Medição da sinalização do receptor acoplado à proteína G via ligação GTP marcada com rádio

O objetivo geral deste procedimento é isolar as membranas celulares que contêm receptores acoplados à proteína G ou GPCRs e estudar a farmacologia do GPCR usando um ensaio de ligação GTP funcional. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da bioquímica sobre as propriedades farmacológicas de receptores acoplados à proteína G estabelecidos ou órfãos. As principais vantagens são que é simples, rápido e mede o evento mais proximal na sinalização de receptores acoplados à proteína G.

Primeiro, coloque células renais embrionárias humanas em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros em 10 mililitros de DMEM completo. Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, até atingir 70% a 80% de confluência. Após a incubação, transfecte as células com HAMOR1 usando um reagente de transfecção adequado de acordo com as diretrizes do fabricante.

Em seguida, incube as células conforme descrito anteriormente por 36 a 48 horas. Depois de remover as células transfectadas da incubadora, aspire o meio e enxágue as células com cinco mililitros de PBS gelado. Em seguida, aspire o PBS e o excesso de líquido da placa.

Em seguida, adicione 600 microlitros de tampão 1 às células. Usando um raspador de células, desaloje as células da superfície da placa e pipete a suspensão de células em um tubo de microcentrífuga de 1,6 mililitro. Congele imediatamente o tubo da microcentrífuga em nitrogênio líquido.

Assim que a amostra estiver congelada, descongele os lisados no gelo. Depois que os lisados forem descongelados, use um homogeneizador de microtubo de pulso único para abrir as células. Pulsando esse homogeneizador três a cinco vezes por 10 segundos.

Coloque o tubo no gelo por 30 segundos entre os pulsos. Em seguida, centrifugue a amostra por 10 minutos a 1.000 vezes g e quatro graus Celsius. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,6 mililitro no gelo.

Ressuspenda o palato em 100 microlitros de tampão 1. Homogeneizar novamente a amostra e pulsar o homogeneizador três a cinco vezes por cinco segundos, colocando o tubo no gelo por 30 segundos entre os pulsos. Depois de centrifugar a amostra uma segunda vez, combinar os sobrenadantes e centrifugar durante 20 minutos a 11 000 vezes g e quatro graus Celsius.

Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,6 mililitro. Ressuspenda em 200 microlitros de tampão 2. Em seguida, homogeneizar o paladar triturando-o de três a cinco vezes.

Depois de centrifugar a amostra e aspirar o sobrenadante, ressuspender o palato contendo a facção bruta da membrana em 50 microlitros de tampão 2. Dilua o estoque S35GTP gamma S para 50 nanomolares e 10 milimolares traços de HCl e 10 milimolares DTT. Faça 250 microlitros-hora para os experimentos de encadernação e congele rapidamente para armazenamento, se desejar.

Em seguida, prepare o tampão de ligação completo ou CBB, complementando o tampão de ligação incompleto para incluir uma concentração final de um DTT milimolar, 0,1% BSA, 10 GTP micromolar e 0,1 nanomolar S35GTP gama S. Depois de descongelar a fração da membrana no gelo, dilua-a a uma concentração de 100 microgramas por mililitro e tampão de ligação incompleto. Para testar o efeito do peptídeo DAMGO na ligação ao GTP via MOR1, prepare uma série de diluições DAMGO e CBB para um volume final de 100 microlitros. Para avaliar a ligação do manjericão GTP, prepare um tubo de microcentrífuga de 1,6 mililitro com 100 microlitros de CBB.

Para avaliar a ligação não específica, prepare um tubo de microcentrífuga de 1,6 mililitro com 99 microlitros de CBB suplementado com um microlitro de dois milimolares não radiais marcados com GTP gama S. Agora, adicione 100 microlitros da solução de membrana diluída a cada amostra. Incubar as amostras durante 30 minutos a 25 graus Celsius num termomisturador a 300 rpm. Pré-mergulhe os filtros de fibra de vidro em água destilada por 10 minutos.

Depois de remover as amostras do termomisturador, gire brevemente por cinco segundos para coletar cada amostra no fundo do tubo. Em seguida, remova a tampa de um aparelho de filtragem a vácuo e coloque os filtros pré-embebidos nas portas de vácuo do aparelho. Prenda novamente a tampa do aparelho para formar uma vedação a vácuo e ligue o aspirador.

Pipete 195 microlitros de cada amostra nos filtros. Lave os filtros três vezes com um mililitro de tampão de lavagem gelada. Coloque cinco mililitros de frascos de contagem de cintilação em uma prateleira de contagem.

Adicione cinco mililitros de fluido de cintilação a cada frasco. Em seguida, desligue o aspirador e remova a tampa do aparelho de filtragem a vácuo. Usando uma pinça, pegue os filtros das portas de vácuo do aparelho de filtração e coloque cada filtro em um frasco de cintilação.

Depois de tampar cada frasco com segurança, incube as amostras em um agitador orbital a 25 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, ligue o contador de cintilação, programe o contador para medir a emissão de isótopos de enxofre 35 por cinco minutos por amostra usando o programa de cintilação padrão associado e pressione start para levar em consideração. O fracionamento do auto, separa claramente proteínas da membrana da histona nuclear h2b da proteína e do glicerol da proteína citoplasmática para esconder a desidrogenase do fosfato três.

As proteínas são enriquecidas em suas respectivas frações subcelulares. Um representante da coloração de Ponceau demonstra carga proteica igual em cada fração. Vários parâmetros farmacológicos podem ser conduzidos para caracterizar uma interação do ligante GPCR por meio de experimentos de ligação ao GTP, como o EC50 e o coeficiente de colina.

Aqueles que respondem à ligação do GTP ao MOR1 após o tratamento com DAMGO são demonstrados aqui. Este gráfico ilustra a atividade agonista do DAMGO no antagonismo da naloxona na sinalização da proteína G MOR1. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas a quatro horas, dependendo do número de condições experimentais.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar concentrações de ligantes GPCR pelo menos cinco ordens de magnitude acima e abaixo do EC50 esperado. Seguindo este procedimento, avaliar moléculas que são estruturalmente semelhantes ao seu ligante de interesse pode ajudar a definir porções estruturais importantes no ligante que definem o perfil do ligante de um receptor. Após seu desenvolvimento, essa técnica ajudou na descoberta de medicamentos e abriu caminho para os pesquisadores explorarem aspectos detalhados da sinalização GPCR, como o agonismo tendencioso.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar membranas celulares e medir as propriedades farmacológicas dos GPCRs usando GTP marcado com rádio. Não se esqueça de que trabalhar com radiação pode ser extremamente perigoso. Devem ser tomadas precauções, como usar equipamento de proteção individual adequado e trabalhar com desgaste de laboratório apropriado para radiação.

As diretrizes institucionais para trabalhar com radioatividade devem ser revisadas antes de realizar este procedimento.