Name: Construindo Modelos de Elementos Finitos para investigar Zebrafish Jaw Biomecânica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: Aprenda a construir modelos de elementos finitos para analisar a biomecânica da mandíbula de Danio rerio. Este método computacional simula cargas mecânicas e revela padrões de desenvolvimento esquelético em organismos modelos.

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LHB foi financiado pelo programa celular PhD Wellcome Trust dinâmico; KAR foi financiado pela subvenção de projecto MRC MR / L002566 / 1 (atribuído a EJR e CLH) e CLH foi financiado pela áruk concessão 19479. Também gostaríamos de agradecer a facilidade Wolfson BioImaging para o conselho de imagem.

Todos os passos dentro do protocolo de seguir a Universidade de cuidados com os animais de Bristol e diretrizes de bem-estar e os do UK Home Office. 1. Visualização de Musculoskeletal anatomia NOTA: Para visualizar a forma dos elementos esqueléticos, para quantificar muscular e para identificar o posicionamento exato dos anexos musculares, imunocoloração (seção 1.1) peixes na idade apropriada para a miosina esquelético (que revela muscular) e colágeno tipo II (para visualizar cartilagem). Alternativamente, visualizar a anatomia do músculo-esquelético usando linhas repórter fluorescentes transgênicos, como o colágeno repórter a1 COL2A1: mCherry 13,14 para visualizar a cartilagem eo lento miosina de cadeia pesada smyhc repórter: GFP 15 para visualizar a posição de anexos musculares (ponto 1.2). linhas alternativas que marcam cartilagem e músculo poderia funcionar igualmente bem. <ol><li> fluorescente Immunostaining <ol><li> Fix larva em excesso de paraformaldeído a 4% (PFA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 1 h. Lavar em PBS com 0,1% de Tween 20 (PBT) e desidratar em 50% de metanol (MeOH) em PBT e MeOH a 100% durante 5 min, respectivamente. Cuidado: PFA é tóxico e deve ser tratado de acordo com a folha de segurança material. NOTA: Larva podem ser armazenados em 100% de MeOH até ser necessário. </li><li> Reidratar larva em 50% de MeOH em PBT durante 5 min. Lavar em PBT durante 5 min. </li><li> Permeabilizar larva em 0,25% de tripsina em PBT em gelo durante 5-6 minutos. Lavar em 4x PBT durante 5 minutos cada. </li><li> Bloquear para 2-3 horas em soro 5% em PBT. </li><li> Incubar larva na diluição recomendada de coelho anti-colagénio do tipo 2 e de ratinho anti-miosina anticorpos no soro a 5% em PBT durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. NOTA: O intervalo de diluição recomendada é normalmente na folha de dados de anticorpos. Escolha anticorpos que são dirigidos contra espécies diferentes entre si e que também são difealugar ao tecido. </li><li> Lave 6x larva por 15 minutos em PBT. </li><li> Bloquear durante 1-2 horas em soro 5% em PBT. </li><li> Incubar em anticorpos secundários no escuro. Use marcado por fluorescência anti-rato (550) e anti-coelho (488) anticorpos secundários para uma diluição adequada em 5% de soro e PBT para o anticorpo específico. </li><li> Lavar 6X por 10 minutos cada em PBT e imagem em um microscópio confocal 10X mais rapidamente possível. </li></ol></li><li> Imagiologia Musculoskeletal Geometry <ol><li> Montar as larvas ventrally em uma lamela em agarose morna 0,3-0,5% de baixo ponto de fusão (LMP) em solução de Danieau 16. NOTA: peixes transgénicos terá de ser sedado em 0,02% MS222 (tricaina metanossulfonato, pH 7) antes da montagem e durante o exame. </li><li> Dê uma pilha de imagens confocal da região de interesse usando a lente objetiva de 10X eo zoom digital de cerca de 2,5 vezes. Preparação de imagens do canal verde e vermelho usando a 488 nm e 561 nm lasers respectivamente. Imagem com uma resolução de 512 x 512 com um intervalo entre os planos z de 1,3 mm e 3 médias de linha. A pilha resultante irá compreender de cerca de 100 fatias z. </li><li> Exportar os dados como uma série tiff. Projecções máximas dos elementos do músculo e da cartilagem a partir de uma larva de peixe-zebra 5dpf são mostrados na Figura 1. </li></ol></li></ol> 2. Gerar uma superfície 3D <ol style="margin-left: 40px;"><li> Escolha um conjunto de dados representativo para cada ponto de tempo em 3, 4 e 5 dpf (escolha após a visualização de múltiplas amostras). </li><li> Abrir 3-dimensional pilha tiff e selecione todos os canais de software de análise. Clique direito sobre o canal de cartilagem e selecione filtro de imagem e suavização: Gaussian (Figura 2B). </li><li> Em vista do projeto com o botão direito na imagem filtrada e selecione &#39;segmentação de imagem &quot;e depois&quot; editar nova etiqueta&#39;. Criar um novo rótulo para cada material, ou seja, cartilagem e jonto. Selecione a região de cartilagem da imagem (Figura 2C, sinal branco, esboço roxo) com a ferramenta varinha mágica. Use a ferramenta pincel para remover o ruído dos contornos. NOTA: Se usando a ferramenta varinha mágica, clique em &quot;Todos os slices &#39;. </li><li> Selecione a região em conjunto com a ferramenta pincel e atribuir a um componente de articulação (Figura 2C, contorno azul) </li><li> várias fatias suaves ao mesmo tempo, selecionando a segmentação no menu superior e etiquetas lisas. Botão direito do mouse na imagem e selecione gerar superfície para produzir uma superfície 3D rendem do componente (Figura 2D). </li><li> Clique na superfície e salvar os dados como um arquivo hmascii para importação para software articulada. </li></ol> 3. Cálculo das Forças músculo a ser utilizado no modelo FE <ol style="margin-left: 40px;"><li> Contar o número de fibras musculares de imagens confocal de smyhc: GFP peixes-zebra transgénicos (Figura 1A, seta, 1C) e medir a diameter das fibras para calcular a área de secção transversal (πr 2). </li><li> Identificar força por unidade de área adequado músculo a partir da literatura. A força muscular máxima gerada por unidade de área para os músculos esqueléticos de peixe-zebra larval (40 nN / ^ m 2) foram utilizados 17. </li><li> Calcular as forças para cada grupo muscular anatómica multiplicando o número de fibras e a sua área pela força por unidade de área. Ver Tabela 1. </li></ol> 4. Gerando uma Malha <ol style="margin-left: 40px;"><li> Importar o modelo 3D gerado na secção 2 (acima) para um pacote de software capaz de gerar uma malha de elementos finitos. </li><li> Gerar A2d malha da cartilagem e superfícies articulares, utilizando a ferramenta envoltório do psiquiatra no menu 2D. Escolha um tamanho de elemento apropriado. Nota: Use um tamanho de elemento entre 1,5-2,5. Se necessário, gerar um intervalo de superfície 2D diferente tamanho malhas para realizar a otimização da malha 3D (Seção 4.4). </li><li> Efectuar controlos de qualidade malha encontradas embaixo dos 2D&gt; Ferramentas&gt; Verificar elementos &quot;painel para verificar se há elementos duplicados, inserções e penetrações na malha. Corrigir ângulos diedros usando a guia utilidade em árvore do modelo. </li><li> Gerar uma malha 3D a partir das malhas de superfície 2D de diferentes tamanho do elemento utilizando o subpainel 3D&gt; Tetramesh. NOTA: Comparar os resultados de diferentes tamanhos de malha e selecione o modelo FE com a malhagem menor que converge após novas simulações e não compromete definição de recurso. O exemplo na Figura 3 contém 1,5 milhões de elementos tetraédricos para as cartilagens de maxilas inferiores e tinha um tamanho de elemento de 2D de 2,0. </li><li> Transformar a malha de modo modelo de mandíbula é escalar como por pilha confocal utilizando a geometria&gt; Distância subpainel. NOTA: Certifique-se a cartilagem e componentes comuns são conectados no modelo através da exportação de um modelo mesclado ou usando laços. </li></ol> 5. Elementos Finitos Model Construção <ol><li> Usando software comercial de elementos finitos (FE), criar um modelo de FE. Usando o músculo e da cartilagem 3D marcado pilhas confocal gerados na secção 1, como um guia, atribuir nós que correspondem aos pontos de fixação do músculo. Criar um vector de entre dois nós que representam a origem e a inserção de cada um dos músculos (Figura 3). </li><li> Criar um coletor de carga do tipo &quot;história&quot; para aplicar um &#39;load C&#39; para cada músculo. Especificar a magnitude em newtons (calculado no passo 3.3) e atribuir o vector associado. A Figura 3 mostra os pontos de fixação para o mandibulae adutor (AM), hyoideus transferidor (PH) e intermandibularis (IM). NOTA: Para estes músculos da mandíbula, força contráctil máxima é distribuído entre a origem e a inserção de modo a que apenas 50% de cada carga é aplicada em cada local. </li><li> Atribuir propriedades do material isotrópico elásticas adequadas conforme determinado pela literatura. Módulo de Young para a cartilagemeo interzona neste modelo foram de 1,1 MPa e 0,25 MPa, respectivamente, e razão de Poisson foi de 0,25 tanto para 18,19. </li><li> Criar um coletor de carga do tipo &#39;limite&#39; para aplicar restrições iniciais do modelo. Vá até a aba Análise&gt; Restrições e no subpainel criar, escolher os nós no modelo que deseja restringir. Selecione os graus de liberdade (DOF) que o movimento limite do modelo para a melhor aproximação da sua área natural de movimento. NOTA: O modelo da Figura 3 foi constrangido em todos os eixos de movimento (DOF: 1, 2, 3 representam X, Y e Z, respectivamente) no ceratohyal para o ancorar no espaço a um ponto médio no modelo e na eixo y e Z no ponto em que o palatoquadrate liga ao resto do crânio peixe-zebra (Figura 3, Tabela 1). O modelo deve ser limitado em todas as três DOF ​​em um nó menos. </li><li> Criar uma &quot;etapa Load &#39;, para cada tipo de movimento que pretende simulcomeu (ou seja, a abertura, fechamento), sob o menu de análise e selecione todas as cargas relevantes (feitas na Seção 5.2) e as restrições (feito na Seção 5.4) para simular o movimento. Selecione &#39;Static&#39; a partir do menu drop-down quando ela aparece. </li><li> modelo de exportação, incluindo os de malha, cargas, restrições e propriedades do material em um formato de arquivo adequado, neste caso formato &quot;.INP&quot;. </li><li> modelo de carga em software de análise de FE. Criar e executar um trabalho para o modelo utilizando o módulo de Job. </li><li> Analisar a saída para o stress, tensão, deslocamento, etc. encontrada na guia resultados e menu de visualização (Figura 4 e 5). </li></ol> 6. Validação de Jaw Deformação / Deslocamento Distâncias <ol><li> Escolha 3-6 Tg (Col2a1aBAC: mCherry) peixes-zebra transgénicos. </li><li> Levemente anestesiar as larvas com 0,02% MS222 até que eles deixam de responder ao toque, mas seu coração ainda está batendo. </li><li> monteas larvas lateralmente (enquanto anestesiado) em lamelas em tépida agarose LMP 1% (composta em solução de Danieau). </li><li> Remova a agarose em torno da cabeça e mandíbula com fórceps. </li><li> Lave solução fresca de Danieau (sem MS222) sobre a cabeça da larva para remover a anestesia utilizando uma pipeta Pasteur até movimentos normais da boca retomada. </li><li> Use um software de captura de filme para tirar de campo brilhante vídeos em alta velocidade de movimentos da boca. Tome filmes de cerca de um minuto de duração na taxa de quadros mais alta, ou suficiente para gravar vários ciclos de abertura da mandíbula. </li><li> Escolha quadros que mostram a mandíbula aberta para o seu deslocamento máximo. Medir a distância entre a ponta anterior da cartilagem de Meckel e a maxila superior (ponta da placa etmóide) em uM. </li><li> Calcular o deslocamento médio de larvas de peixes múltipla. </li><li> Extrai dados de deslocamento a partir do modelo. Use o deslocamento médio calculado em 6,8 a verificar o comportamento de deslocamento do modelo ( <strong&gt; Figura 4). Se o modelo afasta-se, a análise de sensibilidade esperada executar sequencialmente, alterando as propriedades dos materiais e cargas musculares. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para revelar. Alguns dados nas Figuras 3-5 foi reproduzido a partir J.Biomech, 48 (12), Brunt et al., Modelagem de elementos finitos prevê mudanças na forma conjunta e comportamento celular devido à perda de tensão muscular no desenvolvimento da mandíbula, 3112-22. de 2015, com a permissão de Elsevier 15.

Modelos de elementos finitos tenha sido utilizado para relacionar as áreas de elementos esqueléticos que estão sob tensão com aqueles submetidos a formação de osso 10, bem como para mapear as áreas sob tensão durante a ossificação endocondral e morfogénese conjunta 8,12,21. Outros estudos também têm sido capazes de aplicar modelos de crescimento teóricas para replicar as alterações durante o desenvolvimento conjunto 11,12. Aqui nós mostramos o protocolo para a construção de modelos FE para um sistema relativamente simples, a mandíbula zebrafish 20. Ao contrário dos métodos alternativos de recolha de imagens RAW para os modelos FE, como a tomografia computadorizada 22, imagem confocal de linhas transgénicas ou peixe-zebra histoquímica permite múltiplos tecidos a serem estudados. Pode, por conseguinte, proporcionará informação directa sobre os pontos de fixação do músculo em relação à cartilagem. Entre os modelos de vertebrados peixe-zebra são particularmente passíveis de manipulação genética e farmacológica. A geração de modelos FE para peixe-zebracartilagem craniofacial agora abre-se a possibilidade de um estudo mais aprofundado da interação entre biomecânica e genética na morfogênese conjunta. Há um número de etapas críticas para o processo de criação de um modelo de FEC; a primeira é a geração de uma representação tridimensional precisa do sistema. Isso exige de imagem com resolução alta o suficiente para definir claramente as fronteiras. Note-se que, mesmo com imagens de alta resolução para fazer uma boa superfície que se pode ter para suavizar algumas regiões. Outro passo fundamental é definir o posicionamento correto da carga e as restrições corretas. Um modelo insuficientemente restrita irá falhar para resolver e colocação incorrecta das cargas irá causar movimento anormal. Alguns processamento dos dados em bruto (Figura 2) é necessária como uma superfície gerada a partir dos dados brutos seria difícil de malha (Figura 2B). Nós filtrada a dados utilizando um filtro gaussiano (Figura 2C </strong&gt;) e realizamos alguns suavização manual das curvas para produzir um conjunto de linhas limpas que podem ser convertidos em uma superfície 3D. Demasiada suavização pode produzir uma superfície &quot;derreteu&quot; que perdeu muitas das suas características. Escolhendo o tamanho do elemento correto é um processo iterativo que escolher muito pequeno um tamanho de elemento cria muito grande de uma malha que é computacionalmente intensiva. No entanto, a escolha de um tamanho muito grande elemento irá produzir uma malha que falha para recapitular a forma correcta da estrutura. A malha correta tinha o tamanho do elemento menor que capturou a forma correta da mandíbula e convergiram para uma solução correta, verificada por meio do deslocamento da mandíbula. Também pode ser necessário modificar as propriedades do material de carga ou de cálculos para melhor imitar o deslocamento correcto como espécies diferentes idades e terá propriedades substancialmente diferentes. É importante lembrar que sempre existem limitações para um modelo hipotético e umssumptions feitas nos modelos FE. Quando apenas modelar um ou um pequeno número de amostras é essencial para garantir que uma amostra representativa é escolhida como não são susceptíveis de ser pequenas variações entre indivíduos. Uma vez que apenas alguns dos elementos da maxila e os músculos foram incluídos, o modelo é uma versão simplificada do sistema músculo-esquelético craniofacial peixe-zebra. Portanto, as restrições tiveram de ser posicionada para explicar onde os elementos da mandíbula modelados iria se conectar com o resto do crânio e o modelo foi artificialmente restrita no centro de corrigi-lo no &quot;espaço&quot;. Esta restrição artificial não teve impacto sobre a interpretação a partir dos modelos como o ceratohyal em si não foi analisada. A inclusão de mais da estrutura craniofacial, especialmente outros músculos abertura da mandíbula, como os sternohyals e sua cartilagem anexo 23, poderia ter acrescentado ao modelo, mas as limitações incluem a capacidade de modelos maiores para ser executado no software Finite Element. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Outra limitação é que não temos modelada inserção do ligamento, embora isto poderia ser alcançado através da inserção de molas 8. Uma outra suposição feita neste caso foi que o modelo iria se comportar de forma linear. As magnitudes das tensões nos modelos eram comparáveis aos dos modelos publicados e aplicado a células in vitro 10,24, estirpes com estando abaixo de 3500 e -5000 μɛ acima para além de pontos de restrição e de ligação do músculo. Portanto, as estirpes com as regiões relevantes do modelo foram consideradas dentro de um intervalo aceitável para um modelo linear. Cartilagem não se comportam como um material inteiramente linear e foi previamente modelado como um material poroelástico, que permitiu a análise do comportamento de fluido no modelo 25. Espalhando os pontos de fixação muscular entre um conjunto de nós locais iria distribuir as forças de pico e representar com mais precisão a inserção do músculo para determinados músculos. ent &quot;&gt; O uso de FE permite uma avaliação das tensões e pressões que actuam sobre uma estrutura. Como uma técnica que é frequentemente usado em muitas disciplinas biociências incluindo ortopedia, paleontologia e, mais recentemente, biologia do desenvolvimento. Aqui nós descrevemos como construir FE para o peixe-zebra mandíbula inferior. no futuro desses modelos poderia ser alargado a olhar para toda a mandíbula, incluindo o paladar. técnicas similares poderiam ser usados ​​para modelar a biomecânica da coluna vertebral em peixes, que até à data têm sido quase sempre estudadas por meio cinemáticas.

Modelagem de elemento finito (FE) é uma técnica de engenharia que podem computacionalmente calcular e mapear a magnitude ea localização das cepas que actuam sobre uma estrutura 1. O modelo consiste na estrutura 3D, representado por uma malha de &quot;elementos finitos&quot;, e o resultado final da análise é governada por uma série de factores, incluindo a estrutura e o número de elementos na malha, a magnitude e a localização da mecânica cargas e as propriedades do material. As propriedades dos materiais descrevem certos aspectos do comportamento de um material em um determinado tipo de carga; O módulo de Young (E) descreve a elasticidade do material, enquanto que o coeficiente de Poisson descreve o decréscimo proporcional na largura de um material para o seu comprimento, quando uma amostra é alongada. modelagem FE pode ser utilizado para calcular uma variedade de variáveis, incluindo o deslocamento, tensão, pressão e agir pressão sobre o modelo, tendo em conta os dados de entrada originais sobre a estrutura &#39;; S forma, localização e magnitude das cargas e as propriedades dos materiais específicos. Modelagem FE é amplamente utilizado em engenharia 2 e cada vez mais para ortopédicos 3 e paleontológicos aplicações 4. No desenvolvimento de forças biomecânicas são conhecidos por actuarem como um estímulo em muitas células para activar respostas celulares 5-8 e é útil para prever a ambas as posições relativas e as magnitudes de estímulos mecânicos no desenvolvimento de sistemas de órgãos, no entanto, actualmente modelagem Fe tem sido pouco usado para o desenvolvimento do peixe-zebra. Tanto a cartilagem e osso foram mostrados para ser materiais mechanosensitive. Por exemplo, a compressão in vitro tem sido encontrado para activar vias condrogénicas, enquanto que a tensão foi demonstrado ser necessário para a formação óssea 9. FE análise (FEA) tem sido explorada para modelar estirpes agindo em amostras biológicas, incluindo aqueles que agem em elementos esqueléticos durante óssea formação 10. Outras aplicações incluem a sua utilização de desenvolvimento para prever a forma de uma junta depois de ter sido exposto a forças biomecânicas teóricos 11,12 e para mostrar o padrão de estirpes presentes durante a morfogénese do joelho pintainho articulação 8. Este protocolo destina-se a compartilhar a experiência de geração de superfícies em 3 dimensões, malhas e modelos de elementos finitos a partir de imagens confocal, com vista a compreender a mecânica de tecidos em desenvolvimento. Nós também mostram formas de validar os modelos FE embora a captura de informações deslocamento da articulação reais in vivo. Enquanto que utilizar a mandíbula peixe-zebra como um exemplar as mesmas técnicas podem ser utilizadas em qualquer pequeno sistema biológico para o qual a informação sobre a estrutura 3D do sistema músculo-esquelético pode ser obtido por imagem confocal ou multifotônica.

<table><tbody><tr><td>Coll2</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>Anticorpo de colágeno tipo II - mancha toda a cartilagem</td></tr><tr><td>A4.1025 / MF20</td><td>Estudos de desenvolvimento do banco de hibridoma</td><td>A4.1025</td><td>Anticorpo de mysoin esquelético - marca todo o músculo esquelético&nbsp;</td></tr><tr><td>Sigma de agave de baixa fusão</td><td></td><td>A9414-5G</td><td>Para montagem de peixe-zebra</td></tr><tr><td>MS222 (Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato)</td> <td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>Para fazer permeabilização de amostra anestésica</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Fisher</td><td>T/3760/48</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488 Mouse IgG</td><td>Thermofisher</td><td>35502</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Dylight 550 Rabbit IgG</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>84541</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>secundário SP8/SP5 ou SPE confocal</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>Para imagens&nbsp;</td></tr><tr><td>Software de captura LAS Leica</td> Software <td>Leica</td><td></td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Aviso (versão 7.0.0)</td>Software de análise de imagem 3D <td>FEI Visualization Science Group</td><td></td><td>(Seção 2)</td></tr><tr><td>Hypermesh parte do pacote Hyperworks (versão 10)</td><td>Software de geração de modelo Altair Engineering</td><td></td><td></td> FE (Seção 4-5)</tr><tr><td>Abaqus (versão 6.14)</td>Software de análise <td>SIMULIA</td><td></td><td>FE (Seção 5,7-5,8)</td></tr></tbody></table>

construindo modelos de elementos finitos para investigar zebrafish jaw biomecânica

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

A morfogênese esquelética ocorre por meio de comportamentos celulares rigidamente regulados durante o desenvolvimento; muitos tipos de células alteram seu comportamento em resposta à tensão mecânica. As articulações esqueléticas são submetidas a cargas mecânicas dinâmicas. A análise de elementos finitos (FEA) é um método computacional, frequentemente usado em engenharia, que pode prever como um material ou estrutura responderá à entrada mecânica. Ao dividir todo um sistema (neste caso, o esqueleto da mandíbula do peixe-zebra) em uma malha de "elementos finitos" menores, o FEA pode ser usado para calcular a resposta mecânica da estrutura a cargas externas. Os resultados podem ser visualizados de várias maneiras, inclusive como um 'mapa de calor' mostrando a posição das deformações principais máximas e mínimas (uma deformação principal positiva indica tensão, enquanto uma negativa indica compressão. O máximo e o mínimo referem-se à maior e menor cepa). Eles podem ser usados para identificar quais regiões da mandíbula e, portanto, quais células provavelmente estarão sob cargas tensionais ou compressivas particularmente altas durante o movimento da mandíbula e, portanto, podem ser usadas para identificar relações entre a tensão mecânica e o comportamento celular. Este protocolo descreve as etapas para gerar modelos de elementos finitos a partir de dados de imagens confocais no sistema musculoesquelético, usando a mandíbula inferior do peixe-zebra como exemplo prático. O protocolo conduz o leitor através de uma série de etapas: 1) coloração dos componentes musculoesqueléticos, 2) imagem dos componentes musculoesqueléticos, 3) construção de uma superfície tridimensional (3D), 4) geração de uma malha de elementos finitos, 5) resolução da FEA e, finalmente, 6) validação dos resultados por comparação com deslocamentos reais observados nos movimentos da mandíbula do peixe.

Imunocoloração para o músculo (Figura 1A) e da cartilagem (Figura 1B) ou imagiologia de repórteres transgénicos (Figura 1C) permite que a estrutura 3D da mandíbula para ser visualizado, juntamente com a massa muscular associada. Por imagem com uma resolução elevada, foi possível construir um modelo que capta tanto a forma tridimensional da maxila (Figura 2) e a localização e colocação de cargas (Figura 3). Utilizando em deslocamentos vivo pode ser visto através de captura de vídeo de alta velocidade (Figura 4) verificou-se que a amplitude de movimento no modelo foi dentro de um intervalo realista. Os modelos FE uma vez a corrida pode ser usado para exibir uma variedade de dados, tais como estresse (Figura 5A), mínimo e deformação principal máxima (Figura 5B - K). Estes resultados são três-dim<html> ensional modo que o modelo pode ser ampliado para ver padrões finos de detalhes (Figura 5E, 5I) rodado para obter pontos de vista relevantes (Figura 5F, 5G, 5J 5K) e digitalmente seccionados (Figura 5E &#39;, 5E&#39; &#39;, 5I&#39;, 5I &#39;&#39;) para mostrar como os padrões de tensão, deformação ou alteração da pressão ao longo do modelo. Também é possível extrair dados quantitativos a partir do modelo (não representado). Ao verificar o modelo e utilizando as mais precisas as propriedades do material, cargas e malha forma o modelo FE pode ser usado para explorar a melhor estimativa do ambiente mecânico que está sendo experimentado pelas células durante essa janela de desenvolvimento. Os resultados do modelo pode ser directamente comparada com alterações no comportamento celular e a expressão do gene 20. <html> re 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Imagens representativas dos elementos músculo-esqueléticas da mandíbula peixe-zebra em 5 dpf pilhas confocal representativos da mandíbula inferior de larvas 5dpf tudo mostrado com anterior ao início (A) imunocoloração para A4.1025 que mancha toda a miosina esquelético (B) imunocoloração para colágeno Tipo II que marca toda a cartilagem (C) Stack a partir de uma larva viva expressar os repórteres COL2A1 transgênicos: muscular lenta GFP (verde): mCherry cartilagem (vermelho) e smyhc marcação. IA: intermandibularis anterior, PH: transferidor hyoideus, AM: mandibulae adutor, HI: hyoideus inferior, HI: hyoideus superior, CH: sternohyoideus, MC: cartilagem de Meckel, PQ: Palatoquadrate, CH:. Ceratohyal <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> &quot;Fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> Figura 2: Geração de uma superfície 3D a partir de dados confocal Imagens que mostram a transição de dados confocal em uma superfície 3D para o maxilar inferior do peixe-zebra com maior ampliação da região conjunta.. (A) os dados confocal Raw; (B) do conjunto de dados após a aplicação de um filtro de Gauss; (C) esboço filtrada; Superfície (D) 3D. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> Figura 3: malhas representativos mostrando as limitações e vetores de força malhas representativos para uma larva 5 dpf para (A) de fecho e boca.(B) a abertura da boca. Pontos brancos denotar lugares em que o modelo é restritas e em que as dimensões (por exemplo, X e Y ou X, Y e Z). linhas brancas denotam posições musculares, com o vetor de força muscular indicado por setas brancas. Red mostra cartilagem e amarelo da Interzone. Este valor foi modificado a partir do material suplementar publicado anteriormente em Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> Figura 4:. Os testes de sensibilidade FE-modelo simulando o deslocamento da mandíbula no peixe-zebra 5dpf para a cartilagem diferente e Interzone módulos de Young. Mandíbula deslocamento (aberto para fechado em um) está marcado na mandíbula; gravados utilizando a tecla de cor. Cada modelo (A - G) tem uma combinação diferente de cartilagem (C = 1,1, 3,1, ou 6,1 MPa) ou interzona (i = de 0,25, 0,5, 0,75, 1 ou propriedades MPa). Seta preta horizontal destaca o valor do deslocamento da mandíbula na ponta da cartilagem de Meckel (representado pela seta preta vertical). M e N alambiques de vídeos de 5 dpf larvas mostrando mínimos, ou seja, mandíbula fechada (M) e máxima, ou seja, mandíbula totalmente aberta (N) com os dois sobrepostos (o) - linha branca em o representa o deslocamento (de 43 m). Neste caso em relação propriedades de cartilagem de 1,1 com um interzona de 0,25 (A) melhor jogo, os deslocamentos visto em peixes vivos (O). Painéis AL desta figura foram previamente publicados em Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma vers maiores</a>ion desta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> Figura 5: Os dados representativos dos modelos FE simulação FE-modelo de todos os músculos aplicados de 5 dpf larva (A - C).. (A) Von Mises (EMaxmin) (B) tensão mínima Principal (E Min. P, μɛ) (C) deformação principal máxima (E máx. P., μɛ). simulação FE-modelo de cepas máximas e mínimas principais durante a abertura da mandíbula. (D - K): deformação principal máxima (. E Max P., μɛ) em (D) vista mandíbula ventral e (E) visão conjunta ventral (E) mostra a localização das zonas proximal-distal através da cartilagem de Meckel conjunta eo interzona em (e &#39;) e (e&#39; &#39;), respectivamente. (F): de lateralmandíbula vista. (G): Vista lateral da junta. (H - K): tensão mínima Principal (. E Min P, μɛ) em (H) vista mandíbula ventral e (I) ventral visão conjunta. (I) mostra a localização das secções proximal-distal por meio de cartilagem articular de Meckel e INTERZONE em (I &#39;) e (I&#39; &#39;), respectivamente, (J): vista lateral da mandíbula. (K): Vista lateral da junta. Este número foi publicado anteriormente em Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Número de fibras musculares </td><td> Área da fibra muscular (? M 2) </td><td> área grupo muscular (mm2) </td><td> Força (N) </td></tr><tr><td> 5 dpf intermandibularis anterior </td><td> 5 </td><td> 23,8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf transferidor hyoideus </td><td> 6 </td><td> 23,8 </td><td> 142,8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf adutor mandibulae </td><td> 9 </td><td> 23,8 </td><td> 214,2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Quantificação muscular. Calculado forças muscular médio para o Intermandibularis anterior, Adutor mandibulae e transferidor Hyoideus a 5 dpf usando 40 nN / mm 2 (valor por unidade de área tirado de referência 17). (Lorga et al., 2011) (n = 3).

A Análise de Elementos Finitos é uma ferramenta frequentemente usada para investigar o desempenho mecânico de estruturas sob carga. Aqui, aplicamos seu uso para modelar a biomecânica da mandíbula do peixe-zebra.

Construindo Modelos de Elementos Finitos para investigar Zebrafish Jaw Biomecânica

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

O objetivo geral dessa técnica de modelagem é simular o ambiente mecânico ao qual as mandíbulas de peixes-zebra em desenvolvimento estão expostas. Esse método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do sistema músculo-esquelético, como, por exemplo, como os padrões de carga mecânica mudam ao longo do tempo? E como essas cargas estimulam o comportamento celular?A principal vantagem desta técnica é que ela nos permite analisar padrões de expressão gênica e alterações no comportamento celular no contexto do ambiente mecânico. Este método pode fornecer informações sobre o desenvolvimento esquelético. Também pode ser aplicado a qualquer outra estrutura biológica que sofra carga mecânica, como os elementos esqueléticos em vertebrados superiores ou o sistema cardiovascular.De modo geral, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, pois a terminologia e o software pressupõem conhecimentos na área de engenharia. Para visualizar a forma dos elementos esqueléticos, quantificar o músculo e identificar a localização exata das inserções musculares, realize uma imunomarcação no peixe na idade apropriada para miosina esquelética e colágeno tipo II. Primeiro, fixe uma larva de peixe em paraformaldeído 4% em PBS por uma hora.Em seguida, remova o fixador com duas lavagens em PBT. Depois, desidrate a larva em 50% de metanol e PBT durante cinco minutos, seguido por 100% de metanol por cinco minutos. As larvas podem então ser armazenadas em 100% de metanol até o uso.Quando necessário, reidrate a larva em metanol a 50% e PBT por cinco minutos. Em seguida, lave-a em PBT por cinco minutos. Agora, permeabilize a larva com tripsina a 0,25% e PBT em gelo por cinco a seis minutos.Em seguida, lave-o em PBT durante cinco minutos e repita a lavagem com PBT mais três vezes. Antes de aplicar os anticorpos, bloquee a larva por duas a três horas em soro a 5% e PBT. Em seguida, incube a larva na diluição recomendada dos anticorpos anti-colágeno tipo II de coelho e anti-miosina de camundongo, com soro a 5% e PBT.Realize esta incubação por uma hora à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Após a aplicação dos anticorpos primários, lave a larva em PBT um total de seis vezes, com 15 minutos por lavagem. Após as lavagens em PBT, aplique um bloqueio com soro a 5% em PBT por uma ou duas horas.Agora, aplique os anticorpos secundários, mantendo a partir de agora o preparo na escuridão o máximo possível. Use anticorpos secundários marcados com fluorescência anti-rato e anti-coelho em 5% de soro e PBT. Após a aplicação dos anticorpos secundários, lave a larva em PBT seis vezes, durante 10 minutos por lavagem.Toda larva que for corada conforme descrito, ou que expressar marcadores fluorescentes, pode agora ser visualizada usando um microscópio confocal da seguinte maneira. Adquira uma série de imagens confocais da região de interesse utilizando a objetiva de 10x com aproximadamente 2,5x de aumento digital. Excite os canais verde e vermelho utilizando um laser de 488 nanômetros e um laser de 561 nanômetros.Em seguida, adquira imagens de 512 pixels quadrados utilizando um intervalo de plano z de 1,3 micrômetros com três médias de linha. Cerca de 100 seções z preencherão a pilha. Exporte os dados como uma pilha de imagens TIFF.Abra a pilha de imagens TIFF e visualize todos os canais no software apropriado. Clique com o botão direito no canal da cartilagem, selecione ortoslice e crie. Em seguida, clique com o botão direito no canal da cartilagem e selecione Processamento de Imagem, Suavização e Redução de Ruído, selecione o filtro de imagem e ative a suavização gaussiana.No modo de projeto, clique com o botão direito na imagem filtrada e selecione segmentação de imagem, depois edite nova etiqueta. Crie uma nova etiqueta para cada material, como cartilagem e articulação. Em seguida, selecione a região de cartilagem da imagem usando a ferramenta de varinha mágica com a opção todas as fatias ativada, e use a ferramenta de pincel para remover ruídos dos contornos.Em seguida, selecione a região da articulação com a ferramenta pincel e atribua-a ao componente da articulação, repetindo a ação em toda a articulação. Para suavizar vários cortes de uma vez, selecione Segmentação no menu superior e escolha Suavizar rótulos. Então, para produzir uma renderização tridimensional da superfície do componente, clique com o botão direito na imagem e selecione Gerar superfície.Agora, clique na superfície renderizada e salve os dados como um arquivo HMASCII para o software de malhas. A geração de malhas 3D é uma etapa crítica na criação de um bom modelo. É necessário encontrar um equilíbrio entre uma malha que represente a forma real da estrutura que você está tentando modelar, sem incluir tantos detalhes que introduzam elementos problemáticos, como aqueles com ângulos muito pequenos ou muito grandes.Para gerar a malha, importe o modelo 3D para um pacote de software adequado. Para gerar uma malha bidimensional das superfícies da cartilagem e da articulação, utilize a ferramenta shrinkwrap no menu 2D. Escolha um tamanho de elemento entre 1,5 e 2,5.Pode-se criar uma variedade de malhas superficiais de diferentes tamanhos para realizar a otimização da malha 3D. Para garantir que a malha seja contínua entre as superfícies da junção e da cartilagem, quaisquer elementos na borda devem compartilhar nós comuns. Para alcançar isso, remova a superfície interna da junção, deixando um tubo oco.Use a tecla de função F2 para acessar o atalho do menu Excluir Elementos. Selecione os elementos a serem excluídos. Ajuste os nós de contorno para coincidir com a superfície da cartilagem.Use uma combinação das teclas de função F2, F3 e F6 para excluir, mover nós e criar novos elementos, respectivamente. Por fim, duplique a superfície da cartilagem na articulação usando o menu coletor organizar componentes. Use a tecla de função F2 para excluir todos os elementos não articulares.Posteriormente, realize verificações de qualidade acessando o painel Verificar elementos. Verifique a presença de elementos duplicados, inserções e penetrações na malha. Se encontrados, edite-os utilizando a guia Ferramentas.Verifique os ângulos diedros utilizando a guia utilidade encontrada na opção árvore de modelos. Para gerar uma malha 3D a partir das malhas superficiais 2D de tamanhos de elementos diferentes, utilize a ferramenta Tetramesh. Compare diferentes tamanhos de malha e selecione o modelo EF com o menor tamanho de malha que converge após simulações adicionais e que não compromete a definição de características.Em seguida, utilizando a ferramenta Distância, transforme a malha para que o modelo da mandíbula esteja em escala. Certifique-se de que os componentes de cartilagem e articulação estejam conectados no modelo exportando um modelo mesclado ou utilizando vínculos. Em seguida, aplique cargas, restrições e propriedades dos materiais ao modelo de elementos finitos para simular a função da mandíbula.Usando as pilhas confocais marcadas como guia, defina os músculos. Primeiro, atribua nós que correspondam aos pontos de fixação muscular. Em seguida, crie vetores entre os nós que representem a origem e a inserção de cada músculo.Depois que todos os músculos forem definidos, crie um coletor de carga de histórico e aplique uma Cload a cada músculo. Especifique a magnitude em newtons e atribua o vetor associado. Em seguida, atribua propriedades de material isotrópico elástico apropriadas, conforme determinado pela literatura.Em seguida, crie um coletor de cargas de contorno e aplique algumas restrições iniciais ao modelo. Escolha os nós a serem restringidos e selecione um fator de graus de liberdade semelhante à faixa natural de movimento do músculo definido por esses nós. Agora, crie um passo de carga para cada tipo de movimento a ser simulado.No menu de análise, selecione todas as cargas e restrições relevantes para simular o movimento especificado. Em seguida, selecione estático no menu suspenso. Quando pronto, exporte o modelo em um formato de arquivo apropriado, incluindo a malha, cargas, restrições e propriedades do material.Neste caso, o formato INP é escolhido. Em seguida, carregue o modelo no software de análise por elementos finitos. Dentro dele, crie e execute uma tarefa para o modelo, e analise a saída quanto a tensão, deformação, deslocamento e assim por diante.Selecione três a seis larvas de peixe-zebra transgênicas e anestesie levemente as larvas com MS-222 0,02% até que deixem de responder ao toque, mas seus corações ainda estejam batendo. Em seguida, posicione as larvas lateralmente sobre lamínulas em agarose a ponto de fusão baixa a 1%, morna, em solução de Danieau. Depois, remova cuidadosamente a agarose ao redor da cabeça e da mandíbula com pinça.Em seguida, utilizando uma pipeta de Pasteur, lave a cabeça da larva com solução de Danieau fresca para remover o anestésico. Faça isso até que o movimento normal da boca seja restabelecido. Agora, utilize um software de captura de vídeo para gravar vídeos fluorescentes em alta velocidade dos movimentos da boca.Filme na maior taxa de quadros pelo tempo necessário para registrar múltiplos ciclos de abertura da mandíbula. Posteriormente, analise o deslocamento máximo da mandíbula. Escolha os quadros que mostram a mandíbula mais aberta e meça a distância entre a ponta anterior da cartilagem de Meckel e a mandíbula superior.O ponto da mandíbula superior corresponde à ponta da placa etmoidal. A imunomarcação para músculo e cartilagem, ou a aquisição de imagens de repórteres transgênicos, permite a visualização da estrutura tridimensional da mandíbula, juntamente com a musculatura associada. Ao obter imagens com alta resolução, foi possível construir um modelo que captura a forma tridimensional da mandíbula.O modelo incorpora cargas cuja colocação e magnitude foram derivadas das imagens confocais de músculo e cartilagem. A partir desse modelo, uma variedade de propriedades materiais diferentes foi testada. Utilizando o deslocamento in vivo observado por meio da captura de vídeo de alta velocidade, um modelo foi selecionado que melhor replica essa amplitude de movimento.Utilizando as propriedades dos materiais, cargas e dados de geometria da malha mais precisos, o modelo de elementos finitos foi usado para explorar a melhor estimativa do ambiente mecânico experimentado durante este período. Por exemplo, foram medidas as magnitudes da tensão. O modelo pode ser ampliado para visualizar os detalhes finos do padrão e, em seguida, examinado em seções digitais para observar os detalhes em todas as dimensões.Após assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como usar a imagem confocal para construir um modelo tridimensional fisiologicamente preciso de uma estrutura biológica sob carga mecânica. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que este é um modelo linear e elástico, e a cartilagem não se comporta inteiramente como um material linear. Outras propriedades do material, como a permeabilidade, podem ser incorporadas, mas podem exigir modificações adicionais na malha.

building-finite-element-models-to-investigate-zebrafish-jaw

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O peixe-zebra maxilar barbo é um órgão do sentido tegumentar contendo ectodérmica, mesodérmica e derivados da crista neural. Importante, o barbo adulta consegue regenerar após a amputação proximal. Este vídeo apresenta o desenvolvimento barbel maxilar e demonstra um protocolo cirúrgico para induzir a regeneração, seguido por incorporação de coleta, ea jusante de imagens de espécimes barbos.

Métodos para o Estudo do maxilar Zebrafish Barbel

Time-lapse confocal de imagem é uma poderosa técnica útil para caracterizar o desenvolvimento embrionário. Aqui, descrevemos a metodologia e caracterizar morfogênese craniofacial no tipo selvagem, bem como PDGFRA, smad5, e SMO embriões mutantes.

Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal

O embrião de peixe-zebra é um excelente modelo para investigação em biologia do desenvolvimento. Durante a embriogênese, peixe-zebra desenvolver com uma massa de gema, que apresenta desafios tridimensionais para observação de amostras e análise. Este protocolo descreve como criar bidimensionais planas montagem preparações de toda montagem in situ (desejo) manchadas espécimes embrião de peixe-zebra.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

O peixe-zebra é um excelente sistema modelo para estudos genéticos e de desenvolvimento. O implante de contas é uma técnica valiosa de manipulação de tecidos que pode ser usada para interrogar os mecanismos de desenvolvimento, introduzindo alterações nos ambientes celulares locais. Este protocolo descreve como realizar a implantação de microesferas no embrião de peixe-zebra.

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

O objetivo do presente protocolo é alterar a penetrância de letais esqueléticos fenótipos mutantes no zebrafish por reprodução seletiva. Letais mutantes não podem ser cultivados até a idade adulta e se criados, portanto este protocolo descreve um método de controle e selecionando penetrância através de várias gerações por testes de progênie.

Deslocando o Zebrafish letal esquelético mutante penetrância por teste de progênie

Aqui, descrevemos 3 modelos de lesão de zebrafish adultos e seu uso combinado com tratamento de drogas imunossupressoras. Nós fornecemos orientação nas imagens de regenerar tecidos e na detecção de mineralização óssea nele.

Modelos de lesão adulto Zebrafish para estudar os efeitos de prednisolona na regeneração de tecido ósseo

Este protocolo descreve a coleta e visualização de escamas elasmoides de zebrafish durante a regeneração in vivo . Além disso, é apresentado o cultivo ex vivo dessas cochonilhas por até 7 dias após a colheita.

Regeneração de Escamas de Zebrafish em Toto e Cultura Ex Vivo de Escamas

Este protocolo oferece um método para estudar a dinâmica celular usando uma técnica simples de cultura in vitro . Ele oferece uma oportunidade para pesquisadores e educadores de peixes-zebra estudarem processos celulares, como aqueles relacionados à homeostase óssea e biologia celular básica, visualizando núcleos fluorescentes e células apoptóticas dentro das escamas.

Técnica de cultivo in vitro para estudo da dinâmica celular em escamas de peixe-zebra

O protocolo descrito aqui apresenta um procedimento simples e fácil de seguir para coloração e dissecação de cartilagens craniofaciais em uma larva de peixe-zebra com 5 dias de idade. Ele pode ser usado para estudar a anatomia, a forma e o tamanho dessas estruturas sob várias condições de desenvolvimento.

Dissecção de tecidos craniofaciais de peixe-zebra após coloração com azul de Alcian

Este trabalho descreve um protocolo para quantificar a forma da cartilagem craniofacial usando software livre (tpsDigs2, MorphoJ e PAST) para medir mudanças na estrutura facial em larvas de peixe-zebra.

Análises Morfométricas de Forma: A Caixa de Ferramentas de Software de Análise para Quantificação de Formas Craniofaciais em Peixe-Zebra

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