Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

O objetivo geral desta invenção é estudar os efeitos da hipóxia ou hiperóxia nos tecidos embrionários de qualquer organismo aquático de interesse. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do desenvolvimento e celular, como restrição de crescimento embrionário, hipóxia fetal, adaptação em alta altitude, obesidade e desenvolvimento de tumores sólidos. As principais vantagens desta técnica são a simplicidade, custo-benefício e robustez.

Permite a indução e sustentação de hipóxia in vivo por longos períodos de tempo. Depois de coletar e criar embriões de xenopus e peixe-zebra, prepare uma placa de 24 poços com fundo de malha de acordo com o protocolo de texto. Prenda hastes de plástico à placa de 24 poços com fundo de malha e coloque-a no tanque aquático de sua escolha e, em seguida, usando tubos de silicone, conecte um tanque de gás com a mistura de nitrogênio de oxigênio desejada ou outra mistura de gás de sua escolha a uma válvula distribuidora usando um regulador de gás apropriado.

Em seguida, conecte o tubo de silicone e a válvula distribuidora a um difusor de disco cerâmico dentro do tanque aquático. Dependendo do tipo de embriões usados no experimento, encha o tanque da câmara hipóxica com o meio embrionário apropriado, feche o tanque aquático e use graxa de silicone para revestir a tampa e selá-la cuidadosamente. Comece a difundir a mistura de gases através do difusor de disco cerâmico.

Deixe o sistema se equilibrar por 10 a 15 minutos. Ajuste a taxa de fluxo de oxigênio no meio da câmara para 0,0017 a 0,0019 metros cúbicos por segundo. Sob esta taxa de fluxo de gás, nenhuma perturbação do meio deve ser vista nos poços da placa.

A vazão de oxigênio depende da pressão interna do tanque de gás e da pressão de saída do regulador de gás. Ambos os parâmetros devem ser ajustados de acordo com o monitor do regulador de gás. Após o equilíbrio, use um oxímetro ou sonda de oxigênio para medir a concentração de oxigênio na água.

Se for necessária uma temperatura não ambiente específica, coloque a câmara hipóxica em uma incubadora de laboratório com a temperatura necessária. Selecione cuidadosamente os embriões para o experimento usando embriões inteiros e vivos para incubação de hipóxia. Coloque as placas de embriões na incubadora que contém a câmara de incubação de gás e deixe-as equilibrar à temperatura da incubadora.

Em seguida, use uma pipeta de plástico para transferir cuidadosamente os embriões para os poços da placa de malha de 24 poços da câmara de incubação de gás. Rotule cuidadosamente os poços com diferentes genótipos. Garanta a reoxigenação mínima da câmara enquanto coloca os embriões nos poços.

Transfira a amostra rapidamente e feche rapidamente a câmara. Manter a câmara de incubação de gases sob uma infusão constante com a mistura de gases escolhida por cinco horas ou por um período mais longo que se adapte ao experimento. Uma mistura de 5% de oxigênio e 95% de nitrogênio é usada aqui.

Transferir cuidadosamente os embriões da câmara de incubação de gás de volta para o meio normóxico correspondente ao tipo de embrião. Depois de preparar tampões e meios e anestesiar os embriões de acordo com o protocolo de texto, use um homogeneizador de tecidos ou um sonicador para homogeneizar o tecido embrionário. Em seguida, centrifugue os homogeneizados para remover os detritos.

Colete o sobrenadante e desnature a amostra a 85 graus Celsius por cinco minutos, em seguida, adicione o tampão de carregamento de gel Laemmli a um X volume por volume. Use o sobrenadante para análise de western blot ou congele as amostras a 20 graus Celsius negativos. Para incorporar EdU nos embriões, encha a câmara de incubação de gás com 400 a 500 mililitros de solução de EuD de cinco milimolares suplementada com 1% de volume por volume de DMSO.

Conecte a tubulação de gás ao cilindro de gás contendo uma mistura de gás de 5% de oxigênio e 95% de nitrogênio. Incube a solução por 15 minutos. Pré-equilibre a solução com a mesma mistura de gases usada no experimento por 15 minutos antes do experimento.

Transferir os embriões para a câmara hipóxica, distribuindo-os uniformemente entre os poços, e incubar os embriões por duas horas. Por fim, analise os embriões para incorporação de EdU de acordo com o protocolo de texto. Conforme mostrado nesta tabela, as concentrações de oxigênio desejadas no meio de incubação foram induzidas em diferentes momentos ao longo dos experimentos, conforme monitorado por um sensor de oxigênio de fibra óptica.

Neste experimento, o HIF-1 alfa, que é estabilizado sob baixas concentrações de oxigênio, foi medido em lisados de embriões de rãs inteiros mantidos sob concentrações normais de oxigênio, ou submetidos a 5% de hipóxia e em lisados de suas retinas isoladas. Em ambas as amostras, o HIF-1 alfa foi estabilizado sob hipóxia. Aqui, embriões de sapo e peixe-zebra foram incubados em uma câmara hipóxica mantida a 5% de oxigênio, e a proliferação da retina foi avaliada pelo monitoramento da incorporação de EdU.

Como esperado, as retinas de controle normóxico de embriões de rã e peixe-zebra mostraram coloração intensa na CMZ, onde residem os progenitores em proliferação. Após a incubação de oxigênio na câmara hipóxica, foi observada uma forte diminuição na proliferação do progenitor CMZ em embriões de rã e peixe-zebra. Ao realizar um curso de tempo, pôde-se demonstrar que a diminuição da proliferação de progenitores retinianos foi aguda e maior em duas horas, e persistiu por muitas horas enquanto os embriões se desenvolviam normalmente de acordo com seu estágio de desenvolvimento.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 minutos se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de garantir a taxa de fluxo de gás correta e evitar a reabertura desnecessária e excessivamente longa da câmara. Após este procedimento, outros métodos como QPCR podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como ativação ou regulação negativa de certos genes-alvo de HIF-1 alfa e hipóxia ou hiperóxia, respectivamente.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores no campo da biologia do desenvolvimento explorarem a proliferação e hipóxia das células da retina e a nutrição restrita em embriões de sapo e peixe-zebra. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir hipóxia ou hiperóxia em qualquer organismo aquático e como estudar seus efeitos no tecido e fenômeno de interesse, como a proliferação de células da retina. Não se esqueça de que trabalhar com misturas de gás oxigênio pode ser extremamente perigoso, e precauções como garantir o uso correto e a fixação de reguladores de gás devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.