Preparação de cromossomos se espalha a partir do Mouse espermatócitos

O objetivo geral deste protocolo é preparar propagações cromossômicas meióticas de espermatócitos de camundongos para permitir o estudo da meiose masculina. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia reprodutiva sobre os mecanismos que regulam a recombinação meiótica e a segregação cromossômica. A principal vantagem dessa técnica é que ela produz uma abundância de núcleos de espermatócitos em diferentes estágios da meiose, especialmente aquelas células que passam pelos subestágios da prófase 1.

A demonstração visual desse método é crítica porque uma técnica usada para espalhar os núcleos dos espermatócitos em lâminas é difícil de transmitir por escrito. Comece pesando testículos pareados colhidos de camundongos machos pós-natais a adultos e colocando os espécimes pesados em uma placa de Petri contendo algumas gotas de tampão de extração hipotônico frio. Para colher os túbulos, use as pontas de uma pinça curva para segurar um testículo contra o fundo do prato e use uma lâmina de barbear de ponta reta para fazer uma pequena incisão vertical na linha média através da cápsula do testículo.

Use um segundo conjunto de pinças curvas ou uma lâmina de barbear de ponta reta para apertar suavemente os túbulos seminíferos do testículo e transfira os túbulos seminíferos para um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de tampão de extração hipotônico frio, tomando cuidado para evitar coletar pedaços da cápsula testicular com os túbulos. Quando todos os túbulos tiverem sido coletados, coloque o cônico cúbico no gelo por 30 a 60 minutos, dependendo do tamanho dos testículos. Enquanto os túbulos estão incubando, rotule as extremidades foscas das lâminas pré-limpas com o número do mouse, o número da lâmina e a data, e coloque as lâminas rotuladas em um frasco Coplin contendo solução fixadora.

No final da incubação, despeje os túbulos em uma nova placa de Petri e separe os túbulos em aglomerados de aproximadamente três milímetros de diâmetro. Em seguida, coloque 23 microlitros da solução mínima ou de sacarose 100 em um anel de uma lâmina de três anéis impressa em Teflon e adicione um aglomerado de túbulos ao anel. Usando uma pinça de ponta curva para segurar a touceira, use uma lâmina de barbear tamanho 11 para picar suavemente os túbulos até que a solução fique turva.

Quando a solução ficar turva, remova os detritos e outros 23 microlitros de solução de sacarose para o anel. Use uma micropipeta para pipetar suavemente a mistura algumas vezes para ajudar a separar as células na suspensão. Em seguida, remova uma lâmina da solução fixadora e incline a lâmina sobre o frasco para que uma gota generosa se acumule no canto inferior.

Tome cuidado para que a gota seja grande o suficiente para que, juntamente com a suspensão celular adicional, a lâmina fique muito úmida e completamente coberta quando a mistura for espalhada. Adicione 20 microlitros de células à gota e misture a suspensão duas a três vezes por pipetagem. Em seguida, espalhe a suspensão celular ao longo do comprimento da lâmina e incline lentamente a lâmina para o lado oposto à gota.

Em seguida, incline lentamente a corrediça para trás para espalhar a suspensão da célula ao longo da largura da corrediça para cobri-la completamente. Para evitar a sobreposição das células, tome cuidado para não espalhar a suspensão celular sobre a mesma área duas vezes. Após espalhar, coloque imediatamente a lâmina em uma câmara umidificada e espalhe a próxima lâmina.

Quando o número desejado de lâminas tiver sido preparado, cubra a câmara e deixe-as secar à temperatura ambiente durante duas horas e meia. No final da incubação coberta, remova a tampa para permitir que as lâminas sequem completamente ao ar por mais 30 minutos. Quando as lâminas estiverem completamente secas, coloque-as em um frasco Coplin contendo 0,4% Photo-Flo 200 em PBS para duas incubações de dois cinco minutos com agitação suave, seguidas de uma lavagem de cinco minutos em 0,4% Photo-Flo 200 em água com agitação.

Após a última lavagem, limpe cuidadosamente as bordas e a parte inferior de cada lâmina para remover o excesso de líquido e seque as lâminas por 15 a 20 minutos em uma posição angular, quase na vertical. Em seguida, armazene as lâminas a menos 80 graus Celsius em uma caixa de lâminas bem fechada e protegida da luz por até três semanas antes da imunocoloração. Nesta imagem, podem ser observados núcleos de espermatócitos pacitos bem espalhados.

Esses núcleos contêm homólogos imunomarcados de forma desigual que parecem esfarrapados devido ao excesso de incubação dos túbulos seminíferos no tampão de extração hipotônico. Esses núcleos estavam mal espalhados, resultando em células sobrepostas, enquanto esses núcleos continham homólogos fragmentados, resultantes do excesso de picagem dos túbulos seminíferos. Se esta técnica for realizada corretamente, no entanto, uma variedade de núcleos representando os cinco principais subestágios da prófase 1 pode ser observada.

Uma vez dominado, este protocolo, incluindo a preparação da solução, incluindo as etapas de preparação, secagem e lavagem da solução, pode ser concluído em aproximadamente cinco horas e meia, se for executado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante incubar os túbulos seminíferos no tampão hipotônico pelo período de tempo apropriado e inclinar as lâminas em uma direção de cada vez ao espalhar a suspensão celular. Após este procedimento, outros métodos, incluindo imunocoloração e microscopia, são frequentemente realizados para avaliar processos meióticos fundamentais, como reparo de quebra de fita dupla de DNA e formação de crossover.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar as propagações cromossômicas meióticas masculinas. Um procedimento simples que requer alguma prática para ganhar competência e ótimos resultados. Obrigado por assistir a este vídeo e boa sorte com este protocolo.