Name: Uma abordagem padronizada para a purificação multiespecífica de células germinais masculinas de mamíferos por dissociação mecânica do tecido e citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprenda a purificar células germinativas masculinas de mamíferos usando dissociação mecânica e citometria de fluxo. Este protocolo padronizado facilita estudos comparativos de espermatogênese em várias espécies.

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Os autores agradecem o Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) para testículos para cães; Jason Arand e o laboratório do Dr. Ted Cicero na Universidade de Washington em St. Louis (WashU) para fornecer testículos de ratos e Brianne Tabers para ajudar com a coleção; Jared Hartsock e Dr. Salt&#39;s Lab em WashU para os testículos de cobaia; E o Dr. Michael Talcott na Divisão de Medicina Comparada da WashU para o testículo em porco em miniatura. Os autores também reconhecem o Alvin J. Siteman Cancer Center na Escola de Medicina da Universidade de Washington e Barnes-Jewish Hospital em St. Louis, MO, pelo uso do Siteman Flow Cytometry Core, que forneceu o serviço de classificação de células operado pelo pessoal. O Siteman Cancer Center é apoiado em parte pelo NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842. Esta pesquisa foi financiada por uma bolsa de doutorado da FCT [SFRH / BD / 51695/2011 a ACL], doações dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos [R01HD078641 e R01MH101810 a DFC] e um contrato de pesquisa FCT [IF / 01262/2014 para AML].

Todos os procedimentos descritos abaixo obedeceram aos regulamentos do Comitê de Estudos Animais da Universidade de Washington em St. Louis. 1. Preparações para o protocolo de dissociação mecânica <ol><li> Pré-molhar um cartucho de desagregação de tecido descartable de 50 μm para a dissociação de um testículo murino inteiro. NOTA: Este cartucho de desagregação de tecido descartable contém micro-lâminas projetadas para cortar tecidos e uma malha de aço imobilizada com aproximadamente 100 furos hexagonais. Diferentes tamanhos de malha para cartucho de desagregação de tecidos estão disponíveis para adaptar este protocolo com base em espécies e tipos de células desejados. Foram utilizados cartuchos de 50 μm para todas as espécies de mamíferos mencionadas neste artigo. <ol><li> Carregue 1 mL de vermelho de fenol gelado de forma livre 1 Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) no cartucho de desagregação de tecido descartable de 50 μm. NOTA: O vermelho fenol pode interferir com a detecção de fluorescência vermelhaDurante FACS. </li><li> Aspirar 1x DMEM do cartucho de desagregação de tecido com uma seringa descartável de 3 mL sem agulha da porta da seringa. </li></ol></li><li> Ligue o sistema de desagregação de tecido pressionando o botão &quot;ON&quot;. Este sistema não requer tempo de &quot;aquecimento&quot;. </li><li> Pré-molhar três filtros descartáveis ​​de 40 μm com gelo gelado 1x DMEM. Coloque cada filtro descartable de 40 μm em um tubo cônico de 50 mL. Pipetar 1 mL de 1x DMEM e permitir a passagem do líquido. </li><li> Prepare uma placa de Petri de 100 mm x 15 mm para a coleta de tecidos testiculares. Pipetar 500 μL de 1x DMEM na placa de Petri. </li></ol> 2. Preparação do Tecido Testicular para o Protocolo de Dissociação Mecânica <ol><li> Dissece um rato macho para remover cuidadosamente os testículos inteiros frescos ou fragmentos testiculares (se estiver lidando com outras espécies de mamíferos) com tesoura cirúrgica e fórceps. NOTA: Certifique-se de que os tecidos não tenham gordura e necrose. Fr<html> Os tecidos testiculares produzem qualidade de suspensão de célula única superior à dos tecidos congelados. <ol><li> Transferir os testículos / fragmentos coletados para a placa de Petri 100 mm x 15 mm preparada contendo 500 μL de 1x DMEM. </li><li> Lavar suavemente o tecido em 1x DMEM para remover os glóbulos vermelhos (se presente). </li></ol></li><li> Remova cuidadosamente a túnica albugínea. A espessura da túnica albugínea variará em diferentes espécies. <ol><li> Pegue uma extremidade do testículo com fórceps. </li><li> Punteie a outra extremidade do testículo com um bisturi enquanto ainda segura a extremidade do testículo com fórceps do passo anterior. </li><li> Raspe os túbulos testiculares usando um bisturi enquanto ainda segura a extremidade do testículo com fórceps do Passo 2.2.1. </li></ol></li><li> Corte os túbulos testiculares em pedaços de ~ 2-3 mm 3 usando um bisturi. </li></ol> 3. Obtendo suspensões de célula única por dissociação mecânica de tecido testicular NOTA: As etapas de dissociação descritas abaixo são para um testículo de rato adulto. Os volumes de tecidos testiculares de camundongos juvenis ou de espécies não murinas devem ser ajustados em conformidade. Os animais juvenis podem não conter todos os estágios das células germinativas. Algumas espécies de mamíferos têm A composição do tecido testicular muda durante as estações de reprodução em comparação com a estação não associada. <ol><li> Transfira as pequenas peças de túbulo testicular para o cartucho de desagregação de tecido pré-molhado de 50 μm usando fórceps e adicione 1 mL de 1x DMEM. </li><li> Coloque o cartucho de desagregação de tecido no sistema de desagregação de tecido e processe durante 5 minutos, girando o botão do modo &quot;standby&quot; para &quot;executar&quot;. </li><li> Remova o cartucho de desagregação de tecido do sistema de desagregação de tecido e aspirar a suspensão celular com uma seringa descartável de 3 mL sem agulha da porta da seringa. <ol><li> Aspirar algumas vezes para remover todo o líquido do cartucho de desagregação de tecido. NãoTodos os 1 ml podem ser recuperados a partir do cartucho de desagregação de tecido. </li></ol></li><li> Passe a suspensão de células aspiradas através de dois filtros descartáveis ​​pré-humedecidos de 40 μm. Filtre duas vezes para remover todos os agregados celulares. <ol><li> Coloque um filtro pré-molhado de 40 μm em um tubo cônico de 50 mL. Adicione diretamente células aspiradas na seringa ao filtro de 40 μm. Pipetar a suspensão de célula única através de uma pipeta descartável. </li><li> Remova o filtro pré-molhado usado de 40 μm e coloque outro filtro pré-humedecido de 40 μm no tubo cônico de 50 mL. Pipetar a suspensão de célula única coletada no filtro limpo de 40 μm. </li><li> Colete a suspensão de célula única filtrada com uma pipeta descartavel descartável. </li></ol></li><li> Pipetar a suspensão celular filtrada de volta ao cartucho de desagregação de tecido de 50 μm e processar por mais 5 min em um sistema de desagregação de tecido. </li><li> Recupere todo o líquido da desagregação de tecidoNo cartucho. </li></ol> 4. Coloração com Hoechst e Iodeto de Propídio (PI) <ol><li> Transferir a suspensão celular recuperada do cartucho de desagregação de tecido de 50 μm para um tubo limpo de 1,5 mL. Aproximadamente 1-1,5 mL de suspensão de célula única serão recuperados. </li><li> Divida a suspensão de célula única recuperada em quatro tubos de 1,5 mL ou 5 mL. <ol><li> Para os primeiros três tubos, pipetar 150 μL de suspensão de célula única e reposição de pipeta de suspensão de célula única no último dos quatro tubos (aproximadamente 550 μL de suspensão de célula única). NOTA: A quantidade de suspensão de célula única no último tubo pode variar com base na eficiência da recuperação da suspensão celular no passo 3.6. </li></ol></li><li> Coloque o primeiro tubo dos quatro tubos como um controle não cortado para a sessão FACS. </li><li> Prepare suspensões de células manchadas de corante simples (PI ou Hoechst) como controles. Adicione 2,5 μL de Hoechst ou 1 μL de PI a cada tubo (segundo e thiRd). </li><li> Prepare um tubo de dois corantes. Isso será usado para coletar subpopulações de células germinativas. Adicione 2,5 μL de Hoechst e 1 μL de PI ao último tubo. NOTA: Hoechst tem uma vida útil de 2-3 meses. O uso de estoques mais antigos de tintas causará alterações significativas durante a sessão FACS. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 30 min no escuro. Coloque as amostras em um rotador de tubo ou inverta os tubos de 1,5 mL a cada 5-10 minutos. </li><li> Filtra a suspensão celular com um filtro pré-molhado de 40 μm e mantém a solução filtrada no gelo e no escuro até a sessão FACS. NOTA: O passo de filtração é necessário para prevenir aglomerados de células para FACS. Além disso, o tratamento com a DNase (ver Figura 1 ) ou o sal dipotássico do ácido 2-Naftol-6,8-disulfónico (NDA 20 ) pode ser usado para limitar o aglomerado celular. Períodos de espera prolongados afetarão o sinal fluorescente detectado durante FACS e podem resultar em morte celular aumentada. </li&gt; </ol> 5. Configuração de células ativadas de fluorescência (FACS) e purificação de células testiculares <ol><li> Prepare os tubos coletores FACS. <ol><li> Armazene 5 ml de tubos de polipropileno de fundo redondo ou tubos de 1,5 mL com 400 μL de FBS para coleta celular. Decanta o excesso de FBS após o revestimento. </li><li> Adicione o meio de coleta FACS (1x DMEM + 10% de soro bovino fetal, FBS) aos tubos: 1 mL para tubos de 5 mL ou 100 μL para tubos de 1,5 mL. </li></ol></li><li> Configure as condições de classificação apropriadas no classificador de células e no software. NOTA: Outras máquinas de classificação de células e software de análise podem ser usados ​​com as estratégias de configuração e gating semelhantes descritas abaixo. As condições aqui descritas foram adaptadas de Gaysinskaya e Bortvin 2 , Geisinger e Rodriguez-Casuriaga 3 , e Getun, et al. 4 <ol><li> Carregar um laser ultravioleta com 463/2Filtro de passagem de banda de 5 nm para detectar Hoechst azul e filtro de passagem de banda LP de 680 nm para detectar o Hoechst vermelho e para detectar PI. </li><li> Use um espelho dicroico 555DLP para distinguir o azul da fluorescência vermelha. </li><li> Use um bico de 70 μm e classifique as células a uma taxa de 1000-2000 células / segundo. NOTA: A eficiência de classificação é diretamente influenciada pelo caudal. Taxas de fluxo elevadas (&gt; 3500 eventos / s) aumentam a velocidade de triagem, mas resultam em contaminação das populações. Consulte a referência 12 para obter mais informações. </li></ol></li><li> Defina portas usando amostras de controle. <ol><li> Carregar e executar amostras não mantidas. </li><li> Exclua os detritos celulares com base no padrão de traço FSC vs SSC. Os resíduos de células aparecerão no quadrante inferior esquerdo da trama. Arbitrariamente, estabeleça o limite para detritos celulares pelo usuário ou pelo técnico de classificador de células. </li><li> Porta em células individuais ajustando o limite para FSC e largura de pulso. Diferentes classificadores de células têm diferentes maneiras de distinguirGuild single. À medida que a largura do pulso reflete as células do tempo para atravessar o laser, as células individuais têm valores mais baixos quando comparados aos agregados multicelulares. O limite de ajuste em um gráfico para FSC versus largura de pulso pode ser usado para selecionar para singlets. </li><li> Defina as tensões óptimas do tubo fotomultiplicador (PMT). </li><li> Use ambas as células coradas não coradas e sintadas para estabelecer o limiar do sinal de fluorescência PI ou Hoechst. NOTA: É importante otimizar as tensões de PTM de linha de base para as células de interesse, a fim de estabelecer a faixa de fluorescência adequada para cada corante. Isso é fundamental para a detecção e sensibilidade do sinal ideal. As células de controle coradas não manchadas e simples são usadas para estabelecer uma gama de células coradas negativamente e positivamente com corantes PI e / ou Hoechst e minimizar o ruído nos sinais. Para mais explicações sobre a otimização da tensão PMT usando células de controle, consulte Gaysinskaya e Bortvin 2 </li><li> Porta na célula vivaS com base na coloração PI (PI negativo) e na trama FSC. As células mortas serão positivas para a fluorescência PI. </li><li> Defina o portal de conteúdo de DNA, traçando um histograma de contagem de células com base na fluorescência Hoechst azul. Existirão 3 picos com concentrações crescentes de fluorescência Hoechst azul, representando células haplóides (1C), diploides (2C) e tetraploides (4C). Defina 3 portões, um para cada pico. </li><li> Observe pelo menos 500.000 eventos na trama FSC vs SSC antes de prosseguir para gating em populações de células germinativas. </li></ol></li><li> Portar diferentes populações de células germinativas. <ol><li> Carregar amostras manchadas Hoechst / PI. </li><li> Defina os primeiros 3 portões parentais comuns a todas as populações. <ol><li> Exclua os detritos celulares com base na trama FSC vs SSC. Selecione single com base no gráfico FSC vs loop de largura de pulso. Selecione células vivas bloqueando células PI negativas. </li></ol></li><li> Define o portão da espermatogonia. </li><li> Plot PI células negativas com base na fluorescência Hoechst azul e vermelhoIntensidades. A espermatogonia aparece como uma população lateral (ver Figura 1 ). </li><li> Defina portas para as demais populações de células germinativas. NOTA: Consulte a figura 1 e a figura 2 suplementar para detalhes visuais. </li><li> Plot PI células negativas em conteúdo de DNA portão. <ol><li> Para as espermátias, o pico com menor fluorescência Hoechst (1C). </li><li> Para os espermatócitos II, administre o pico com fluorescência Hoechst intermediária (2C). </li><li> Para os espermatócitos I, administre o pico com maior fluorescência Hoechst (4C). </li></ol></li><li> Trace a intensidade de fluorescência azul e vermelha Hoechst para refinar as populações de espermatócitos e espermátides dos portões de conteúdo de DNA. </li></ol></li><li> Coletar os portões de subpopulação selecionados para os tubos de coleta previamente preparados. Cada testículo terá uma média de 45 minutos para 1,5 h para coletar aproximadamente 0,5-6,0 x 10 6 células para cada subpopulação. NOTA: Exposição celular prolongada a Hoechst maDeslocar ligeiramente a localização das populações com o tempo. Atualize as configurações após 20-30 minutos de FACS. O rendimento máximo para cada subpopulação dependerá da eficiência do passo de dissociação. </li></ol> 6. Avaliação microscópica de células purificadas <ol><li> Células coletadas por centrifugação a 500-600 xg a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Re-suspender o sedimento celular com 1 mL de solução de tampão de fosfato 1x fosfatada (PBS) ou 1x DMEM. NOTA: O volume de re-suspensão pode ser ajustado de acordo com o número de células ordenadas e a concentração final desejada. </li><li> Pipetar 40 μL de células lavadas em uma corrediça de vidro limpa e colocar uma lamínula. </li><li> Corrigir as células restantes com 4% de paraformaldeído (PFA) e armazenar células fixas a 4 ° C no escuro para futuras referências. <ol><li> Pipetar 100 μL 4% de PFA diretamente nos tubos de coleta. </li><li> Em breve, vorteie os tubos ou a pipeta algumas vezes para assegurar uma boa mistura da suspensão celular. </li></ol></li><li> Visualize os slides preparados em um microscópio equipado com uma lâmpada UV para detectar fluorescência Hoechst sob um objetivo 63X. Consulte a seção Resultados - Avaliação morfológica de populações de células germinativas ordenadas - para obter mais detalhes sobre como identificar tipos específicos de células germinativas. </li></ol>

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Todos os autores declaram que não existem interesses concorrentes.

Considerando a dinâmica de cromatina altamente conservada durante a espermatogênese em mamíferos, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo para isolar células germinais masculinas em diferentes estádios de diferenciação de diferentes tecidos testiculares de mamíferos ( Figura 1 ). Um dos principais obstáculos na aplicação de um único fluxo de trabalho a diferentes modelos animais é a necessidade de ajustes específicos das espécies, especialmente no que diz respeito aos protoco...

Dada a falta de um sistema in vitro representativo da progressão da espermatogênese e a presença de grande heterogeneidade celular no testículo, estudos de biologia de células germinais masculinas requerem técnicas robustas para isolar populações enriquecidas de tipos específicos de células. A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) tem sido amplamente utilizada para este propósito 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , pois fornece alto rendimento e pureza e supera outros métodos de isolamento no número de tipos de células germinativas que ele pode identificar e Selecione 6 , 7 , 8 . O princípio da análise de citometria de fluxo baseia-se na detecção de padrões de luz diferencial após a excitação do raio laser de células isoladas. À medida que uma célula passa pelo laser reflete / dispersa a luzEm todos os ângulos, proporcional ao tamanho da célula (dispersão para frente, FSC) e à complexidade intracelular (dispersão lateral, SSC). Veja Ormerod 9 para obter informações detalhadas sobre citometria de fluxo. As células germinativas masculinas sofrem modificações específicas no conteúdo de DNA, estrutura da cromatina, tamanho e forma em diferentes estágios da espermatogênese. Assim, populações de células distintas podem ser identificadas e separadas pela combinação de dispersão de luz e coloração de DNA com corantes fluorescentes 10 , 11 . Vários corantes podem ser utilizados para este propósito (revisado em Geisinger e Rodriguez-Casuriaga 3 ), como Hoechst-33342 (Hoechst), que tem sido freqüentemente usado na análise de citometria de fluxo de células testiculares na última década 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN excitação com luz UV, Hoechst emite fluorescência azul proporcional ao conteúdo de DNA celular, enquanto a fluorescência vermelha distante reflete variabilidade na estrutura da cromatina e compactação 1 , 13 , 14 . Como resultado, as células germinativas masculinas em diferentes estádios de diferenciação exibem padrões específicos durante FACS de suspensões de células individuais manchadas com Hoechst (Ho-FACS; 1 , 12 ). Curiosamente, devido a um mecanismo de efluxo de corante que é apenas ativo durante o estágio espermatogônico, a intensidade da fluorescência Hoechst azul não é proporcional ao conteúdo de cromatina nessas células e se agrupa como uma população lateral durante Ho-FACS 15 . Além disso, combinar a coloração de Hoechst com o iodeto de propídio de corante não-permeante (PI) permite aos usuários discriminar em tempo real (PI negativo) de células mortas (PI positivas) durante FACS 1 &lt;Sup&gt;, 2 , 10 , 12 . Esta estratégia foi anteriormente utilizada em análises de citometria de fluxo de células germinativas testiculares e otimizada amplamente no mouse para discriminar até 9 tipos de células germinativas, incluindo células em 4 estádios diferentes da meiose I 1 , 2 , 4 , 16 . Para o propósito deste trabalho, a coloração Hoechst tem três vantagens principais. Primeiro, Ho-FACS foi aplicado com sucesso ao isolamento de células germinais masculinas no modelo de mouse 1 , 2 , 12 e outros roedores, como ratos e cobaias 17 , 18 , 19 . Segundo, o Hoechst é um tinte permeável às células e não requer a permeabilização da membrana, de modo que ele preserIntegridade das células. Finalmente, nenhum tratamento com RNase é necessário, uma vez que Hoechst se liga preferencialmente a sequências de DNA de poli (d [AT]) 1 , 20 , o que significa que o ARN é preservado e, além de DNA e proteínas, pode ser usado para estudos moleculares a jusante do germe diferenciação celular. Apesar da semelhança na ploidia de DNA e / ou mancha observada em análises de citometria de fluxo de espécies de mamíferos (revisadas em Geisinger e Rodriguez-Casuriaga 3 ), houve uma grande variabilidade nos protocolos descritos para isolamento de células germinativas masculinas por citometria de fluxo. Diferentes estudos empregaram protocolos específicos para a dissociação tecidual e utilizaram diferentes tipos de corantes de ligação ao DNA (isolados ou em combinação) e FACS em diferentes organismos modelo, principalmente o rato, o rato e a cobaia. Assim, a comparação direta de dados coletados para diferentes espécies pode ser afetada pelo tabacoArtefatos técnicos não produzidos resultantes da variabilidade entre metodologias. Importante, a conservação marcante da dinâmica da cromatina em toda a espermatogênese de mamíferos (2N-4N-2N-1N) sugere que um protocolo padronizado pode ser aplicado transversalmente a uma variedade de espécies de mamíferos. O objetivo deste estudo foi desenvolver um único fluxo de trabalho aplicável a diferentes espécies de mamíferos, combinando e adaptando as técnicas 2 , 20 anteriormente publicadas. A padronização de um método para o processamento de tecidos foi conseguida através da dissociação mecânica para superar a necessidade de ajustes específicos da espécie necessários para a digestão enzimática 5 . Vale ressaltar que a dissociação mecânica do tecido testicular de roedores mostrou-se melhor que a digestão de tecido enzimático 20 e Ho-FACS de suspensões de células individuais geradas por ambos os métodos.Resultados comparáveis 5 . Como prova de princípio, este protocolo descreve as configurações usadas para isolar até 5 populações de células germinativas: espermatogonia (SPG); Primários (SPC I) e espermatócitos secundários (SPC II) e espermátides (SPD) - redondo (rSPD) e alongamento (eSPD). Importante, é fácil de implementar no laboratório, sendo os principais requisitos o sistema de dissociação de tecidos e acesso a um classificador de células equipado com um laser UV. Este fluxo de trabalho ( Figura 1 ) é rápido e direto e permite o isolamento simultâneo de 4 populações de células germinativas a partir de tecido testicular fresco em menos de 2 h. O tempo de processamento reduzido é crucial para manter a integridade celular para outros procedimentos a jusante. Além disso, seu desempenho bem sucedido em 5 espécies diferentes sugere que poderia ser amplamente aplicado dentro do clade de mamíferos, tornando-o o método ideal para isolar células germinativas para estudos comparativos de mamíferos reprodutores masculinos biolOgy. Este protocolo é composto por três seções principais, além das etapas preparatórias: (1) a dissociação mecânica do tecido testicular e (2) a coloração das células testiculares com Hoechst e PI, seguido de (3) classificação FACS de células espermatogênicas relevantes. Uma vez recolhidos, estas populações enriquecidas de diferentes células germinativas testiculares de mamíferos podem ser usadas para uma ampla gama de aplicações. Este protocolo descreve um método de dissociação de &quot;tamanho único&quot; para purificar células germinais masculinas de diferentes espécies de mamíferos diferentes. Dependendo do tipo de estudo que os usuários desejam realizar com as células germinativas isoladas, outras mídias ou tampões podem ser usados. As seguintes etapas de protocolo são para gerar suspensões de células individuais de um testículo murino inteiro.

<table><tbody><tr><td>4% de paraformaldeído</td><td>VWR</td><td>#15710</td><td>4% PFA, Para fixação de células classificadas</td></tr><tr><td>Medimachine</td><td>BD Biosciences</td><td>#340588;</td><td>Sistema para dissociação testicular</td></tr><tr><td>1X Dulbecco modified Eagle medium</td><td>Life Technologies</td><td>#31053</td><td>DMEM, para dissociação de testículos</td></tr><tr><td>Medicon</td><td>BD Biosciences</td><td>#340591</td><td>Cartucho de desagregação para dissociação de testículos</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Thermo Scientific</td><td>#10082139</td><td>FBS, para coleção FACS</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>#H3570</td><td>Hoecsht, Para coloração</td></tr> <tr><td>FACS40 &micro; filtro de células m</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>#89508-342</td><td>Para dissociação testicular</td></tr><tr><td>100x 15 mm placa de Petri</td><td>Falcon</td><td>#351029</td><td>Para dissecção testicular</td></tr><tr><td>5 mL de tubos de polipropileno de fundo redondo</td><td>Falcon</td><td>#352063</td><td>Para coleta FACS</td></tr><tr><td>1,5 mL Eppendorf tubes</td><td>VWR</td><td>#20170-650</td><td>Para coleta FACS</td></tr><tr><td>3 mL seringa desnecessária</td><td>BD Biosciences</td><td>#309657</td><td>Para dissociação testicular</td></tr><tr><td>tubo cônico de 50 mL</td><td>MIDSCI</td><td></td>#C50R <td>Para dissociação testicular&nbsp;</td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Invitrogen</td><td>#L7011</td><td>PI, para coloração FACS</td></tr><tr><td>MoFlo Classificador de células legado</td><td>Beckman Coulter</td><td>#ML99030</td><td>Para FACS</td></tr><tr><td>Summit Cell Sorting software Beckman</td><td>Coulter</td><td>#ML99030</td><td>Para FACS</td></tr><tr><td>Fosfato tamponado solução salina</td><td>Thermo Scientific</td><td>#AM9625</td><td>PBS, Para microscopia</td></tr><tr><td>Lâmina de vidro microscópica</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12-544-4</td><td>Para microscopia</td></tr><tr><td>Lamínula de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12-548-87</td><td>Para microscopia</td></tr><tr><td>Pipeta de transferência descartável (3 mL)</td><td>Samco Scientific</td><td>#225</td><td>Para dissociação testicular</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>#10104159001</td><td>Para dissociação testicular</td></tr><tr><td>Lâmina cirúrgica de aço carbono</td><td>Miltex</td><td>#4-111</td><td>Para dissecção testicular</td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Countess</td><td>Invitrogen</td><td>#C10227</td><td>Para contagem automática de células</td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>#T8154</td><td>Para coloração de viabilidade</td></tr></tbody></table>

uma abordagem padronizada para a purificação multiespecífica de células germinais masculinas de mamíferos por dissociação mecânica do tecido e citometria de fluxo

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) foi um dos métodos de escolha para isolar populações enriquecidas de células germinativas testiculares de mamíferos. Atualmente, permite a discriminação de até 9 populações de células germinativas murinas com alto rendimento e pureza. Esta alta resolução em discriminação e purificação é possível devido a mudanças únicas na estrutura e na quantidade de cromatina durante a espermatogênese. Esses padrões podem ser capturados por citometria de fluxo de células germinativas masculinas coradas com corantes fluorescentes de ligação ao DNA tais como Hoechst-33342 (Hoechst). Aqui está uma descrição detalhada de um protocolo recentemente desenvolvido para isolar células germinativas testiculares de mamíferos. Resumidamente, as suspensões de células individuais são geradas a partir do tecido testicular por dissociação mecânica, coradas duas vezes com Hoechst e iodeto de propídio (PI) e processadas por citometria de fluxo. Uma estratégia de bloqueio em série, incluindo a seleção de células vivas (PI negativo) com conteúdo de DNA diferente (intensidade Hoechst), iS usados ​​durante a classificação FACS para discriminar até 5 tipos de células germinativas. Estes incluem, com purezas médias correspondentes (determinadas por avaliação microscópica): espermatozóides (66%), espermatites primários (71%) e secundários (85%) e espermátides (90%), mais separados em rodada (93%) e alongamento (87%) subpopulações. A execução de todo o fluxo de trabalho é direta, permite o isolamento de 4 tipos de células simultaneamente com a máquina FACS apropriada e pode ser realizada em menos de 2 h. Como o tempo de processamento reduzido é crucial para preservar a fisiologia das células ex vivo , esse método é ideal para estudos de alto débito a jusante da biologia de células germinativas masculinas. Além disso, um protocolo padronizado para a purificação multiespecífica de células germinais de mamíferos elimina fontes metodológicas de variáveis ​​e permite que um único conjunto de reagentes seja usado para diferentes modelos de animais.

Suspensões celulares simples da dissociação mecânica do tecido testicular A Figura 2 compara suspensões celulares únicas obtidas por dissociação mecânica do tecido testicular do rato em diferentes condições. As amostras obtidas por processamento de tecido fresco, não coradas ( Figura 2A ) ou coradas com Hoechst ( Figura 2B ), mostram a prese...

Este trabalho descreve a padronização de um método para obter populações de células germinativas purificadas a partir de tecido testicular de diferentes espécies de mamíferos. É um protocolo direto que combina dissociação mecânica com testículos, manchas com Hoechst-33342 e iodeto de propídio, e classificação FACS, com amplas aplicações em estudos comparativos de biologia reprodutiva masculina.

Uma abordagem padronizada para a purificação multiespecífica de células germinais masculinas de mamíferos por dissociação mecânica do tecido e citometria de fluxo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

O objetivo geral deste procedimento padronizado é isolar tipos distintos de células germinativas masculinas de diferentes espécies de mamíferos utilizando um único protocolo. Este método pode ajudar a facilitar o estudo molecular da espermatogênese por meio da análise de alto rendimento de diferentes tipos de células germinativas. A principal vantagem desta técnica é que um único conjunto de reagentes pode ser aplicado a várias espécies de mamíferos para o isolamento simultâneo de quatro populações diferentes de células germinativas masculinas.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando decidimos investigar a evolução de padrões específicos de regulação da expressão gênica em diferentes mamíferos. Chris Holley, um tecnólogo médico do Núcleo de Citometria de Fluxo Siteman, demonstrará como operar o classificador de células e definir as portas. Comece desencapsulando um único testículo murino e cortando o tecido em pequenos pedaços.Em seguida, use pin&ccedil;as para transferir pequenos fragmentos de tecido para um cartucho de desagrega&ccedil;&atilde;o de tecido de 50 micr&ocirc;metros previamente umedecido. Adicione um mililitro de meio DMEM ao cartucho e coloque o cartucho de desagrega&ccedil;&atilde;o de tecido no sistema de desagrega&ccedil;&atilde;o de tecido. Gire o bot&atilde;o de espera para execu&ccedil;&atilde;o e processe o tecido por cinco minutos.Em seguida, remova o cartucho e use uma seringa descartável de três mililitros para aspirar a suspensão celular pela porta da seringa. Quando todo o líquido tiver sido recuperado, filtre as células por meio de dois filtros individuais, descartáveis e previamente umedecidos de 40 micrômetros para remover quaisquer agregados celulares e retorne a suspensão ao cartucho de desagregação. Em seguida, processe as células por mais cinco minutos.Para corar as células para triagem de células ativadas por fluorescência, colete a suspensão celular dissociada em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, transfira 150 microlitros de células para cada um dos três novos tubos de 1,5 mililitro, adicionando o volume restante a um quarto tubo de 1,5 mililitro. Deixando o primeiro tubo de lado como controle não corado, adicione 2,5 microlitros de Hoechst ao segundo tubo, um microlitro de iodeto de propídio ao terceiro tubo e ambos Hoechst e iodeto de propídio ao quarto tubo.Após 30 minutos em temperatura ambiente, no escuro e com rotação suave, filtre as suspensões celulares através de filtros individuais de 40 micrômetros previamente umedecidos, direcionando-os para tubos cónicos de cinco mililitros. Em seguida, posicione quatro tubos de coleta contendo DMEM suplementado com soro bovino fetal sob os bicos de separação do citômetro de fluxo e carregue o tubo controle não corado para análise. Utilize um gráfico de dispersão frente versus dispersão lateral para excluir os detritos celulares e ajuste o limiar de dispersão frente e a largura do pulso para permitir o direcionamento das células individuais.O estreitamento rigoroso é crucial para otimizar a qualidade da amostra coletada. Garanta a seleção de células individuais excluindo detritos celulares e agregados multicelulares. Utilize as células coradas com corante único para estabelecer o limite de intensidade de fluorescência da Hoechst e do iodeto de propídio em relação à amostra não corada.Em seguida, carregue a amostra experimental duplamente corada e defina os três gates pais conforme acabou de ser demonstrado. Após definir os três gates pais, selecione as células viáveis com base na ausência de coloração por iodeto de propídio e determine o conteúdo de DNA traçando um histograma de contagem celular com base na fluorescência azul do Hoechst. Defina um gate para cada um dos três picos crescentes de concentração de fluorescência azul do Hoechst, representando as células haploides, diploides e tetraploides, e observe pelo menos 500.000 eventos no gráfico de dispersão frente versus dispersão lateral.Represente graficamente as células negativas para iodeto de propídio de acordo com suas intensidades de fluorescência azul e vermelha de Hoechst. Os espermatogônios aparecerão como uma população lateral. A intensidade da fluorescência azul de Hoechst correlaciona-se com o conteúdo de DNA.Portanto, definir este gate antes de gerar os gráficos de Hoechst azul e vermelho garante a seleção das células com a ploidia desejada. Para o isolamento de espermátides, delimite o pico haploide e selecione a população que aparece quando a fluorescência azul e vermelha de Hoechst são plotadas. Para o isolamento de espermatócitos II, delimite o pico diploide e selecione a população que aparece quando a fluorescência azul e vermelha de Hoechst são plotadas.Para o isolamento de espermatócitos I, selecione o pico tetraploide e escolha a população que aparece quando a fluorescência azul e vermelha do Hoechst são plotadas. Em seguida, separe as subpopulações selecionadas em tubos de coleta individuais para coletar aproximadamente 0,5 a seis vezes 10 à sexta potência de células para cada subconjunto celular. Suspensões celulares obtidas por dissociação mecânica de tecido fresco não corado ou corado com Hoechst demonstram a presença de células individuais em vários estágios de diferenciação.É importante destacar que as estruturas celulares parecem estar preservadas, incluindo os flagelos dos espermatozoides. Após a exclusão de detritos celulares, 95 a 98% das células são singletos, dos quais 86 a 93% estão vivos. A representação gráfica da função da fluorescência azul-vermelha do Hoechst durante a citometria de fluxo facilita a identificação de populações específicas de células germinativas testiculares.Como esperado, a população de espermátides haploides é a mais abundante, seguida pelas células espermátocitos II diplóides e pelos espermátocitos primários tetraplóides, um padrão que se conserva entre as espécies. A análise microscópica das células separadas revela que os espermatogônios exibem heterocromatina pericêntrica distinta, pequena e arredondada, que se cora intensamente com Hoechst. Os espermátocitos são células maiores e granuladas, com núcleos facilmente identificáveis que apresentam variações da cromatina características de células meióticas na subpopulação de espermátocitos I e núcleos nucleados ou diacines nos espermátocitos II.Os espermátides são pequenas células haploides com formato arredondado ou alongado que podem ser diferenciados dos espermatogônios pela presença de cromocentros localizados. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em duas horas, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o Hoechst é altamente sensível e genotóxico, e que a resolução das populações celulares pode ser melhorada com períodos de incubação mais longos, conforme necessário.Após este procedimento, métodos omicos de alto rendimento podem ser realizados para responder perguntas sobre modificações epigenéticas ou abundância e diversidade de transcritos e proteínas dentro de espécies de mamíferos em um contexto evolutivo. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da biologia reprodutiva masculina explorarem os mecanismos regulatórios que impulsionam a progressão da espermatogênese em várias espécies de mamíferos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como processar amostras testiculares para FACS com Hoechst e como identificar e isolar diferentes tipos de células germinativas masculinas com base em seu sinal de Hoechst.Corantes que se ligam ao DNA, como Hoechst e iodeto de propídio, podem ser extremamente perigosos. Use sempre equipamento de proteção individual ao manipular esses reagentes.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo descreve uma técnica simples e que economiza tempo para a dissociação de tecidos automatizado utilizando o Dissociator gentleMACS para preparar uma única célula suspensões de esplenócitos mouse.

Preparação de uma única célula Suspensões de Spleen rato com o Dissociator gentleMACS

Dissociar as células de tipos de tecido específico requer parâmetros específicos para a agitação do tecido para obter um volume elevado de viáveis, as células cultiváveis. A Miltenyi gentleMACS dissociator otimiza essa tarefa com um protocolo simples e prática. Nesta publicação o uso deste aparelho no tecido pulmonar é explicado.

Preparação padronizado de uma única célula Suspensões do tecido pulmonar do rato usando o Dissociator gentleMACS

Um método eficiente para obter altamente purificada viável frações meiótica de testículo do rato é descrito, que combina uma refinada célula dissociação protocolo com fluorescentes separação de células ativadas (FACS). Este método tira vantagem de diferenças no conteúdo de DNA nuclear e densidade de frações discretas meiótica.

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

Um protocolo de novo para a preparação de suspensões de células mecânica testiculares roedor a partir de material, evitando enzimas e detergentes, é descrito. O método é muito simples, rápida, reprodutível e processa boas suspensões de células de qualidade, os quais são adequados para a separação do fluxo e extracção de RNA.

Técnica simples e eficiente para a preparação de suspensões de células testiculares

O método STA-PUT permite a separação das diferentes populações de células espermatogénicas com base no tamanho e densidade.

A separação de tipos de células espermatogênicas Usando STA-PUT velocidade de sedimentação

Mutações de novo na linha germinativa masculina podem contribuir para resultados adversos à saúde nas gerações subsequentes. Aqui descrevemos um protocolo para o uso de um modelo de roedor transgênico para quantificar mutações em células germinativas masculinas induzidas por agentes ambientais.

Transgênicos Rodent Ensaio para Quantificação celular germinativas masculinas Mutant Frequency

Descrevemos uma estratégia de classificação para espermátides de camundongos usando citometria de fluxo. As espermátides são classificadas em quatro populações altamente puras, incluindo espermogênese redonda (etapas 1-9 da espermiogênese), alongamento precoce (etapas 10-12 da espermiogênese), alongamento tardio (etapas 13-14 da espermiogênese) e espermátides alongadas (etapas 15-16 da espermiogênese). A coloração, o tamanho e a granulosidade do DNA são usados como parâmetros de seleção.

Passo-específico Seleção de mouse Espermátides por citometria de fluxo

É apresentado aqui um protocolo para enriquecer spermatocytes do paquíteno, espermátides redondos, e espermátides alongando dos testículos adultos do rato usando um inclinação bovino descontínuo da densidade da albumina do soro com equipamento de laboratório padrão.

Enriquecimento de espermatócitos de Pachytene e Spermatids de testes de camundongo usando equipamento de laboratório padrão

Apresentamos um método de citometria de fluxo para identificar simultaneamente diferentes tipos de células recuperadas do cérebro do rato ou da medula espinhal. Este método poderia ser explorado para isolar ou caracterizar populações de células puras em doenças neurodegenerativas ou para quantificar a extensão das células que visam a administração in vivo de vetores virais ou nanopartículas.

Caracterização citométrica de fluxo simultâneo de múltiplos tipos de células recuperadas do cérebro do camundongo/medula espinhal através de diferentes métodos de homogeneização

Aqui, são descritos quatro métodos para a geração de organoides testiculares testiculares de células testiculares neonatais primárias, ou seja, matriz extracelular (ECM) e ambientes de cultura 2D e 3D livres de ECM. Essas técnicas possuem múltiplas aplicações de pesquisa e são especialmente úteis para estudar desenvolvimento testicular e fisiologia in vitro.

Geração extra-baseada em matriz celular e extra-celular livre de organoides testiculares de murina

Aqui apresentamos um método simples e eficiente para isolar células germinativas vivas e pós-meiotic de testículos de camundongos adultos. Usando uma baixa citotoxicidade, corante de DNA com proteção violeta e classificação celular ativada por fluorescência, pode-se isolar populações de células espermatogênicas altamente enriquecidas para muitas aplicações a jusante.

Isolamento de células spermatogênicas murinas usando um corante de ligação de DNA permeável celular-permeável violeta

Aprenda a purificar células germinativas masculinas de mamíferos usando dissociação mecânica e citometria de fluxo. Este protocolo padronizado facilita estudos comparativos de espermatogênese em várias espécies.

Uma abordagem padronizada para a purificação multiespecífica de células germinais masculinas de mamíferos por dissociação mecânica do tecido e citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal

Uma abordagem padronizada para a purificação multiespecífica de células germinais masculinas de mamíferos por dissociação mecânica do tecido e citometria de fluxo

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