Name: Surgical Ablation Ensaio para Estudar Eye Regeneração em Planárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprenda a técnica de ablação cirúrgica de olhos em planárias para estudar regeneração ocular e biologia de células-tronco. Este método permite remover tecidos com mínimo dano às estruturas adjacentes.

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Os autores gostariam de obrigado Michelle Deochand para aperfeiçoar esta técnica de ablação olho, Taylor Birkholz para assistência com o ensaio funcional, Michael Levin para o anticorpo anti-arrestina, e Junji Morokuma para obter informações sobre as placas de Peltier. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa SFSA da Western Michigan University para WSB.

1. Cultura Animal e Manuseamento NOTA: Este protocolo utiliza mediterranea Schmidtea, uma espécie planarian diplóides com um genoma seqüenciado 16, 17 que é comumente usado para a pesquisa de regeneração. No entanto, o ensaio é igualmente bem sucedido com outras espécies, tais como Girardia Tigrina e Girardia dorotocephala (que se encontram comercialmente disponível). <ol><li> Manter vermes em &quot;água verme&quot; feitos a partir de sais / L 0,5 g do mar em ultrapura (ou desionizada filtrada) água. Use de polipropileno ou de vidro recipientes estéreis para segurar a água sem-fim. Ver <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55594/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">Documento Suplementar 1</a> para obter detalhes sobre a preparação de água worm. NOTA: Não utilizar sabão para limpar recipientes (ou de outras fontes) como o sabão é tóxica para vermes; em vez limpar com etanol a 70% e deixar secar ao ar. &lt;ol&gt; <li> Usar luvas ao trabalhar com planaria para protegê-los de qualquer contaminação. NOTA: Worms são muito sensíveis às toxinas e substâncias químicas ambientais, incluindo sabão, água sanitária, xampu, condicionador e loção de mão. </li></ol></li><li> colónias de casas em recipientes de alimentos de polipropileno, com a tampa parcialmente aberta esquerda para a troca de ar a ~ 20 ° C (temperatura ambiente). Loja sem-fins experimentais, nem em placas de petri (20 vermes por placa de 100 mm) ou placas não-tratados de cultura de tecidos (um sem-fim por po, para placas de 12 poços). Para reduzir o estresse, manter ambas as colônias e experiências no escuro. NOTA: Colonies não deve ter mais do que 500-1.000 vermes por litro de água worm. Para experiências, deixe tampas plenamente em vigor, uma vez que o fluxo de ar é projetado para esses pratos. </li><li> Alimentar vermes não experimentais, uma vez por semana com puré carne orgânica ou fígado de galinha, largando puré de uma pipeta de transferência, colocando gotas de alimentos ao longo do recipiente. Permitir vermes 2 h para consumir alimentos naescuro antes de limpar o recipiente (ver passo 1.4). Antes de usar, puré de armazenar a -20 ° C durante curto prazo (semanas) ou -80 ° C durante a longo termo (em meses); não recongelar puré para re-utilização (como bactérias podem florescer e prejudicar os vermes). NOTA: Fígado não deve conter hormonas ou antibióticos e de preferência não ser previamente congelados. Centrífuga puré antes da congelação (ou antes da alimentação) para remover o ar e impedir que o alimento flutuante. Os alimentos devem desviar para o fundo do recipiente. 1 mL de puré é suficiente para 500-1.000 vermes. </li><li> água troca uma vez por semana com água verme fresco para ambas as colônias e experimentos. recipientes de colónias também deve ser limpo com uma toalha de papel não branqueada (para remover os resíduos de muco que os resíduos trap) uma vez por semana para fome vermes, ou duas vezes por semana para os vermes alimentam (2 h após a alimentação e outra vez de 2 dias mais tarde). A fim de reter o biofilme, não limpe mais do que 80% do recipiente. </li><li> Mover vermes entre os recipientes (ou setu cirurgiap) usando uma pipeta de transferência. Para vermes livres aderidas às superfícies do recipiente, esguichar água sobre / por trás do sem-fim de libertá-lo da superfície. Em seguida, aspirar o sem-fim para a pipeta, ao tentar manter o sem-fim no interior da parte inferior polegada (mais fina) da pipeta. <ol><li> pipetas protelar com uma pequena quantidade de água verme antes de sugar-los. </li><li> Tente mover a água ao redor do worm, ao invés do próprio verme, para ajudar a prevenir rasgando vermes de corpo mole por tocá-los com a pipeta. </li><li> Manter pratos cobertos experimentais, a menos que a transferência de vermes ou substituir a água. </li></ol></li></ol> 2. Preparação <ol><li> Suspender a administração vermes pelo menos uma semana antes das experiências. <ol><li> Selecione vermes que não foram alimentados durante pelo ≥1 semana e são pelo menos 5-7 mm de comprimento. Transferir os vermes para uma placa de Petri de 2/3 cheio de água sem-fim, e confirmar comprimento sem fim por uma régua de deslizamento debaixo do prato. Meça wORMs enquanto totalmente estendida e em movimento. NOTA: Embora menor (5-7 mm) vermes funcionam melhor quando se realiza imunofluorescência posterior e em análises de hibridização in situ, vermes maiores (8-10 mm) são mais fáceis de trabalhar com - especialmente quando aprender a ablação. </li><li> Certifique-se de que os vermes são inteiro, intacto, e não recentemente regenerar. NOTA: Regeneração vermes terá muito mais leve (ou não) do pigmento na cabeça e / ou a região da cauda, ​​em comparação com vermes normais. </li><li> Se realizar ARNi ou tratamentos farmacológicos em vermes, fazê-lo neste momento. Se vermes foram alimentados como parte do tratamento (como por RNAi), esperar, pelo menos, 7 dias após a última alimentação, antes de continuar para o passo 2.2. </li></ol></li><li> Limpar a base do microscópio de dissecção e o espaço de trabalho com 70% de etanol e deixar secar completamente. Coloque o prato de vermes selecionados para a esquerda do escopo. Para a direita do âmbito, colocar um par de fórceps # 5, uma agulha 31 G 5 de insulina / 16 polegadas com um 1ml de uma seringa, e uma pipeta de transferência limpa. <ol><li> Certifique-se de que os instrumentos são mantidos de tocar o banco (o que poderia introduzir contaminantes). Utilizar um produto rígido (tal como um resto pauzinho) para manter a pinça, agulha, pipeta e limpo. Alternativamente, instrumentos lugar na parte superior de um castanho (não branqueada) toalha de papel fresca. NOTA: Estas e subsequentes instruções são escritas em que dizem respeito a indivíduos destros. indivíduos canhotos devem reverter as direções Direita / Esquerda. </li></ol></li><li> Ao lado do espaço de trabalho, colocar uma caixa de lenços de tecido sem fiapos, uma fonte de água fresca verme, e algumas pipetas de transferência extra (protegidas da bancada). água verme lugar em um frasco de lavagem de plástico para facilitar a distribuição. Também colocar uma placa marcada de 12 poços (ou 100 milímetros placa de Petri) para a direita da margem para recolher animais ablação. </li><li> Se estiver usando uma placa Peltier feitos sob medida para imobilizar vermes, posicione a placa de Peltier na depressão em tele base do microscópio de dissecação e ajustar a saída da fonte de energia DC até que a superfície de trabalho da placa de Peltier é suficientemente frio (tipicamente ~ 5 V) .Alternatively, fazer uma placa fria por enchimento de uma placa de Petri de 100 mm cheia com água ½ e congelar durante pelo menos 24 h. Descartar a tampa e colocar a parte inferior da placa de 100 mm na base do escopo de dissecação, em seguida, colocar a tampa de um prato de 60 mm Petri de cabeça para baixo directamente sobre a superfície do gelo (Figura 1A). <ol><li> Depois de congelada a água na placa de 100 mm, de um &quot;vulcão&quot; de gelo pode aparecer no centro da placa. Se isto acontece, utilizar uma lâmina de barbear para raspar o plano de gelo, para remover quaisquer irregularidades da superfície. NOTA: Durante cirurgias o gelo vai derreter, fazendo ablações muito mais difícil. Prepare vários pratos de gelo com antecedência, e substituir os congelados para derreter queridos durante o ensaio, logo que a tampa do prato 60 milímetros começa flutuante. </li></ol></li><li> Prepare osuperfície cirurgia. Cortar um pedaço de 5 cm x 10 cm de película de plástico de parafina (4 cm 2, se utilizar a placa de petri placa fria) e colocá-lo sobre o centro do dispositivo de imobilização. Dobre um tecido que não solte fiapos limpar em uma praça a cerca de 2 cm2 e colocá-lo no topo do filme. Cortar um pedaço de papel de filtro branco 1,5-2 cm2 e colocá-lo em cima da toalhita. Ver Figura 1B-1E. <ol><li> Segure o dobrado acabar no lugar com um dedo de luva, e usar água worm para umedecer levemente o pano para garantir que ele permaneça dobrado. Utilizar o lado de uma pipeta de transferência para rolar a limpar plana. NOTA: temperatura fria ajuda a manter os vermes de se mover. Trabalhando &quot;seco&quot; também ajuda a imobilização. O lenço de papel age de pavio de água através do papel de filtro, mantendo o verme húmido durante a cirurgia sem permitir vermes a secar completamente (que é letal). </li></ol></li></ol> 3. ablação cirúrgica <ol><li> Use uma pipeta de transferência para colocar emlado e verme dorsal para cima sobre o papel de filtro. Ligue a fonte de luz e dirigir as goosenecks para que a luz é focada no worm. Ajuste o foco escopo dissecar e ampliação para que os olhos são claramente visíveis (todo o worm não precisa ser à vista); 5X é um bom ponto de partida. Orientar o verme ao rodar o filme de parafina de forma que a cabeça é apontada em direcção ao investigador (na direcção da frente do microscópio), em ângulo de 30-40 graus para a direita. <ol><li> Evitar o uso de luz brilhante para prevenir o excesso de movimento sem-fim. Planárias exibir fototaxia negativos e tentará fugir luz brilhante. </li><li> Se o sem-fim está posicionada lado ventral para cima (com faríngea abertura visível), utilizar o lado opaco do fórceps para reposicionar suavemente lado do sem-fim dorsal para cima (com olhos visíveis). Evitar a aproximar-se do animal com a ponta afiada da pinça para minimizar a possibilidade de rasgar através dos tecidos moles, quando o reposicionamento do animal. </li><li&gt; Ajuste o foco do microscópio para que os olhos são claramente em foco. Também garantir que ambos os olhos e tecidos circundantes cabeça estão à vista. </li></ol></li><li> Realizar uma nova agulha / seringa na mão direita, como se fosse uma caneta (entre o polegar e o dedo indicador). Prepare o polegar esquerda contra a placa de Peltier (ou placa de Petri placa fria), e utilizar o polegar esquerdo como um ponto de apoio sobre a qual a parte inferior da seringa vai descansar (Figura 2A). Olhe através do microscópio, e certifique-se o bisel da agulha é visível. NOTA: As agulhas são muito afiadas. Seja cauteloso ao lidar com eles. Vestindo látex ou nitrilo podem oferecer alguma proteção. <ol><li> Use o polegar esquerdo para ajudar a segurar a agulha / seringa constante durante todo o procedimento e evitar apertando as mãos. </li><li> Faça um ângulo de aproximadamente 40 ° com o polegar esquerdo e dedo indicador esquerdo (com o dedo indicador sobre a superfície da cirurgia) para ajudar a segurar o estável superfície cirurgia. </li></ol></li><li> Como bisel da agulha voltada para cima (como uma colher), a posição da agulha em ângulos rectos para o olho (Figura 2B). Utilizar a ponta da agulha para penetrar suavemente a fina camada de tecido que cobre o copo óptica (branco, região não pigmentado) do olho, escavando a partir da direita para a esquerda. Muito gentilmente remover qualquer tecido pigmentado localizado dentro do cálice óptico, tomando cuidado para não perfurar a parte inferior ou destruir as fronteiras do cálice óptico. <ol><li> Se o sem-fim tem sido no papel de filtro durante&gt; 1-2 min a qualquer momento durante o procedimento, adicionar uma gota de água sem-fim de re-hidratar o sem-fim. NOTA: A desidratação irá aumentar a susceptibilidade do worm a lesões rasgando. </li></ol></li><li> Repetir o passo 3.3 até que todos os tecidos pigmentados de preto (células de pigmento), bem como todos os tecidos brancos do copo óptica (dendritos das células fotorreceptoras), são removidos. Remover tecidos excisados ​​preso à extremidade da agulha, limpando cuidadosamente com um lenço de papel. Se abla dupla olhoção é pretendida, ablação do segundo olho neste ponto. NOTA: Para evitar ferimentos, as agulhas podem ser limpos por agarrar a agulha com um tecido limpo toalhete realizada com o polegar e o indicador, em seguida, usando a outra mão para puxar a agulha através da enxugar do polegar e o indicador. Alternativamente, a agulha pode ser varrida sobre a superfície de um tecido de esfregão húmido e examinados para limpeza. </li><li> Quando terminou, utilizar uma pipeta de transferência para mover o sem-fim a um prato marcado contendo água fresca sem-fim. Se a análise de dados de grupo, coloque até 20 vermes em um único 100 milímetros placa de Petri. Se rastreamento de regeneração nos mesmos indivíduos ao longo do tempo, coloque 1 verme em cada poço de uma placa de 12 poços. Uma vez que todos os vermes são transferidos, enxaguar vermes, removendo toda a água sem-fim dos pratos / poços e substituindo com mais água fresca sem-fim. <ol><li> Para remover vermes do filtro, protelar a pipeta com uma pequena quantidade de água sem-fim e libertar a água para o sem-fim. Isso deve levantar tele verme fora do papel de filtro, para ser imediatamente sugado para dentro da pipeta para transferência. </li></ol></li><li> Incubar experiências a ~ 20 ° C (temperatura ambiente) protegidas da luz e acompanhar o processo regenerativo. NOTA: Worms pode ser armazenado em uma incubadora com temperatura controlada para manter uma temperatura constante, mas isso não é estritamente necessário. A maioria das temperaturas ambientes variam apenas por 5 ° C, o que não irá afectar a capacidade do sem-fim de regenerar. </li><li> Se desejado, corrigir vermes para imuno-histoquica (ver Figuras 3-4) e / ou em análises de hibridação in situ da expressão do gene. Existem diferentes métodos de fixação para imuno-histoquímica planarian 18, 19, 20 e a hibridização in situ 21, 22, 23 protocolos. </li><li> Na celebração dos experimentos, sacrifice viver vermes através da remoção de água sem-fim do prato e substituindo com etanol a 70%. Incubar vermes para 3-5 min, a verificação de vermes para lisar e transformar acinzentada. </li><li> Coloque vermes não tratados no fluxo de resíduos normal uma vez que sacrificado. Evitar a introdução de vermes vivos no ambiente, particularmente espécies não-nativas. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Esta técnica de ablação olho melhora sobre os métodos correntes (tais como furador) por excluindo os tecidos cerebrais e restringindo excisão principalmente para os tecidos do olho. Com a prática, esta técnica pode ser realizada pela maioria dos indivíduos, de técnicos experientes em microcirurgias para estudantes de graduação inexperientes, mas de consciência. Recomenda-se que esta técnica ser praticadas muitas vezes antes de usar ablações em experimentos, incluindo (quando possível) confirmação de remoção completa de ...

Planárias são um poderoso organismo modelo para o estudo da regeneração mediada por células-tronco adultas. Estes vermes de água doce não-parasitárias possuem a capacidade de regenerar a quaisquer e todos os tecidos em falta, incluindo o sistema nervoso central e do cérebro 1. Estudado, tanto para trás como os 1700s 2, avanços tecnológicos no domínio planarian durante os últimos 10-15 anos (tais como um genoma sequenciado, hibridao in situ, imuno-histoquímica, de ARN de interferência (ARNi), e transcriptómica) ter actualizado este organismo modelo histórico . Especificamente, planárias recentemente ganhou popularidade como um modelo emergente de pesquisa olho 3. Planárias têm olhos prototípicas com apenas dois tipos de tecido, os neurónios fotorreceptores e células de pigmento; esta permitiu a caracterização da sua população de células-tronco olho e demonstrado que muitos dos mesmos genes regulando vertebrado de olhosenvolvimento são conservados em planarians 4, 5. Os copos óptica estão localizados dorsalmente e composta dos dendritos branco, não pigmentadas dos neurónios fotorreceptores e as células de pigmento preto semi-lunar, e os olhos inervam o cérebro através de um quiasma. Além de ser um modelo para elucidar os processos regenerativos 6, o olho planarian é bem adequado para o estudo da evolução de mecanismos visuais 7, as respostas comportamentais a luz (planarians exibir fototaxia negativo) 8, e a base neurológica de comportamento 9. Regeneração olho em planarians tem sido largamente estudada em dois contextos principais: como parte de regeneração da cabeça seguinte decapitação 4, 10, e após a excisão de apenas os tecidos do olho 11, 12 </sup&gt;. A maioria dos estudos sobre a regeneração planarian olho têm usado o método de decapitação, como é simples e direta. O método de excisão olho planarian mais comum até à data tem sido através de perfuração com um tubo capilar de vidro fino 13, 14, embora alguns estudos também realizada amputações apenas por trás dos olhos (decapitação parcial) 15. No entanto, todos estes métodos envolvem a perda de muitas outras do que apenas o olho tecidos (tais como tumores do cérebro, intestinos, e nefrídios), potencialmente complicar a interpretação dos resultados. O protocolo de ablação olho aqui apresentada restringe a excisão para os tecidos do olho (excluindo especificamente cerebral), resultando em dados que são mais específicos para o olho. Além disso, ao contrário de vermes decapitados que levam 7-14 dias para iniciar a alimentação, olho ablated vermes irá alimentar dentro de 24 h de ablação 12, permitindo que as experiências de ARNi (onde ARNi é entregue através dos alimentos) para ser performed concorrentemente. Embora a ablação do olho é tecnicamente mais difícil de executar com êxito do que a decapitação, estudos atuais que envolvem a excisão olho não incluíram instruções detalhadas sobre os seus procedimentos. O objetivo deste artigo vídeo é para permitir aos investigadores para remover consistentemente o copo óptica planarian sem perturbar os tecidos cerebrais subjacentes e removendo como alguns outros tecidos quanto possível. Este método pode ser utilizado para ambos simples e dupla ablação olho e é aplicável a uma vasta gama de investigações. Como a maioria dos ensaios de regeneração, ablação olho é bem adequado para combinação com ambas as telas farmacológicas e genéticas (ARNi), bem como estudos comportamentais. Aqui nós descrevemos métodos para o tratamento de vermes, mantendo uma colônia planarian, ea técnica de ablação de olho em si.

<table><tbody><tr><td>Sais marinhos instantâneos do oceano</td><td>Spectrum Brands&nbsp;</td><td>SS15-10</td><td>"10 Galões" caixa&nbsp; (peso líquido 3 libras)</td></tr><tr><td>Kimwipes EX-L limpeza de lenços de papel sem fiapos</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>4.5 x 8.5 in&nbsp;</td></tr><tr><td>Whatman #2 papel de filtro</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>WHA1002125</td><td>Círculos, 125 mm de diâmetro, branco</td></tr><tr><td>Seringa de insulina Easy Touch (com agulha)</td><td>Pet Health Market</td><td>17175-04</td><td>&nbsp; Seringa U-100 de 1 cc, 31 G 5/16 in agulha</td></tr><tr><td>100 mm Placa de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>60 mm Placa de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>60 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Dumont #5&nbsp; pinça&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Inox, ponta reta, pipetas de transferência de 11 cm</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Samco Scientific&nbsp;</td><td>225</td><td>Graduado, lâmpada grande, 7.5 mL, não estéril</td></tr><tr><td>Parafilm M filme de parafina</td><td>Marca&nbsp;</td><td>701606</td><td>&nbsp; Rolo de 4 in x 125 ft</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos não tratada de 12 poços</td><td>VWR</td><td>15705-059</td><td>Não tratada, fundo plano, estéril, marca Falcon</td></tr><tr><td>Recipientes de plástico para alimentos (para colônia)&nbsp;</td><td>Ziploc</td><td>Grande retângulo</td><td>2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"&nbsp;</td></tr><tr><td>Planaria (Girardia tigrina)</td><td>Carolina Biological</td><td>132954</td><td>Vendida como Planaria "Marrom"; na maioria das vezes são G. tigrina (também conhecido como Dugesia tigrina), mas às vezes são G. dorotocephala (também conhecido como Dugesia dorotocephala); qualquer um funcionará.</td></tr><tr><td>Planaria (Schmidtea mediterranea)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>S. mediterranea não estão disponíveis comercialmente. No momento, os animais só podem ser obtidos em laboratórios que os utilizam e têm animais extras.</td></tr><tr><td>Toalhas de papel marrom</td>Toalha de papel multidobra de 1 camada <td>Grainger</td><td>2U229</td><td>9-3/16 x 9-3/8", garrafa de lavagem NÃO BRÍQUEADA</td></tr><tr><td>(para água de verme),</td> frascos de lavagem <td>VWR</td><td>16650-275</td> opcionais<td>, polietileno de baixa densidade, boca larga, 500 mL</td></tr><tr><td>de anticorpo anti-sinapsina, opcional</td><td>Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma</td><td>3C11</td><td>Sobrenadante</td></tr><tr><td>anticorpo anti-arrestina, opcional</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Não disponível comercialmente. Presente gentil de Michael Levin, Tufts University</td></tr><tr><td>Nalgene Lowboy garrafão com torneira (para armazenar água de minhoca), opcional</td><td>Nalge Nunc International Corporation</td><td>2324-0015</td><td>15 L,&nbsp; polipropileno, perfil baixo facilita o enchimento de recipientes plásticos de colônias&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa Peltier personalizada, máquina Williams opcional</td><td>, Foxboro, MA&nbsp;</td><td>n/a</td><td>Especificações do design cortesia de Junji Morokuma, Tufts University:&nbsp; A placa Peltier é construída com uma bomba de calor termoelétrica padrão (por exemplo, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).&nbsp; A bomba de calor quadrada é coberta com uma fina superfície espelhada e, em seguida, colocada dentro de um orifício quadrado de 30 mm2 em forma circular de plexiglass (~50 mm de diâmetro). Esta forma é de espessura semelhante à bomba de calor e se encaixa em um poço trabalhado no centro de um dissipador de calor redondo (~ 115 mm de diâmetro). A forma/bomba de calor é&nbsp; "ancorado" ao dissipador com composto do dissipador de calor da base do silicone. Os cabos são enfiados através de orifícios perfurados na forma e no dissipador de calor. A metade inferior do dissipador de calor é trabalhada em um "pé" que se encaixa na abertura da placa de base do seu microscópio.</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação DC (para placa Peltier), opcional</td><td>B & K Precision</td><td>1665</td><td>Fonte de alimentação CC de baixa tensão regulada, 1-18 V (DC), 1-10 amperes.</td></tr><tr><td>Outros suprimentos</td><td></td><td></td><td></td>comuns</tr><tr><td>Luvas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecando o escopo com iluminação</td><td></td><td></td><td></td>pescoço de ganso</tr><tr><td>O pauzinho descansa, opcional</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

surgical ablation ensaio para estudar eye regeneração em planárias

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

No estudo de células estaminais adultas e os mecanismos regenerativos, vermes planarian são um grampo no sistema modelo in vivo. Isto é devido em grande parte à sua população de células-tronco pluripotentes abundante e capacidade de regenerar todos os tipos de células e tecidos após lesões que seria catastrófico para a maioria dos animais. Recentemente, planárias ganharam popularidade como um modelo para a regeneração olho. A sua capacidade de regenerar todo o olho (composto de dois tipos de tecidos: células pigmentares e fotorreceptores) permite a dissecção dos mecanismos que regulam a regeneração sistema visual. ablação do olho tem diversas vantagens sobre outras técnicas (tais como a decapitação ou furador) para examinar as vias e os mecanismos específicos do olho, o mais importante dos quais é que a regeneração é largamente restringida a tecidos oculares sozinho. A finalidade deste artigo vídeo é para demonstrar como para remover de forma fiável a taça óptica planarian sem perturbar o cérebro ou tecidos circundantes.O tratamento de vermes e manutenção de uma colónia criada também é descrito. Esta técnica utiliza uma 31 L, agulha de insulina 16/05 polegadas para colher cirurgicamente para fora a cúpula óptica de planarians imobilizados numa placa fria. Este método engloba tanto simples e dupla ablação olho, com olhos de regeneração no prazo de 1-2 semanas, para permitir que uma ampla gama de aplicações. Em particular, esta técnica de ablação pode ser facilmente combinado com (interferência de ARN) telas farmacológicas e genéticas para uma melhor compreensão dos mecanismos de regeneração e da sua evolução, células estaminais do olho e a sua manutenção, e respostas comportamentais phototaxic e sua base neurológica.

Para o primeiro 1-2 h após a cirurgia, os animais podem apresentar movimento diminuiu em comparação com vermes intactos (no entanto, eles ainda se move). Se desejado, vermes vai comer dentro de 24 horas após a cirurgia (por exemplo, para a alimentação de RNAi). Ao seguir a regeneração olho nos mesmos indivíduos ao longo do tempo, certifique-se para tirar uma fotografia de cada verme tanto antes da cirurgia (intacto) e em 1 h após ablação (HPA). Ao fim de 4 dias após a ablação (DPA) regen...

Este protocolo mostra como para excisar consistentemente olhos planarian (copos óptica), sem perturbar os tecidos circundantes. Utilizando uma agulha de seringa de insulina e, de um ou ambos os olhos pode ser cauterizado para facilitar investigações sobre os mecanismos que regulam a regeneração do olho, a evolução de regeneração visual, e a base neural de comportamento induzida pela luz.

Surgical Ablation Ensaio para Estudar Eye Regeneração em Planárias

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como remover de forma confiável a cúpula óptica de planárias sem perturbar o cérebro ou os tecidos circundantes, permitindo que a técnica seja implementada por pesquisadores e estudantes em todos os níveis de ensino. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da regeneração, como determinar os mecanismos que regulam a manutenção e a diferenciação in vivo das células-tronco endógenas do olho. A principal vantagem desta técnica é que ela permite aos pesquisadores remover apenas os tecidos oculares com mínima perturbação de outros tecidos.De modo geral, é necessária prática antes que indivíduos novos neste método consigam remover com confiança a quantidade correta de tecido, ablatando todo o olho enquanto evitam a ablação dos tecidos circundantes. Para começar, selecione vermes que não tenham sido alimentados por pelo menos uma semana e que tenham pelo menos cinco a sete milímetros de comprimento. Transfira de 15 a 30 vermes para uma placa de Petri de 100 milímetros com dois terços cheia de água para vermes e imediatamente recoloque a tampa.Observe os vermes em busca de tecidos ausentes ou despigmentados, como cabeças ou caudas brancas, para garantir que estejam íntegros e não em processo recente de regeneração. Primeiro, limpe a área de trabalho e a base do microscópio estereoscópico com uma solução de etanol 70%, e deixe secar completamente. Coloque o recipiente com os vermes selecionados no lado esquerdo do microscópio.Em seguida, no lado direito do microscópio, coloque um par de pin&ccedil;as n&uacute;mero cinco, uma agulha de insulina de calibre 31 e 5/16 de polegada com uma seringa de um mililitro, uma pipeta de transfer&ecirc;ncia limpa e uma placa de 12 po&ccedil;os rotulada para coletar os vermes ablacionados. Coloque uma caixa de len&ccedil;os at&oacute;micos, uma garrafa de lavagem pl&aacute;stica cheia de &aacute;gua fresca para vermes e pipetas de transfer&ecirc;ncia adicionais de modo que fiquem facilmente acess&iacute;veis durante a cirurgia. Posicione uma placa de Peltier no centro da base do microsc&oacute;pio estereosc&oacute;pico e ajuste a sa&iacute;da da fonte de alimenta&ccedil;&atilde;o DC para que a superf&iacute;cie da placa de Peltier esteja suficientemente fria para imobilizar os vermes.Alternativamente, uma placa de Petri cheia de gelo pode ser usada no lugar de uma placa Peltier. Para preparar a superfície cirúrgica, primeiro corte um pedaço de filme de parafina plástica com cinco centímetros por dez centímetros e coloque-o sobre o centro da placa Peltier. Em seguida, dobre um lenço de papel isento de fiapos em um quadrado de aproximadamente dois centímetros e coloque-o sobre o filme.Em seguida, segure o cotonete dobrado no lugar, umedeça-o com água de vermes e alise o cotonete com uma pipeta de transferência. Por fim, corte um pedaço de papel filtro branco de 1,5 a dois centímetros quadrados e coloque-o sobre o cotonete. Para iniciar a cirurgia, posicione um verme com o lado dorsal voltado para cima sobre o papel filtro, utilizando a pipeta de transferência.Ligue a luz e foque o feixe sobre o verme. Ajuste o foco e a ampliação do microscópio estereoscópico para que os olhos do verme fiquem claramente visíveis. Gire o filme de parafina para ajustar a posição do verme, de modo que sua cabeça esteja voltada para o pesquisador e inclinada entre 30 e 40 graus para a direita.Se o verme estiver posicionado com o lado ventral voltado para cima e a abertura faríngea estiver visível, use o lado rombo da pinça para ajustar suavemente a posição do verme, deixando-o com o lado dorsal para cima e os olhos visíveis. Reajuste as configurações do microscópio para que os olhos fiquem nitidamente em foco. Certifique-se também de que ambos os olhos e os tecidos circundantes da cabeça estejam visíveis.Segure uma seringa limpa na mão direita entre o polegar e o indicador. Apoie a parte inferior da seringa no polegar esquerdo, apoiado contra a placa de Peltier. Olhe através do microscópio para garantir que a bisel da agulha esteja visível.Coloque o dedo indicador esquerdo sobre a superfície cirúrgica de modo que forme um ângulo de 40 graus com o polegar esquerdo, garantindo que a superfície permaneça estável durante o procedimento. Posicione a agulha em um ângulo de 90 graus em relação ao olho, com a bisel da agulha voltado para cima. Com a ponta da agulha, penetre suavemente a fina camada de tecido que recobre a cúpula óptica do olho, visível como uma região branca e despigmentada.Com movimentos de raspagem da direita para a esquerda, remova com muita delicadeza qualquer tecido pigmentado em preto localizado dentro da cúpula óptica, bem como todos os tecidos brancos. Se estiver realizando ablação dupla dos olhos, ablate o segundo olho agora. Após concluir a cirurgia, recolha na pipeta uma pequena quantidade de água para vermes e libere a água sobre o verme para levantá-lo do papel filtro.Retire imediatamente o verme para a pipeta de transferência. Transfira o verme para uma placa de 12 poços rotulada, preenchida até dois terços com água fresca para vermes. Após transferir todos os vermes, lave-os substituindo a água dos poços por água fresca para vermes.Incube os vermes protegidos da luz em um incubador a 20 graus Celsius e monitore o processo de regeneração. Para sacrificar vermes vivos, remova a água dos vermes da placa e substitua por etanol 70%. Incube os vermes por três a cinco minutos e observe se os vermes lisam e ficam cinzentos.Apresentam-se aqui fotografias de planárias submetidas à ablacão dupla dos olhos e à ablacão simples dos olhos, obtidas antes, quatro dias após e duas semanas após o procedimento cirúrgico. As imagens demonstram o progresso da regeneração ao longo do tempo. A regeneração dos olhos em vermes ablatados foi também confirmada por coloração imuno-histoquímica de arrestina e de neurônios fotorreceptores recém-desenvolvidos.A recuperação do sistema visual em planárias após a ablação dupla dos olhos também foi estudada em um ensaio funcional baseado na resposta fotofóbica selvagem à luz. Vinte e quatro horas após a ablação, as planárias sem olhos não evitam a luz e se deslocam através de áreas iluminadas. A fotofobia é restaurada sete dias após o procedimento, indicando que o sistema visual regenerado é funcional.Uma vez dominado, o procedimento de ablação dupla dos olhos de um verme pode ser realizado em aproximadamente três minutos. Ao realizar a ablação, é importante remover todos os tecidos pigmentados e não pigmentados do olho, assegurando-se de não danificar o tecido entre os olhos nem rasgar o tecido posteriormente no interior do olho. Após este procedimento, outras técnicas, como imunohistoquímica e interferência de RNA, podem ser realizadas para examinar o papel de genes específicos e seu processo regenerativo.Além disso, ensaios comportamentais podem ser realizados para testar a função ocular após o re crescimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como excisar os olhos de planárias sem perturbar os tecidos circundantes. Não se esqueça de que trabalhar com agulhas pode ser perigoso, e precauções, como o uso de luvas e segurar a agulha com a ponta voltada para longe do corpo, devem ser tomadas.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Lesão renal aguda (IRA) em seres humanos é um problema clínico comum causado por danos às células epiteliais que compõem néfrons nos rins, e AKI está associada com altas taxas de mortalidade de 50-70% 1. Após a destruição das células epiteliais, néfrons têm uma capacidade limitada de regeneração, embora os mecanismos e as limitações que orientam este fenômeno ainda são pouco compreendidas. Neste artigo de vídeo, descrevemos nossa técnica de ablação a laser alvo de células renais dos néfrons nos...

Ablação a laser da Pronephros Zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal

Um modelo atraente para estudar a diferenciação das células-tronco dentro de um animal vivo é o platelminto planária. Regeneração é estudado por experimentos amputação simples que são facilmente realizados em um laboratório básico e são passíveis de (farmacológicos e...

Farmacológica e funcional Ensaios genética para manipular Regeneração da planária Dugesia japonica</em

Um método eficaz para enxerto de tecido de tamanho definido e consistente entre planaria é descrito. Também incluído é uma descrição de como a técnica de imobilização utilizado para transplante pode ser adaptado, em conjugação com escudos de chumbo, para a irradiação parcial de animais vivos.

Imobilização planária, irradiação parcial e Transplante de Tecidos

Source: Volpe, B. A., et al. ensaio de ablação e regeneração a laser baseado em microscópio confocal em células interneuromast de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2020) Este vídeo demonstra o monitoramento da recuperação de células interneuromastóides em peixe-zebra usando microscopia confocal, rastreando a morte e o reparo celular por meio de imagem de fluorescência com lapso de tempo.

Monitoramento da recuperação de células interneuromast abladas por laser em peixe-zebra usando microscopia confocal

Porque muitos modelos de peixe-zebra de doenças neurológicas e não neurológicas são estudadas no peixe adulto, em vez de o embrião / larvas, foi desenvolvido um ensaio quantitativo regenerativa linha lateral, que pode ser aplicada aos modelos de doenças de peixes-zebra adultos. O ensaio envolveu a resolução neuromasto 1) e 2) os níveis de células de cabelo individuais.

Um ensaio para a lateral de Regeneração de Linha em Zebrafish Adulto

O peixe-zebra é um popular modelo animal para estudar os mecanismos da degeneração/regeneração da retina em vertebrados. Este protocolo descreve um método para induzir lesões localizadas perturbar a retina exterior com danos mínimos à retina interna. Posteriormente, acompanhamos na vivo a morfologia da retina e a resposta de glia Müller em toda a regeneração da retina.

Ativação de células da Müller Glia em um modelo de regeneração no Zebrafish e degeneração retiniana induzida por Laser

A Turbellaria mediterranea Schmidtea é um excelente modelo para o estudo de células-tronco e regeneração de tecidos. Esta publicação descreve um método para remover seletivamente um órgão, a faringe, expondo os animais para a química de azida sódica. Este protocolo também descreve métodos para monitorar a regeneração da faringe.

Química amputação e regeneração da faringe nos Turbellaria mediterranea Schmidtea

A ablação a laser é uma tecnologia amplamente aplicável para estudar a regeneração em sistemas biológicos. O protocolo apresentado descreve o uso de um microscópio confocal padrão de varredura a laser para ablação a laser e imagens subsequentes de lapso de tempo de células interneuromast regeneradoras na linha lateral do zebrafish.

Ablação e Regeneração a laser baseada em microscópio confocal em células interneuromast baseadas em zebrafish

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Remoção de olhos em larvas de zebrafish vivos para examinar o crescimento e desenvolvimento dependentes da inervação do sistema visual

Este protocolo descreve a metodologia para abolar geneticamente o epitélio pigmento da retina (RPE) usando um modelo transgênico de zebrafish. A adaptação do protocolo para incorporar a modulação da via de sinalização usando compostos farmacológicos é extensivamente detalhada. Uma plataforma MATLAB para quantificar a regeneração de RPE com base na pigmentação foi desenvolvida e é apresentada e discutida.

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Aqui, propomos três métodos diferentes de danificar as fibras sensoriais que inervam a córnea. Estes métodos facilitam o estudo da regeneração axonal em camundongos. Estes três métodos, adaptáveis a outros modelos animais, são ideais para o estudo da fisiologia e regeneração da inervação corneana.

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