Construindo Modelos de Elementos Finitos para investigar Zebrafish Jaw Biomecânica

O objetivo geral desta técnica de modelagem é simular o ambiente mecânico experimentado pelo desenvolvimento de mandíbulas de peixe-zebra. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo musculoesquelético, como, por exemplo, como os padrões de carga mecânica mudam ao longo do tempo? E como essas cargas estimulam o comportamento celular.

A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite analisar padrões de expressão gênica e mudanças no comportamento celular no contexto do ambiente mecânico. Este método pode fornecer informações sobre o desenvolvimento esquelético. Também pode ser aplicado a qualquer outra estrutura biológica que sofra carga mecânica, como os elementos esqueléticos em vertebrados superiores ou o sistema cardiovascular.

Geralmente, os indivíduos novos nesse método podem ter dificuldades, porque a terminologia e o software pressupõem formação em engenharia. Para visualizar a forma dos elementos esqueléticos, quantificar o músculo e identificar a localização exata dos anexos musculares, imunomarque o peixe na idade apropriada para miosina esquelética e colágeno tipo II. Primeiro, fixe uma larva de peixe em 4% de paraformaldeído e PBS por uma hora.

Em seguida, lave o fixador com duas lavagens PBT. Em seguida, desidrate a larva em 50% de metanol e PBT por cinco minutos, seguido de 100% de metanol por cinco minutos. As larvas podem então ser armazenadas em 100% de metanol até que sejam necessárias.

Quando necessário, reidratar a larva em 50% de metanol e PBT por cinco minutos. Em seguida, lave-o em PBT por cinco minutos. Agora, permeabilize a larva com 0,25% de tripsina e PBT no gelo por cinco a seis minutos.

Em seguida, lave-o em PBT por cinco minutos e repita a lavagem PBT mais três vezes. Antes de aplicar os anticorpos, bloqueie a larva por duas a três horas em soro a 5% e PBT. Em seguida, incube a larva na diluição recomendada de colágeno anti-tipo II de coelho e anticorpos anti-miosina de camundongo com 5% de soro e PBT.

Realize esta incubação por uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Após a aplicação dos anticorpos primários, lave a larva em PBT um total de seis vezes por 15 minutos por lavagem. Após as lavagens do PBT, aplique um soro a 5% e um bloqueio de PBT por uma ou duas horas.

Agora, aplique os anticorpos secundários, mantendo a preparação no escuro o máximo possível. Use anticorpos secundários anti-camundongo e anti-coelho marcados com fluorescência em 5% de soro e PBT. Após a aplicação dos anticorpos secundários, lave a larva em PBT seis vezes por 10 minutos por lavagem.

Qualquer larva que esteja corada conforme descrito, ou expresse marcas fluorescentes, agora pode ser visualizada usando um microscópio confocal da seguinte maneira. Pegue uma pilha de imagens confocais da região de interesse usando a lente objetiva de 10x com zoom digital de cerca de 2,5x. Excite o canal verde e vermelho usando um laser de 488 nanômetros e um laser de 561 nanômetros.

Em seguida, tire imagens de 512 pixels quadrados usando um intervalo de plano z de 1,3 mícrons com médias de três linhas. Cerca de 100 seções z preencherão a pilha. Exporte os dados como uma pilha de imagens TIFF.

Abra a pilha de imagens TIFF e visualize todos os canais no software apropriado. Clique com o botão direito do mouse no canal da cartilagem, selecione ortosslice e crie. Em seguida, clique com o botão direito do mouse no canal de cartilagem e selecione Processamento de imagem, suavização e redução de ruído, selecione o filtro de imagem e alterne a suavização gaussiana.

Na visualização do projeto, clique com o botão direito do mouse na imagem filtrada e selecione segmentação de imagem e, em seguida, edite o novo rótulo. Crie um novo rótulo para cada material, como cartilagem e articulação. Em seguida, selecione a região da cartilagem da imagem usando a ferramenta varinha mágica com a opção todas as fatias ativada e use a ferramenta pincel para remover o ruído dos contornos.

Em seguida, selecione a região da junta com a ferramenta pincel e atribua-a ao componente da junta e repita a ação em toda a junta. Para suavizar várias fatias de uma só vez, selecione Segmentação no menu superior e selecione Suavizar rótulos. Em seguida, para produzir uma renderização de superfície 3D do componente, clique com o botão direito do mouse na imagem e selecione Gerar superfície.

Agora, clique na superfície renderizada e salve os dados como um arquivo HMASCII para a geração de malha software. 3D malha é uma etapa crítica na geração de um bom modelo. Você precisa se comprometer entre uma malha que represente a verdadeira forma da estrutura que você está tentando modelar, sem incluir tantos detalhes que você introduza elementos problemáticos, como aqueles com um ângulo muito pequeno ou muito grande.

Para gerar a malha, importe o modelo 3D para um pacote de software capaz. Para gerar uma malha bidimensional das superfícies da cartilagem e da articulação, use a ferramenta de contorno simplificado no menu 2D. Escolha um tamanho de elemento entre 1,5 e 2,5.

Uma variedade de malhas de superfície de tamanhos diferentes pode ser feita para realizar a otimização da malha 3D. Para garantir que a malha seja contínua entre as superfícies da articulação e da cartilagem, todos os elementos no limite devem compartilhar nós comuns. Para conseguir isso, remova a superfície interna da junta, deixando um tubo oco.

Use a tecla de função F2 para acessar o atalho para o menu Excluir elementos. Selecione os elementos a serem excluídos. Ajuste os nós de limite para corresponder à superfície da cartilagem.

Use uma combinação de teclas de função F2, F3 e F6 para excluir, mover nós e criar novos elementos, respectivamente. Finalmente, duplique a superfície da cartilagem na articulação usando o menu de componentes de organização do coletor. Use a tecla de função F2 para excluir todos os elementos não articulados.

Depois, execute verificações de qualidade acessando o painel Verificar elementos. Verifique se há elementos, inserções e penetrações duplicados na malha. Se encontrado, edite-os usando a guia Ferramentas.

Verifique os ângulos diedros usando a guia Utilitário encontrada na opção de árvore de modelo. Para gerar uma malha 3D a partir das malhas de superfície 2D de diferentes tamanhos de elemento, use a ferramenta Tetramesh. Compare diferentes tamanhos de malha e selecione o modelo de EF com o menor tamanho de malha que converge após outras simulações e não compromete a definição do recurso.

Em seguida, usando a ferramenta Distância, transforme a malha para que o modelo de mandíbula seja dimensionado. Certifique-se de que os componentes da cartilagem e da articulação estejam conectados no modelo exportando um modelo mesclado ou usando laços. Em seguida, aplique cargas, restrições e propriedades do material ao modelo de EF para simular a função da mandíbula.

Usando as pilhas confocais rotuladas como guia, defina os músculos. Primeiro, atribua nós que correspondam aos pontos de fixação muscular. Em seguida, crie vetores entre os nós que representam a origem e a inserção de cada músculo.

Depois que todos os músculos estiverem definidos, crie um coletor de carga de histórico e aplique uma Cload a cada músculo. Especifique a magnitude em newtons e atribua o vetor associado. Em seguida, atribua propriedades isotrópicas elásticas apropriadas do material, conforme determinado pela literatura.

Em seguida, crie um coletor de carga de limite e aplique algumas restrições iniciais no modelo. Escolha os nós a serem restringidos e selecione um fator de graus de liberdade semelhante à amplitude natural de movimento para o músculo definido por esses nós. Agora, crie uma etapa de carregamento para cada tipo de movimento a ser simulado.

No menu de análise, selecione todas as cargas e restrições relevantes para simular o movimento que está sendo especificado. Em seguida, selecione estático no menu suspenso. Quando estiver pronto, exporte o modelo em um formato de arquivo apropriado, incluindo a malha, as cargas, as restrições e as propriedades do material.

Nesse caso, o formato INP é escolhido. Em seguida, carregue o modelo no software de análise de EF. Nele, crie e execute um trabalho para o modelo e analise a saída de tensão, tensão, deslocamento e assim por diante.

Selecione de três a seis larvas de peixe-zebra transgênico e anestesie levemente as larvas com 0,02% MS-222 até que parem de responder ao toque, mas seus corações ainda batam. Em seguida, monte as larvas lateralmente em lamínulas em agarose morna a 1% de baixo ponto de fusão na solução de Danieau. Em seguida, remova cuidadosamente a agarose ao redor da cabeça e da mandíbula com uma pinça.

Em seguida, usando uma pipeta Pasteur, lave a solução fresca de Danieau sobre a cabeça da larva para remover o anestésico. Faça isso até que o movimento normal da boca seja retomado. Agora, use um software de captura de filmes para gravar vídeos fluorescentes de alta velocidade dos movimentos da boca.

Filme na taxa de quadros mais alta pelo tempo necessário para gravar vários ciclos de abertura da mandíbula. Posteriormente, analise o deslocamento máximo da mandíbula. Escolha as armações que mostram a mandíbula mais aberta e meça a distância entre a ponta anterior da cartilagem de Meckel e a mandíbula superior.

O ponto da mandíbula superior corresponde à ponta da placa etmoidal. A imunocoloração para músculo e cartilagem, ou imagem de repórteres transgênicos, permite que a estrutura 3D da mandíbula seja visualizada, juntamente com a musculatura associada. Ao obter imagens em alta resolução, foi possível construir um modelo que captura a forma tridimensional da mandíbula.

O modelo incorpora cargas cuja localização e magnitude foram derivadas das imagens confocais de músculo e cartilagem. A partir deste modelo, uma variedade de propriedades de materiais diferentes foram testadas. Utilizando o deslocamento in vivo visto por meio de captura de vídeo em alta velocidade, foi selecionado um modelo que melhor replica essa amplitude de movimento.

Usando os dados mais precisos de propriedades de materiais, cargas e forma de malha, o modelo FE foi usado para explorar a melhor estimativa do ambiente mecânico experimentado durante esse período. Por exemplo, magnitudes da tensão foram medidas. O modelo pode ser ampliado para ver os detalhes finos do padrão e, em seguida, visto em seções digitais para observar os detalhes em todas as dimensões.

Depois de assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como usar imagens confocais para construir um modelo 3D fisiologicamente preciso de uma estrutura biológica que está sob carga mecânica. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que este é um modelo linear e elástico, e a cartilagem não se comporta inteiramente como um material linear. Outras propriedades do material, como permeabilidade, podem ser incorporadas, mas podem exigir modificações adicionais na malha.