Surgical Ablation Ensaio para Estudar Eye Regeneração em Planárias

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como remover de forma confiável o copo óptico planário sem perturbar o cérebro ou os tecidos circundantes, para que a técnica possa ser implementada por pesquisadores e estudantes em todos os níveis de ensino. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo regenerativo, como determinar os mecanismos que regulam a manutenção e diferenciação endógena das células-tronco oculares in vivo. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que os pesquisadores removam apenas os tecidos oculares com o mínimo de perturbação de outros tecidos.

Geralmente, a prática é necessária antes que os indivíduos novos neste método possam remover de forma confiável a quantidade correta de tecido, ablação de todo o olho e evitando a ablação dos tecidos circundantes. Para começar, selecione minhocas que não foram alimentadas por pelo menos uma semana e têm pelo menos cinco a sete milímetros de comprimento. Transfira de 15 a 30 minhocas para uma placa de Petri de 100 milímetros, dois terços cheios de água de minhoca e recoloque imediatamente a tampa.

Observe os vermes em busca de tecidos ausentes ou não pigmentados, como cabeças ou caudas brancas, para garantir que eles não estejam danificados e não tenham se regenerado recentemente. Primeiro, limpe a área de trabalho e a base do microscópio de dissecação com uma solução de etanol a 70% e deixe secar completamente. Coloque o prato com os vermes selecionados no lado esquerdo do microscópio.

Em seguida, no lado direito do microscópio, coloque um par de pinças número cinco, uma agulha de insulina de calibre 31 de 5/16 polegadas com uma seringa de um mililitro, uma pipeta de transferência limpa e uma placa de 12 poços rotulada para coletar vermes ablados. Coloque uma caixa de lenços umedecidos sem fiapos, um frasco de lavagem de plástico cheio de água fresca e pipetas de transferência adicionais para que sejam facilmente acessíveis durante a cirurgia. Posicione uma placa de Peltier no centro da base do microscópio de dissecação e defina a saída na fonte de alimentação CC para que a superfície da placa de Peltier fique suficientemente fria para imobilizar vermes.

Alternativamente, uma placa de Petri cheia de gelo pode ser usada no lugar de uma placa Peltier. Para preparar a superfície da cirurgia, primeiro corte um pedaço de filme plástico de parafina de cinco centímetros por dez centímetros e coloque-o sobre o centro da placa de Peltier. Em seguida, dobre um lenço de papel sem fiapos em um quadrado de aproximadamente dois centímetros e coloque-o em cima do filme.

Em seguida, segure o lenço dobrado no lugar, umedeça-o com água de minhoca e enrole o lenço com uma pipeta de transferência. Por fim, corte um pedaço de papel de filtro branco de 1,5 a dois centímetros quadrados e coloque-o em cima do lenço. Para iniciar a cirurgia, coloque um verme com o lado dorsal voltado para cima no papel de filtro, usando a pipeta de transferência.

Acenda a luz e concentre seu feixe no verme. Ajuste o foco e a ampliação do microscópio de dissecação para que os olhos do verme fiquem claramente visíveis. Gire o filme de parafina para ajustar a posição do verme de modo que sua cabeça fique apontada para o pesquisador e inclinada de 30 a 40 graus para a direita.

Se o verme estiver posicionado com o lado ventral voltado para cima e a abertura faríngea estiver visível, use o lado opaco da pinça para mudar suavemente a posição do verme para o lado dorsal para cima com os olhos visíveis. Reajuste as configurações do microscópio para que os olhos fiquem claramente focados. Certifique-se também de que os olhos e os tecidos da cabeça ao redor estejam à vista.

Segure uma seringa limpa na mão direita entre o polegar e o indicador. Apoie a parte inferior da seringa no polegar esquerdo, apoiada na placa Peltier. Olhe através do microscópio para garantir que o chanfro da agulha esteja visível.

Coloque o dedo indicador esquerdo na superfície da cirurgia de forma que ele faça um ângulo de 40 graus com o polegar esquerdo para garantir que a superfície permaneça estável durante o procedimento. Posicione a agulha em um ângulo de 90 graus em relação ao olho com o chanfro da agulha voltado para cima. Com a ponta da agulha, penetre suavemente na fina camada de tecido que cobre a taça óptica do olho, visível como uma região branca e não pigmentada.

Escavando da direita para a esquerda, remova com muito cuidado qualquer tecido pigmentado preto localizado dentro do copo óptico, bem como todos os tecidos brancos. Se estiver realizando ablação de olho duplo, ablação do segundo olho agora. Depois de concluir a cirurgia, carregue a pipeta com uma pequena quantidade de água do verme e libere a água no verme para retirá-lo do papel de filtro.

Puxe imediatamente o verme para a pipeta de transferência. Mova o verme para uma placa rotulada de 12 poços, dois terços cheia de água fresca do verme. Depois que todos os vermes forem transferidos, lave-os substituindo a água dos poços por água fresca

Incube os vermes protegidos da luz em uma incubadora de 20 graus Celsius e monitore o processo de regeneração. Para sacrificar minhocas vivas, remova a água da minhoca da placa e substitua-a por etanol a 70%. Incube os vermes por três a cinco minutos e observe se os vermes lisam e ficam cinzas.

Aqui são apresentadas fotografias de platelmintos submetidos a ablação de olho duplo e ablação de olho único, tiradas antes, quatro dias depois e duas semanas após o procedimento cirúrgico. As imagens demonstram o progresso da regeneração ao longo do tempo. A regeneração ocular em vermes ablacionados também foi confirmada pela coloração imuno-histoquímica da arrestina e dos neurônios fotorreceptores recém-desenvolvidos.

A recuperação do sistema visual em platelmintos após a ablação do olho duplo também foi estudada em um ensaio funcional baseado na resposta fotofóbica do tipo selvagem à luz. 24 horas após a ablação, os vermes sem olhos não evitam a luz e viajam através de pontos de luz. A fotofobia é restaurada sete dias após o procedimento, indicando que o sistema visual regenerado está funcional.

Uma vez dominado, o procedimento de ablação de olho duplo de um verme pode ser feito por aproximadamente três minutos. Ao ablação, é importante extirpar todos os tecidos pigmentados e não pigmentados do olho, certificando-se de não danificar o tecido entre os olhos ou rasgar o tecido posteriormente no olho. Após este procedimento, outros métodos como imuno-histoquímica e interferência de RNA podem ser realizados para examinar o papel de genes específicos e seu processo regenerativo.

Além disso, ensaios comportamentais podem ser realizados para testar a função ocular após o crescimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extirpar os olhos das planárias sem perturbar os tecidos circundantes. Não se esqueça de que trabalhar com agulhas pode ser perigoso, e precauções como usar luvas e segurar a agulha apontando para longe de você devem ser tomadas.