Name: Análises histológicas de lesão hepática alcoólica aguda em peixe-zebra (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda análises histológicas de lesão hepática alcoólica aguda em larvas de Danio rerio tratadas com etanol. Este método avalia esteatose e inchaço vascular para estudar doença hepática alcoólica.

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Os autores gostariam de agradecer a Dra. Katy Murray no Zebrafish International Resource Center; Dr. Stacey Huppert e Kari Huppert no CCHMC, pelos seus conselhos úteis sobre o protocolo; E serviço veterinário CCHMC, para o cuidado com peixes. Este trabalho foi apoiado pelo NIH subvenção R00AA020514 e uma bolsa de investigação do Centro de Genómica Pediátrica no CCHMC (para CY). Foi também apoio em parte pelo NIH concessão P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) do Centro de Pesquisa de Doenças Digestivas Core em Cincinnati.

<ol><li>Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYoon%2C+YH+%22Surveillance+report+%23100%3A+Liver+cirrhosis+mortality+in+the+United+States%3A+National%2C+State%2C+and+regional+trends%22">Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends</a>. , National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Bethesda, MD. 2000-2011 (2014).</li>
<li>Singal, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+frequency+and+outcomes+of+liver+transplantation+based+on+etiology+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease.</a> Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).</li>
<li>Louvet, A., Mathurin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+liver+disease%3A+mechanisms+of+injury+and+targeted+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).</li>
<li>Ki, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+treatment+ameliorates+alcoholic+liver+injury+in+a+murine+model+of+chronic-binge+ethanol+feeding%3A+role+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription+3%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3.</a> Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).</li>
<li>Tsuchiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstrain+differences+in+liver+injury+and+one-carbon+metabolism+in+alcohol-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice.</a> Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).</li>
<li>Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+ethanol+exposure+potentiates+lipopolysaccharide+liver+injury+despite+inhibiting+Jun+N-terminal+kinase+and+caspase+3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation.</a> J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).</li>
<li>Leo, M. A., Lieber, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+fibrosis+after+long-term+administration+of+ethanol+and+moderate+vitamin+A+supplementation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat.</a> Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).</li>
<li>Tsukamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+and+progressive+steatosis+and+focal+necrosis+in+rat+liver+induced+by+continuous+intragastric+infusion+of+ethanol+and+low+fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet.</a> Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).</li>
<li>Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragastric+ethanol+infusion+model+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Intragastric ethanol infusion model in rodents.</a> Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).</li>
<li>Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drinks+like+a+fish%3A+using+zebrafish+to+understand+alcoholic+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease.</a> Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).</li>
<li>Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+hepatic+dysfunction+parameters+in+two+models+of+fatty+liver+disease+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae.</a> Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).</li>
<li>Lin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Animal+Model+for+Alcoholic+Liver+Disease+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish.</a> Zebrafish. , (2015).</li>
<li>Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+steatosis+in+response+to+acute+alcohol+exposure+in+zebrafish+requires+sterol+regulatory+element+binding+protein+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation.</a> Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).</li>
<li>Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+metabolism+and+oxidative+stress+are+required+for+unfolded+protein+response+activation+and+steatosis+in+zebrafish+with+alcoholic+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease.</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3407311/">The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. , (2012).</li>
<li>Lassen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+baculovirus+expression%2C+and+tissue+distribution+of+the+zebrafish+aldehyde+dehydrogenase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2.</a> Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).</li>
<li>Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+zebrafish+alcohol+dehydrogenases+share+common+ancestry+with+mammalian+class+I%2C+II%2C+IV%2C+and+V+alcohol+dehydrogenase+genes+but+have+distinct+functional+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics.</a> J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).</li>
<li>Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+signaling+facilitates+liver+repair+from+acute+ethanol-induced+injury+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish.</a> Dis Model Mech. , (2016).</li>
<li>Vonghia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+alcohol+intoxication%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Acute alcohol intoxication.</a> Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).</li>
<li>Wittekind, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+staining+for+routine+diagnostic+pathology+including+the+role+of+tannic+acid.+1.+Value+and+limitations+of+the+hematoxylin-eosin+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain.</a> Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cld.172/full">Histopathology of alcoholic liver disease.</a> Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).</li>
<li>Lorent, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Jagged-mediated+Notch+signaling+disrupts+zebrafish+biliary+development+and+generates+multi-organ+defects+compatible+with+an+Alagille+syndrome+phenocopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy.</a> Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).</li>
<li>Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Ethanol-induced+Fibrotic+Liver+Model+in+Zebrafish+to+Study+Progenitor+Cell-mediated+Hepatocyte+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li>
<li>Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daily+rhythms+of+lipid+metabolic+gene+expression+in+zebra+fish+liver%3A+Response+to+light%2Fdark+and+feeding+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Chronobiol+Int%22%5BJournal%5D)">Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles.</a> Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).</li>
<li>van der Velden, Y. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serine-threonine+kinase+LKB1+is+essential+for+survival+under+energetic+stress+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O protocolo atual descreve um procedimento detalhado para tratamento de etanol agudo em larvas de peixe-zebra e as análises histopatológicas subsequentes com coloração de H &amp; E. O tratamento agudo com etanol deve ser realizado não antes de 96 h após a fecundação, pois esta é a fase em que o fígado zebrafish começa a expressar enzimas metabolizadoras de álcool 13 . 2% de etanol é a dose máxima que as larvas podem tolerar 13 , 14 . As l...

A doença hepática alcoólica (ALD), que é causada pelo consumo excessivo de álcool, é uma das principais causas de morbidade e mortalidade relacionadas ao álcool. Nos Estados Unidos, quase metade das mortes por doença hepática envolve álcool 1 , e a ALD é responsável por quase 1 em cada 3 transplantes de fígado 2 . ALD tem um amplo espectro. A esteatose, que se caracteriza pelo excesso de acumulação de lípidos nos hepatócitos, ocorre no estágio inicial de consumo excessivo de álcool e é reversível após a cessação do uso de álcool. Sob a influência de fatores genéticos e ambientais ea ingestão contínua de álcool, a esteatose hepática pode evoluir para hepatite alcoólica e, eventualmente, cirrose 3 . Estudos usando os modelos de ALD de roedores forneceram insights substanciais sobre a doença, mas eles têm limitações (revisado na referência 3 ). A alimentação oral de uma dieta com álcool só causa esteatose em roedores 4 , &lt;/ Sup&gt; 5 . O desenvolvimento de inflamação e fibrose requer um segundo insulto 6 , 7 ou infusão intragástrica crônica, que é invasiva e tecnicamente desafiadora 8,9 . O tele-peixe-zebra também desenvolve lesão hepática em resposta ao tratamento crônico e álcool agudo 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . Em particular, o peixe-zebra larval representa um organismo modelo complementar atractivo no qual se estuda a lesão hepática alcoólica aguda 10 , 11 , 13 , 15 . O fígado zebrafish é funcional e produz enzimas-chave para o metabolismo de etanol por 4 dias(Dpf) 13,16,17. O etanol pode ser adicionado diretamente à água ea exposição a etanol a 2% por 24 h é suficiente para induzir esteatose hepática e respostas fibrogênicas em larvas de peixe-zebra 13,15. Tem sido relatado que o tratamento com etanol a 2% durante 24 horas resultou numa concentração de etanol tecidual de 80 mM em larvas de peixe-zebra 13 . Outros demonstraram que as larvas toleram esta concentração e que os fenotipos do fígado observados nos animais tratados são específicos da exposição ao etanol 11 , 13 , 15 , 18 . No entanto, como 80 mM é quase letal em seres humanos 19 , é importante avaliar a histologia do fígado do zebrafish tratado com etanol e deteImportância fisiológica para os seres humanos. O rápido desenvolvimento externo e translucência das larvas de peixe-zebra permitem caracterizar a ação do álcool no fígado em tempo real e em amostras fixas. A disponibilidade de linhas transgênicas fluorescentes específicas de células e os recentes avanços na microscopia confocal facilitam o estudo de como diferentes tipos de células hepáticas modificam sua morfologia e comportamento em resposta ao tratamento agudo com etanol 11,15. No entanto, a imagem confocal do peixe-zebra transgénico fluorescente não pode substituir completamente a coloração com Hematoxilina e Eosina (H &amp; E) quando se estuda a histologia do fígado. A marcação de todos os tipos de células hepáticas ao mesmo tempo utilizando peixes-zebra transgênicos requer a geração de linhas transgênicas individuais, cada uma rotulando um tipo de célula hepática com um fluoróforo único. A introdução de diferentes fundos transgênicos no mesmo peixe requerG gerações múltiplas, o que é demorado e oneroso. É necessária uma imunofluorescência adicional para detectar os componentes da matriz extracelular. A coloração de H &amp; E, por outro lado, rotula simultaneamente todos os tipos de células hepáticas e componentes de matriz extracelular, proporcionando assim uma visão geral do fígado 20 . Além disso, revela prontamente várias características histopatológicas de doenças hepáticas, tais como morte de hepatócitos, esteatose e fibrose. Embora H &amp; E é uma mancha de rotina na histologia do fígado de mamíferos, não é comumente usado na pesquisa de fígado zebrafish, eo protocolo é menos bem estabelecida. Este trabalho descreve um protocolo para tratamento de etanol agudo em larvas de peixe-zebra e para as análises histológicas de seguimento com coloração de H &amp; E. O protocolo de coloração de H &amp; E pode ser usado em todos os estudos de desenvolvimento e função do fígado. Além disso, as seções de parafina podem ser usadas para imuno-histoquímica, bem como para outrasIns na patologia hepática, incluindo a mancha tricrômica, mancha reticulina, etc.

<table><tbody><tr><td>Tubos de centrífuga de 1,5 mL</td><td>E & K Scientific</td><td>280150</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 mL</td><td>VWR International</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 mL</td><td>VWR International</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Etanol a 95% (EtOH)</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td> inflamável <td>Newcomer</td><td>Supply 10010A</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products International</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de rack de frasco de alumínio</td><td>Newcomer</td><td>Supply 5300JRK</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri bacteriológicas com tampa</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de biópsia</td><td>Simport</td><td>M476.1</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas carregadas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-16</td><td></td></tr><tr><td>Mídia de montagem transparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>8310-16</td><td>Pode ser substituída por outras mídias de montagem transparentes</td></tr><tr><td>Sais marinhos comerciais</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de micrótomo descartáveis</td> Microscópio de dissecação <td>Fisher Scientific</td><td>4280L</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica Mz 95</td><td></td></tr><tr><td>Processador de tecidos fechado</td><td>Leica Biosystems</td><td>ASP300 S</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de coloração de eosina-floxina</td><td>Newcomer Supply</td><td>1082A</td><td></td></tr><tr><td>Álcool etílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído inflamável, reagente ACS, 37 WT. % em H20, contém 10 - 15% de metanol como estabilizador (para evitar a polimerização)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>Suspeita de ser cancerígena; irritante</td></tr><tr><td>Formalina, tamponada, 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>Suspeita de ser cancerígena; irritante</td></tr><tr><td>Frasco de mídia graduada</td><td>VWR International</td><td>16159-520</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxilina</td><td>Poly Scientific R& D Corp.</td><td>s212</td><td>Moldes</td></tr> de <tr><td>histologia</td> irritante <td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Placa quente/agitador</td><td>VWR International</td><td>47751-148</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td> irritante <td>VWR International</td><td>97058-220</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de insulina</td><td>BD Medical</td><td>BD-309301</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio composto invertido</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>491912-9850-000</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Newcomer Supply</td><td>12094E</td><td>Azul</td></tr><tr><td>de metileno</td> inflamável <td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Micrótomo irritante</td></tr><tr><td></td><td>Leica Biosystems Leica</td><td>Jung BioCut 2035&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de nutatas</td><td>VWR International</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td>Suspeito de ser cancerígeno; pipeta de</td></tr><tr><td>Pasteur</td> irritante <td>VWR International</td><td>53283-916</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de pipeta (10 mL)</td><td>VWR International</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio, monobásico (KH2PO4)</td><td>Lâminas de barbear Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloração de slides</td><td>Grainger</td> 4A807 Kit de coloração de slides para recém-chegados Fornecimento <td>5300KIT</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Hidróxido de sódio (NaOH)Fisher <td></td></tr><tr><td></td><td> BioReagents</td><td>S318-500</td><td>Muito perigoso</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio, dibásico (Na2HPO4)</td><td>Filtro de aço inoxidável Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>(5 polegadas de diâmetro)</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>L0906045in</td><td></td></tr><tr><td>de tecido</td><td>Simport</td><td>M505.12</td><td></td></tr><tr><td>Centro de incorporação de tecido</td><td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>#5100</td><td></td></tr><tr><td>Limpadores de tecido, 1 camada</td><td>Fisher Scientific</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td><td>Fisher Scientific</td><td>137117M</td><td></td></tr><tr><td>Tricaína em pó/sal de metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>Tris base, padrão primário e tampão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de lavagem, baixa densidade polietileno, boca larga</td><td>Nalge Nunc International</td><td>2402-0750</td><td></td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>Irritante</td></tr></tbody></table>

análises histológicas de lesão hepática alcoólica aguda em peixe-zebra

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Doença hepática alcoólica (ALD) refere-se a danos ao fígado devido ao abuso de álcool agudo ou crônico. É uma das principais causas de morbidade e mortalidade relacionadas ao álcool e afeta mais de 2 milhões de pessoas nos Estados Unidos. Uma melhor compreensão dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes à lesão hepática induzida pelo álcool é crucial para o desenvolvimento de tratamento eficaz para a ALD. As larvas de peixe-zebra exibem esteatose hepática e fibrogênese após apenas 24 horas de exposição a etanol a 2%, tornando-as úteis para o estudo da lesão hepática alcoólica aguda. Este trabalho descreve o procedimento para tratamento de etanol agudo em larvas de peixe-zebra e mostra que causa esteatose e inchaço dos vasos sanguíneos hepáticos. Um protocolo detalhado para hematoxilina e Eosina (H &amp; E) coloração que é otimizado para a análise histológica do zebrafish larval do fígado, também é descrito. A coloração de H &amp; E tem várias vantagens únicas em relação à imunofluorescência,Er células e componentes extracelulares simultaneamente e pode facilmente detectar lesão hepática, como esteatose e fibrose. Dado o uso crescente de peixe-zebra na modelagem de toxinas e lesões hepáticas induzidas por vírus, bem como doenças hepáticas hereditárias, este protocolo serve de referência para as análises histológicas realizadas em todos estes estudos.

10% de formalina tamponada e 4% de paraformaldeído (PFA) são dois dos fixadores mais comuns utilizados para as práticas histológicas. Contudo, não proporcionam resultados de fixação óptimos para o tecido hepático do peixe-zebra ( Figura 1 e Tabela 1 ). A fixação com formalina a 10% ou PFA a 4% resulta frequentemente em retracções, criando grandes lacunas entre o fígado e os tecidos circundantes ( Figura 1A , <st...

Este protocolo descreve análises histológicas dos fígados de larvas de peixe-zebra que foram tratadas com etanol a 2% durante 24 h. Tal tratamento com etanol agudo resulta em esteatose hepática e inchaço da vasculatura hepática.

Análises histológicas de lesão hepática alcoólica aguda em peixe-zebra

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

O objetivo geral deste experimento é avaliar a histo-patologia do fígado de larvas de peixe-zebra causada por lesões agudas induzidas pelo etanol. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área das doenças hepáticas alcoólicas, como as características histológicas da lesão hepática alcoólica aguda e até que ponto as respostas do fígado de peixe-zebra à lesão alcoólica aguda se assemelham às observadas em humanos. A principal vantagem desta técnica é que o nosso tratamento com etanol induz respostas mais robustas do que outros métodos publicados.Além disso, nosso protocolo de histologia melhora a integridade tecidual nas seções. Comece selecionando até 40 larvas com 96 horas pós-fertilização com bexigas natatórias infladas, utilizando uma pipeta de Pasteur. Divida-as igualmente em dois novos recipientes de Petri.Remova o máximo possível da água residual dos ovos, depois adicione água de ovo contendo 2% de etanol a um recipiente na densidade de uma larva por mililitro. Adicione a mesma quantidade de água de ovo sem etanol ao outro recipiente para servir como controle. Mantenha as larvas controle e tratadas com etanol na sala de peixes por 24 horas.Após o período de 24 horas, colete as larvas em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, com não mais de 20 larvas por tubo. Enquanto trabalha na capela de exaustão química, remova o máximo possível do líquido das larvas e, em seguida, adicione pelo menos um mililitro do fixador de Dietrich. Deixe os peixes em fixação em um nutator à temperatura ambiente por pelo menos 24 horas.Coloque as cápsulas para tecidos e dois suportes azuis para biópsia por cápsula. Posicione um suporte para biópsia no fundo de cada cápsula. Identifique cada cápsula com lápis, indicando claramente a amostra.Enquanto trabalha na câmara de exaustão, remova o fixador dos tubos e lave as larvas três vezes, por cinco minutos cada vez, com um mililitro de PBS. Coloque os tubos em um agitador rotativo à temperatura ambiente durante as lavagens. Durante as lavagens, aqueça 3% de agarose em água usando um micro-ondas para derreter o sólido.Aqueça por 30 segundos de cada vez, observando cuidadosamente para minimizar a fervura. Após a dissolução, coloque o agarose líquido em uma placa aquecedora regulada para 90 graus Celsius com agitação suave. Utilizando uma pipeta de transferência, transfira até oito larvas para um molde plástico de histologia e remova o máximo possível de PBS.Usando uma pipeta de transferência com a ponta cortada, encha completamente o molde com agarose a 3%, depois use uma seringa de insulina para reunir as larvas no centro do molde e empurrá-las para o fundo. Para seções sagitais, posicione as larvas em linha com as cabeças voltadas para o topo do molde. Para garantir que os fígados estejam orientados de maneira consistente, gire as larvas de modo que o lado esquerdo do corpo fique voltado para baixo e encostado planamente no fundo do molde.Após deixar a agarose solidificar por quatro a cinco minutos, remova o bloco de agarose do molde e use uma lâmina de barbear para aparar a agarose ao redor das larvas. Coloque o bloco em pé e corte-o ao meio na espessura, de modo que o bloco final tenha aproximadamente dois a três milímetros de espessura. Transfira o pequeno bloco de agarose para a cassete de tecido preparada e coloque o segundo suporte de biópsia sobre o bloco.Feche a cápsula e coloque a cápsula completamente montada em um recipiente selável com etanol 70% recém-preparado em água bidestilada. Após a inclusão do tecido em parafina, use um micrótomo para remover o excesso de parafina que recobre o tecido, cortando cinco mícrons de cada vez até que o tecido seja exposto na superfície do bloco de parafina; em seguida, pare e descarte todos os cortes realizados. Mergulhe os blocos com a face voltada para baixo em PBS e mantenha-os a quatro graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, remova um bloco por vez do PBS e corte seções de cinco mícrons usando um micrótomo. Separe a fita de seções da lâmina puxando suavemente a última seção para longe da lâmina com pinça ou pincel. Use a pinça para pegar a fita pela última seção e transfira-a para um banho-maria a 42 graus Celsius.Deixe as fitas flutuarem na superfície da água por pelo menos cinco minutos. Use a pinça para separar seções em grupos menores, de modo a acomodá-las sobre as lâminas. Coloque uma lâmina carregada na água em um ângulo de 45 graus e posicione-a cuidadosamente sob o grupo de seções a ser coletado.Levante cuidadosamente a lâmina da água e permita que as seções aderem à lâmina. Remova com cuidado qualquer excesso de água das seções usando papel absorvente livre de fiapos. Coloque a lâmina em um porta-lâminas ou caixa.Continue a seccionar o bloco até que o tecido desejado tenha sido coletado. Ao finalizar, aqueça as lâminas em uma estufa ou incubadora a 55 graus Celsius por três a 16 horas para derreter a parafina. Após o tempo determinado, verifique se a parafina derreteu e deixe as lâminas esfriarem antes da coloração.Desparafinize as lâminas imergindo-as duas vezes em xilol a 100% durante 15 minutos cada vez, depois hidrate as lâminas por meio de um gradiente de etanol. Para cada solução, mergulhe de oito a dez vezes durante dois segundos por mergulho até que o líquido escorra limpo das lâminas. Coloque as lâminas em Hematoxilina Harris filtrada a 100% por quatro minutos.Após quatro minutos, transfira-os rapidamente de volta para o recipiente com água desionizada. Despeje água desionizada no canto traseiro do recipiente, o mais distante possível das seções. Esvazie o recipiente periodicamente até que a água não esteja mais roxa.Verifique rapidamente a intensidade da Hematoxilina em um microscópio estereoscópico usando luzes de pescoço de ganso. Retorne as lâminas para a Hematoxilina a 100% por um minuto, se for necessário um tempo maior de coloração. Uma vez obtida a coloração desejada com Hematoxilina, mergulhe as lâminas duas vezes em ácido clorídrico a 0,05%, e em seguida transfira-as imediatamente de volta para o recipiente com água desionizada limpa.Esvazie e encha novamente o recipiente com água duas vezes. Transfira as lâminas para dois recipientes contendo etanol a 95% por 30 segundos cada. Coloque as lâminas na solução de Eosina Y-Floxina B por dois minutos.Após os dois minutos, transfira as lâminas de volta ao recipiente anterior com etanol 95%, em seguida verifique a intensidade da coloração ao microscópio estereoscópico. Se a coloração não for suficiente, retorne à solução de eosina por 30 segundos. Repita conforme necessário.Quando a coloração da intensidade desejada for obtida, transfira as lâminas para isopropanol a 100% por 15 segundos. Substitua por isopropanol a 100% fresco e coloque as lâminas novamente no isopropanol por outros 15 segundos. Repita este processo por um total de seis lavagens com isopropanol.Após imergir em xilol a 100% por três minutos, retire um lâmina. Adicione meio de montagem suficiente para cobrir as seções e, em seguida, mergulhe a lâmina em xilol a 100%. Aplique uma lamínula sobre a lâmina e absorva o excesso de meio de montagem em uma toalha de papel até que apenas uma fina linha seja visível; depois, mergulhe um tecido no xilol e limpe o verso da lâmina para remover qualquer meio que tenha escorrido.Coloque a lâmina plana sobre uma superfície resistente, mas móvel, como um pedaço de papelão, e deixe o xilol evaporar na câmara de fluxo laminar por 10 minutos. Deixe as lâminas à temperatura ambiente durante a noite para permitir que o meio de montagem endureça antes da obtenção de imagens. Este fígado de larva de peixe-zebra com 120 horas pós-fertilização foi imerso no fixador de Dietrich à temperatura ambiente por 24 horas.O fixador de Dietrich proporciona a fixação ideal desse tecido. Com a fixação em formalina a 10%, os hepatócitos frequentemente perdem seu citoplasma. O tecido não é corado adequadamente com eosina e aparece roxo.Após a fixação com PFA a 4%, observam-se lacunas entre os hepatócitos. O PFA a 4% provoca a retração do tecido hepático, de modo que parece haver uma grande lacuna entre o fígado e os tecidos circundantes. A linha tracejada marca o limite dos tecidos circundantes.Esta imagem com maior aumento mostra a coloração com H&E do fígado de uma larva controle não tratada do tipo selvagem que participou de um estudo com tratamento de etanol. Novamente, este animal foi fixado com o fixador de Dietrich em 120 horas pós-fertilização. Esta imagem mostra o efeito do tratamento com 2% de etanol das 96 às 120 horas pós-fertilização sobre o fígado.Este tratamento agudo com etanol provoca esteatose hepática e inchaço dos vasos sanguíneos. As setas indicam os hepatócitos com deposição excessiva de gotículas arredondadas, e os asteriscos marcam os vasos sanguíneos hepáticos inchados. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de aplicar o tratamento com etanol em uma instalação para peixes com ciclo claro-escuro.Para H&E, utilize o fixador de Dietrich para uma preservação ideal do tecido. Lembre-se também de verificar frequentemente a intensidade da coloração para evitar coloração excessiva ou insuficiente.

histological-analyses-of-acute-alcoholic-liver-injury-in-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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