Em seguida, diluir a mistura de ECM em meio de cultura básico na proporção de um para 10 e armazená-la no gelo. Para novos MEAs em uma capela de fluxo laminar, mergulhe-os em etanol a 70% por 30 segundos. Em seguida, lave-os com água destilada por 30 segundos.

Em seguida, deixe os MEAs secarem por 30 minutos. Para revestir os MEAs, pipete 50 microlitros de solução de revestimento sobre os MEAs com uma ponta de pipeta fria de 200 microlitros. Em seguida, deixe os MEAs durarem de 30 minutos a uma hora em temperatura ambiente.

Depois disso, remova a solução de revestimento. Adicione 100 microlitros de meio de cultura suplementado com 10% de FBS e cinco nanogramas por mililitro de BDNF e deixe em temperatura ambiente até o revestimento do tecido. Em seguida, coloque a placa de Petri contendo os MEAs revestidos em uma placa de Petri grande e adicione uma pequena placa de Petri contendo PBS para umidificação.

Neste procedimento, esterilize a cabeça do filhote com etanol 70%. Em seguida, corte a conexão entre a pele e o crânio ao longo da linha sagital. Em seguida, corte o crânio sagitalmente e remova o cérebro.

Depois disso, corte os ossos temporais do crânio e coloque-os em uma placa de Petri contendo HBSS estéril e gelado. Sob um microscópio de dissecação, disseque a bolha timpânica usando um par de pinças finas e isole o ouvido interno. Em seguida, remova o osso da cóclea.

Em seguida, remova o ligamento espiral e o SV juntos, segurando a porção basal do gânglio espiral e o SV com uma pinça e desenrolando lentamente o SV da base ao ápice. Separe o órgão de Corti do gânglio espiral no modíolo, segurando a porção basal do gânglio espiral e o órgão de Corti com uma pinça e desenrolando lentamente o órgão de Corti da base ao ápice. Em seguida, corte os explantes laterais do gânglio espiral usando uma pinça ou tesoura ou faca de microdissecação fina.

Agora transfira os explantes de gânglios espirais e o órgão de Corti para o MEA. Em seguida, coloque os explantes SG sobre a área do eletrodo e o órgão de Corti a aproximadamente cinco milímetros de distância da área do eletrodo. Coloque os explantes e o órgão de Corti nos MEAs, evitando danos ao tecido.

Em seguida, coloque os MEAs cuidadosamente na incubadora e cultive a 37 graus Celsius e 5%CO2. No dia seguinte, inspecione visualmente os explantes quanto à sua ligação aos MEAs. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio de cultura contendo 10% de FBS e BDNF diariamente por cinco dias consecutivos.

No sexto dia, adicione dois mililitros de meio de cultura contendo 10% de FBS e cinco nanogramas por mililitro de BDNF e cultive o tecido por mais 13 dias. Após 18 dias coletivos de cultura, lave a cultura MEA com a solução extracelular preparada anteriormente à temperatura ambiente. Em seguida, seque os contatos do chip MEA com um pedaço de tecido e monte os MEAs no suporte MEA.

Por fim, instale o MEA na configuração de gravação. Em seguida, adicione 300 microlitros da solução extracelular e aguarde 10 minutos para permitir que o sistema se estabilize antes de gravar. Agora, registre a atividade espontânea por dois minutos de todos os eletrodos e identifique os eletrodos ativos.

Em seguida, identifique os eletrodos que respondem à estimulação. Para excluir o artefato de estimulação, estimule com o mesmo eletrodo 10 vezes. Se a cultura responder pelo menos oito em cada 10 vezes, pode ser assumida como uma resposta positiva após a estimulação induzida pelo eletrodo.

Para identificar um ruído de fundo, aplique TTX à cultura na concentração de um micromolar para bloquear os canais de sódio dependentes de voltagem e, em seguida, registre por dois minutos. Aqui estão os vestígios das gravações originais de seis dos 63 eletrodos que mostram atividade espontânea e este é o gráfico raster dos seis eletrodos após a detecção de pico. Cada barra representa um potencial de ação.

Esta plotagem raster inclui todos os eletrodos ativos. As atividades são gravadas a partir de 63 eletrodos por dois minutos. Esta figura ilustra que um estímulo bifásico com duração total de 80 microssegundos e amplitude de 80 microamperes foi usado para estimulação de cultura a partir de um eletrodo.

Este exemplo representativo de traços de dados brutos mostra os potenciais de ação, todos sem respostas após a estimulação. E aqui está a cultura do gânglio espiral nos MEAs imuno-corados para o marcador neuronal, TUJ, no final do experimento para visualizar a cobertura neuronal da área do eletrodo. O eletrodo usado para a estimulação é indicado em verde e os eletrodos de resposta são indicados em vermelho.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 50 minutos se executada corretamente. Embora esses métodos possam fornecer informações sobre a eletrofisiologia dos neurônios do gânglio espiral, eles também podem ser aplicados a outros sistemas, como culturas cerebrais ou da medula espinhal. Após o desenvolvimento, esta técnica abre caminho para pesquisadores no campo da ciência dos materiais e nanotecnologia, modificação rápida da superfície de eletrodos de gravação e estimulação neuronal.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar e registrar a atividade eletrofisiológica, organizando um explante de neurônios em matrizes de vários eletrodos.