Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

O objetivo geral deste procedimento é monitorar as funções das células NK usando um ensaio baseado em citometria de fluxo. As células assassinas naturais são cruciais para o resultado de várias infecções virais e doenças malignas. Para monitorar melhor as funções das células NK, nosso laboratório desenvolveu ainda mais um ensaio baseado em citometria de fluxo que pode ser usado tanto em pesquisas científicas quanto em avaliações clínicas.

Otimizamos o protocolo para permitir a análise de pequenos tamanhos de amostras de células NK, o que é essencial para seu uso em pediatria e para pacientes imunodeficientes. Uma vantagem adicional desta técnica é a possibilidade de medir as funções das células NK não apenas em toda a população de células NK, mas também em diferentes subconjuntos de células NK. Para isolar as células NK, comece misturando o volume apropriado de solução de coquetel de isolamento de células NK com seis a 10 mililitros de sangue total periférico EDTA de um paciente por várias inversões.

Em seguida, homogeneizar ainda mais a amostra em um rotador de tubo por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, coloque o tubo em um separador magnético por 15 minutos em condições estéreis, tomando cuidado para que a etiqueta do tubo fique voltada para a parte de trás do ímã para facilitar a visibilidade da linha de separação. No final da separação, transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de 15 mililitros e aumente o volume final para 15 mililitros com meio completo.

Lave as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio completo fresco. Em seguida, conte as células e ajuste o volume para uma concentração de pelo menos duas vezes 10 elevado à quarta célula NK por 100 microlitros em meio completo. Para estimular as células NK isoladas, primeiro misture suavemente pipetando pelo menos cinco vezes e alíquota de 100 microlitros das células nos poços apropriados de uma placa de fundo em V de 96 poços.

Desligue a luz e adicione anticorpo anti-CD107a a cada poço das células NK. Em seguida, misture cuidadosamente uma alíquota de células tumorais K562 em duas vezes 10 elevado ao quarto volume de células por 100 microlitros, pipetando pelo menos cinco vezes e transfira 100 microlitros das células tumorais para cada poço planejado para a estimulação. A pipetagem precisa e a preparação de uma razão alvo efetora um-para-um são de importância fundamental para a avaliação precisa da função das células NK.

Em seguida, adicione IL-2 e IL-15 aos poços de estimulação e misture todos os poços pipetando pelo menos cinco vezes. Incube a placa protegida da luz por três horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a primeira hora com a luz apagada, adicione uma solução inibidora de transporte de proteínas recém-preparada a cada poço com uma mistura cuidadosa e retorne a placa à incubadora.

No final da incubação, misture cuidadosamente as coculturas e transfira-as para os tubos de citometria de fluxo correspondentes. Adicione um mililitro de tampão de lavagem a cada tubo para centrifugação e ressuspenda os pellets em 99 microlitros de PBS mais um microlitro de marcador de células mortas fixável por amostra. Misture as células por vórtice, seguido de uma incubação de 15 minutos em temperatura ambiente no escuro.

No final da incubação, lave as células em um mililitro de tampão de lavagem e ressuspenda os pellets em 84 microlitros de tampão de lavagem mais 16 microlitros do coquetel de anticorpos de superfície celular apropriado. Misture as amostras por vórtice e incube por 20 minutos no escuro a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as células em um mililitro de tampão de lavagem e ressuspenda os pellets em 100 microlitros de uma solução de fixação a frio.

Misture por vórtice, seguido de 10 minutos a quatro graus Celsius no escuro. Agora lave as células em um mililitro de tampão de lavagem e ressuspenda os pellets em 90 microlitros de tampão de permeabilização. Corar com 10 microlitros dos anticorpos intracelulares apropriados e misturar por vórtice.

Após 30 minutos no escuro a quatro graus Celsius, lave as células duas vezes em um mililitro de tampão de permeabilização fresco. Em seguida, ressuspenda as amostras em 400 microlitros de tampão de permeabilização fresco. Misture bem por vórtice e coloque as células no gelo até sua análise por citometria de fluxo.

Transferir o mais rapidamente possível todos os tubos para o citómetro de fluxo e iniciar a aquisição dos dados. Aqui, são ilustradas estratégias de gating para analisar a degranulação e a produção de citocinas e quimiocinas de toda a população de células NK, bem como três subconjuntos diferentes de células NK. As células NK não estimuladas de doadores saudáveis não produziram interferon gama nem MIP-1 beta e não expressam CD107a em sua superfície.

Em contraste, as células NK estimuladas com células tumorais e citocinas produziram quantidades significativas de interferon gama intracelular e MIP-1 beta, com mais de 20% das células demonstrando degranulação na interação com células tumorais, conforme indicado por sua expressão na superfície celular CD107a. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em oito horas. Ao tentar este procedimento, é importante ser preciso no plaqueamento das células NK e células tumorais K562.

Para manter a proporção alvo do efetor selecionado, a contagem deve ser a mais precisa possível. Este procedimento flexível pode ser facilmente modificado. Por exemplo, as células NK dentro da população PBMC podem ser analisadas ou diferentes anticorpos podem ser usados para verificar outros marcadores de interesse.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar, estimular e rotular células NK para monitorar sua função usando um ensaio baseado em citometria de fluxo. Não se esqueça de que trabalhar com células humanas e alvo é potencialmente perigoso e que precauções de segurança, como usar o equipamento de proteção individual adequado, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.