Name: Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprenda a realizar imagem ao vivo por microscopia confocal da fusão do palato secundário em embriões de camundongo. Este protocolo permite observar processos celulares dinâmicos durante o desenvolvimento craniofacial em tempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a M. Douglas Benson por conversas iniciais sobre imagens de paladar secundário. Também reconhecemos David Castaneda-Castellanos (Leica) e Chris Rieken (Zeiss) por sua ajuda para ajustar as condições de imagem em microscopia confocal. Agradecemos Lynsey Hamilton (Bitplane) por sugestões úteis para análise quantitativa de imagens usando o software Imaris. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIDCR R01 DE025887.

Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com os protocolos da Universidade da Califórnia no Santian Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Preparação de mídia de imagem ao vivo <ol><li> Preparação de meios de cultura líquidos <ol><li> Adicionar 20% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina, 200 μg / mL de ácido L-ascórbico, 15 mM de HEPES para Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 meios de comunicação. NOTA: A mídia de imagem ao vivo foi feita logo antes da imagem. Esta mídia contém fenol-vermelho, o que pode levar à fototoxicidade em cursos longos de imagens ao vivo. Substituir por meios sem fenol-vermelho pode melhorar a imagem a longo prazo. </li></ol></li><li> Preparação de solução de agarose de baixo ponto de fusão <ol><li> Dissolver 350 mg de agarose de baixo ponto de fusão em 10 mL de água destilada autoclavada para fazer uma solução de reserva de 3,5%. </li><li> Misturar bem a solução de agarose e incubar a 70 ° C num banho de água para dissolver completamente a agarose. </li><li> Arrefecer a solução de agarose em um banho-maria a 37 ° C antes de adicioná-lo ao meio de imagem ao vivo. </li><li> Adicione 1 mL da solução de reserva de agarose a 5 mL dos meios de imagem vivos líquidos para formar uma concentração final (0,6%). </li><li> Mantenha a mídia com agarose em um banho de água a 37 ° C para evitar a solidificação prematura. </li></ol></li></ol> 2. Preparação do paladar Cultura explícita para imagens ao vivo <ol><li> Dissecção de prateleiras palatinas secundárias E14.5 recentemente aderidas NOTA: Em nossa experiência, a fusão de imagem requer começar com um par de prateleiras palatentas ligeiramente aderidas; Esta aderência evita movimentos de explantes que impedem que a fusão ocorra durante a imagem. <ol><li> Dissecre embriões em estágio E14.5 em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) e escolha a proteína fluorescente verde (GFP) - expressando (a partir deK14-cre; ROSA26-mTmG flox ) ou (Red fluorescente de proteína) RFP-expressando (a partir de Lifeact-mRFPruby ) embriões positivos usando um microscópio de dissecação equipado com lâmpadas fluorescentes. Transferir tecido para meios de cultura pré-aquecidos de imagem ao vivo sem agarose. </li><li> Corte a cabeça do embrião e remova a área superior do cérebro usando duas pinças finas No. 5 ( Figura 1 A-C ). Use uma pinça No. 5 para segurar o embrião enquanto as outras pinças No. 5 para cortar o tecido extra fora das prateleiras palatinas. NOTA: Tijolos finos podem ser usados ​​para cortar a cabeça do embrião (o primeiro passo) em vez de uma pinça No. 5. No entanto, duas pinças finas No. 5 darão um melhor controle para fazer cortes precisos. </li><li> Remova a mandíbula com cuidado sem danificar as prateleiras palatais, como mostrado na Figura 1 D e 1E . Para reduzir a chance de paladar prejudicial, mantenha a língua através da dissecção da mandíbula, fOllowed pela remoção cuidadosa da língua. </li><li> Depois de remover a mandíbula e a língua, examine o lado oral do paladar secundário com um estereomicroscópio com fluorescência para confirmar o forte sinal do repórter no MES ( Figura 1 M ). </li><li> Dissie as partes posteriores, incluindo o colo e o tronco cerebral após a remoção da mandíbula e da língua ( Figura 1 F ). </li><li> Remova ambas maxilas com prateleiras palatinas aderentes ( Figura 1 G ). </li><li> Corte o tecido do maxilar superior anterior, mantendo intactos o palato primário e secundário ( Figura 1 H e I ). </li><li> Remova o septo nasal no lado nasal do explante expondo o MES. NOTA: Estas etapas posteriores de dissecações precisam de atenção para não interromper os contatos entre duas prateleiras palatinas secundárias. A remoção do septo nasal ajuda aReduzir o sinal de fundo de outras áreas e também reduzir o movimento vertical do tecido, permitindo imagem estável ( Figura 1 J-L ). </li><li> Depois de dissecar as prateleiras palatais, examine novamente o sinal repórter da linha média para garantir que não haja danos na camada epitelial entre os tecidos. </li></ol></li><li> Configurando explantes de paladar em prato de cultura com mídia de imagem ao vivo <ol><li> Coloque mídia de imagem ao vivo em um prato de fundo de vidro de 35 mm. </li><li> Coloque as prateleiras palatinas dissecadas lado oral voltado para baixo o mais próximo possível do fundo de vidro para imagem com um microscópio confocal invertido ( Figura 1 N ). </li><li> Coloque pastilhas de gelo seco em uma superfície condutora próxima ao prato de cultura para acelerar a solidificação de agarose, diminuindo a temperatura rapidamente ou coloque o prato de cultura a 4 ° C. Uma placa fria, como uma usada para incorporação de parafina também poderia ser usada nessa sTage. NOTA: Quando o gelo seco é usado, a mudança de mídia de agarose precisa ser monitorada cuidadosamente para evitar a congelação de mídia. </li></ol></li></ol> 3. Confocal Time-lapse Imaging of Palate Explant <ol><li> Imagem e aquisição de dados <ol><li> Depois que a agarose foi semi-solidificada, monte o prato de cultura em um microscópio confocal invertido equipado com uma câmara de incubação de 37 ° C. Use um microscópio confocal de microscópio confocal de luz branca e um microscópio confocal de disco giratório de observação celular. NOTA: Utilizamos uma mídia modificada contendo HEPES 15 mM sem gás CO 2 . </li><li> Coloque vaselina entre o prato de cultura e cubra usando uma seringa para evitar a evaporação da mídia ( Figura 1 N ). NOTA: Alguma condensação em cima da cobertura do prato de cultura após a cultura durante a noite (O / N) ocorre, mas o volume de mídia não muda, sugerindo que a vaselina evita a evaporação da mídia. </li><li> Localize a região de interesse com objetivos de baixa ampliação (10x) e use objetivos de ampliação maiores (objetivo 20x com zoom digital 3x ou um objetivo 40x com Immersol W) para imagens ao vivo em tempo de lapso. NOTA: As prateleiras palatinas secundárias dissecadas não são planas. O paladar secundário é uma estrutura curvada e isso dificulta a imagem do MES inteiro no mesmo plano. A imagem de baixa ampliação (10x) pode permitir a imagem em palco inteiro, mas os objetivos de 40x proporcionam uma melhor resolução de imagem para examinar movimentos celulares detalhados em posições Z mais profundas. A curvatura é alta na região do palato médio. O paladar anterior e posterior são relativamente planos em comparação com o palato médio. Muitas vezes, imagem em direção a mid-anterior do paladar secundário para evitar regiões de maior curvatura. </li><li> Digitalize várias pilhas Z com 5 μm cada passo para 16-24 h usando excitação laser apropriada (488 nm para GFP e 532/561 nm para RFP) ( Figura 2 ). NOTA: Para reduzir a potencial fototoxicidade, use a potência mínima do laser e o tempo de exposição. Isto é importante especialmente no caso de imagens multicoloridas. Use 22% de potência laser de 552 nm para membranaTomato (mT), 30% de potência laser 495 nm para membranaGFP (mG) e 25% de potência laser de 561 nm para membrana RFP. O tempo médio de exposição foi de 550 ms. </li><li> Use o software de análise de imagem para realizar rastreamento celular e análise quantitativa. </li></ol></li></ol> 4. Análise da Imagem de Dados NOTA: Aqui, Imaris foi usado. Análises de dados semelhantes também podem ser realizadas com os pacotes de software ImageJ ou Volocity. <ol><li> Renderização de superfícies tridimensionais (3D) a partir de seqüências de imagens. NOTA: Esta seção permite a geração de uma superfície de um filme gerado com um sinal de membrana GFP. <ol><li> Clique em Editar | Mostre o ajuste da tela e use o controle deslizante de histograma para ajustar a intensidade do sinal de modo que o sinal da membrana seja transparenteO comprimento do filme ( Figura 3 A ). </li><li> Corrige o sinal branqueado usando Image Processamento | Correção de atenuação . Ajuste os valores Intensity Front e Intensity Back para que o sinal da membrana seja claro ao longo do tempo do filme. Alguns testes e erros podem ser necessários na configuração desses valores. NOTA: O valor Intensity Back (posição Z mais profunda) será menor do que o valor Intensity Front (Surface Z position) devido à penetração limitada do laser. Esses valores também podem ser alterados para normalizar a intensidade do sinal na série Z. Ambos os valores podem ser ajustados para obter correção de branqueamento. A correcção de atenuação também é chamada de correção de atenuação de emissão 19 . </li><li> Para gerar uma superfície a partir do sinal da membrana, selecione Surpass | Superfícies , escolha um canal de origem e um tipo de limite (Absolute Intensity) e sob Configurações de Algoritmo seLect Segmente apenas uma Região de Interesse E Processo de imagem inteira , finalmente , clicando na seta para a frente; Continue empurrando a seta para a frente (use as configurações padrão ou especifique os níveis de detalhe da área de superfície e o método de Threshold por teste e erro), verificando se a superfície gerada reflete o sinal de fluorescência. Para especificar uma Região de Interesse, selecione a região e o (s) tempo (s) a serem renderizados cortando as posições X, Y, Z. NOTA: selecione Processo de imagem inteira finalmente para que ajustes e limiares sejam aplicados em todo o filme. </li><li> Gere uma superfície clicando no botão de seta para a frente novamente. Em seguida, ajuste o limiar alterando o histograma em Filtros para corresponder ao sinal da membrana. </li><li> Após a geração da superfície, escolha a superfície em Superfícies / Configurações para visualizar o sinal de superfície e finalize o processo de geração de superfície, pressionando o forw duploArd botão de seta ( Figura 3 B ). </li><li> Vá para a superfície | Edite e clique em Mascarar tudo nas Propriedades de máscara para gerar uma imagem de canal em máscaras. </li><li> Depois de clicar em OK, a janela do canal de máscaras será aberta automaticamente; Selecione o canal GFP, defina voxels fora da superfície até o valor máximo da intensidade do sinal (encontrado no ajuste Editar | Exibição ) e voxels dentro da superfície para o valor mínimo de intensidade GFP (também encontrado em Editar | Ajuste da tela ), em configurações de máscara para gerar uma máscara do sinal da membrana. </li><li> À medida que a máscara do sinal de membrana será exibida na exibição de Volume , gere imagens invertidas usando o processamento de imagem | Mudança de contraste | Inverter ( Figura 3 C ). </li></ol></li><li> Detecção de pontos de imagens de superfície invertida. NOTA: Esta seção permite que o centro de cada célula sejaMarcado com um local único e rastreado em espaço e tempo. <ol><li> Selecione a cena de superação | Manchas | Criar ; Em Configurações de Algoritmo, selecione Segmento apenas uma Região de Interesse , Processo de imagem inteira finalmente e Pontos de Faixa (ao longo do tempo) . </li><li> Clique na seta para a frente e especifique uma Região de Interesse; Selecione a região e a (s) hora (s) para rastrear pontos; Continue empurrando a seta para a frente, escolha o canal mascarado como um canal fonte e determine o diâmetro XY estimado dos pontos. </li><li> Como clicar no botão de seta para a frente, irá abrir automaticamente uma janela de filtro; Ajuste o limite de detecção de pontos alterando valores no histograma para gerar pontos únicos no centro de cada célula ( Figura 3 D ). </li><li> Ao clicar no botão de seta para a frente novamente, abrirá a janela Algoritmo . Escolha o modelo de rastreamento de movimento autoregressivo 20 e especifique o máximo de rastreamento diPosição e tamanho máximo de espaço para conectar faixas que se tornam descontínuas por um curto período de tempo. </li><li> Ao clicar no botão de seta para a frente novamente, abrirá a janela Filtros, definirá o limite de duração da faixa, ajustando o histograma para que cada célula seja rastreada. Ao clicar no botão de seta para frente duplo finalizará a detecção de pontos. </li><li> Para corrigir a deriva do tecido, clique em Manchas | Track Editor e selecione Correct Drift . Uma janela Algoritmo será aberta automaticamente; Selecione a derivação translacional selecionada , inclua o resultado inteiro e corrija as posições dos objetos . </li></ol></li><li> Gerando gráficos vantajosos para análise quantitativa. NOTA: O Scatterplot do programa é uma ferramenta para gerar gráficos multidimensionais (X, Y, Z, Cor e Escala) com vários objetos. Essas parcelas são úteis para visualizar tendências de muitos movimentos celulares ao longo do tempo. <ol><li> Faça parcelas 2D ou 3D de dados de rastreamento celular usando oVantage-Add New Vantage plot menu ( Figura 3 E e 3F ). </li><li> Selecione Volume ou Pontos e Escolha Criar / Categoria e Tipo de Lote </li><li> Ajuste os valores do gráfico para gerar diferentes gráficos do Vantage. </li><li> Exporte gráficos usando a função Snapshot . NOTA: Os dados estatísticos também podem ser exportados como uma planilha para uma análise quantitativa adicional, clicando em Área de números de traçados | Salvar . </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ray, H. J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+tissue+fusion+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of tissue fusion during development.</a> Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).</li>
<li>Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palatal+fusion+-+where+do+the+midline+cells+go%3F+A+review+on+cleft+palate%2C+a+major+human+birth+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect.</a> Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).</li>
<li>Bush, J. O., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palatogenesis%3A+morphogenetic+and+molecular+mechanisms+of+secondary+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development.</a> Development. 139, 231-243 (2012).</li>
<li>Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+Molecular+Mechanisms+of+Palatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).</li>
<li>Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10433915">Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice.</a> Development. 126, 3869-3879 (1999).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+and+Extrusion+Are+Required+for+Normal+Fusion+of+the+Mammalian+Secondary+Palate%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate.</a> PLOS Biol. 13, 100122(2015).</li>
<li>Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periderm+cells+covering+palatal+shelves+have+tight+junctions+and+their+desquamation+reduces+the+polarity+of+palatal+shelf+epithelial+cells+in+palatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis.</a> Genes Cells. 17, 455-472 (2012).</li>
<li>Fitchett, J., Hay, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medial+edge+epithelium+transforms+to+mesenchyme+after+embryonic+palatal+shelves+fuse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse.</a> Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).</li>
<li>Akira, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+TGF-beta3+for+epithelial-mesenchyme+transdifferentiated+MEE+in+palatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Hist%22%5BJournal%5D)">The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis.</a> J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).</li>
<li>Sani, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate-mapping+of+the+epithelial+seam+during+palatal+fusion+rules+out+epithelial-mesenchymal+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation.</a> Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).</li>
<li>Jin, J. -Z., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+migration%2C+transdifferentiation+and+apoptosis+during+mouse+secondary+palate+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion.</a> Development. 133, 3341-3347 (2006).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+autonomous+requirement+for+Tgfbr2+in+the+disappearance+of+medial+edge+epithelium+during+palatal+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion.</a> Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).</li>
<li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://dev.biologists.org/content/develop/114/2/379.full.pdf">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy.</a> Development. 114, 379-388 (1992).</li>
<li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+growth+and+morphogenesis+of+the+tooth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth.</a> Development. 127, 4775-4785 (2000).</li>
<li>Eisenhoffer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crowding+induces+live+cell+extrusion+to+maintain+homeostatic+cell+numbers+in+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia.</a> Nature. 484, 501-546 (2012).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7, 168-169 (2010).</li>
<li>Can, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+correction+in+confocal+laser+microscopes%3A+a+novel+two-view+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach.</a> J Microsc. 211, (2003).</li>
<li>Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/899946/">Resolving motion correspondence for densely moving points.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).</li>
<li>Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141, 4406-4414 (2014).</li>
<li>Stoller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+mouse+expressing+a+nuclear+localized+fusion+of+GFP+and+beta-galactosidase+reveals+new+derivatives+of+Pax3-expressing+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors.</a> Genesis. 46, 200-204 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A imagem ao vivo da morfogênese do tecido com cultura de explante de órgãos 3D pode fornecer informações detalhadas sobre processos celulares que não podem ser mostrados na análise de coloração convencional de seções fixas de tecidos. Usando a cultura de explante in vitro do paladar secundário embrionário de rato, observamos vários comportamentos celulares interessantes, levando-nos a propor um novo mecanismo de fusão palatina que envolve convergência epitelial e extrusão celular. U...

A fusão de tecido é um passo importante no desenvolvimento de múltiplos órgãos. Principais defeitos de nascença humana, como fissura labial e palatina, espinha bífida e malformações do coração podem resultar de defeitos na fusão tecidual 1 . A fusão do palato secundário do rato foi amplamente estudada para identificar os mecanismos celulares e moleculares que controlam a fusão tecidual no desenvolvimento 2 , 3 , 4 . No mouse, o desenvolvimento do paladar secundário começa em torno de E11.5 com o crescimento de uma plataforma palatina secundária de cada um dos processos maxilares bilaterais. O crescimento inicial das prateleiras palatais ocorre verticalmente ao longo da língua, até aproximadamente E14.0, altura em que as prateleiras palatais se tornam elevadas horizontalmente acima da língua. O crescimento direcionado medialmente resulta em contato físico entre os epitélios que compõem as duas prateleiras palatinas, formando o epíteto da linha médiaAl seam (MES) em E14.5. O MES interveniente deve ser removido entre as prateleiras palatinas secundárias para permitir a confluência mesenquimatosa e o desenvolvimento de um palato secundário intacto e completamente fundido por E15.5 3 . Como uma camada de célula MES epitelial compartilhada é formada entre duas prateleiras palatais separadas e, em seguida, removida para alcançar a confluência mesenquimal, tem sido uma questão central no desenvolvimento do paladar. Com base em estudos de microscopia histológica e eletrônica de mouse (EM), estudos de cultura de explantes e experiências funcionais de genética de mouse, vários comportamentos celulares fundamentais foram implicados nesse processo. As projeções semelhantes a Filopodia do epitélio da margem mediana MEE de cada prateleira palatina facilitam o contato inicial 5 , 6 , seguido da intercalação dessas células epiteliais a um MES 6 compartilhado , 7 . Remoção do MES compartilhado resultanteFoi proposto prosseguir por três mecanismos não exclusivos. Estudos iniciais que utilizaram observação histológica e rastreamento de linhagem ex vivo com corantes vitais indicaram que o MES poderia ser removido por transição epitelial para mesenquimatosa (EMT) das células MES 8 , 9 , embora mais recentemente, o rastreamento genético das células epiteliais gerasse incerteza quanto à A contribuição a longo prazo das células epiteliais para o mesênquima palatino 10 , 11 , 12 . Um número significativo de células apoptóticas e uma redução em seu número em alguns mutantes que não sofrem fusão palatina adequada levaram à idéia de que a apoptose pode ser um grande motor da dissolução MES 2 , 3 . Finalmente, com base inicialmente em estudos envolvendo rotulagem epitelial e observação estática em pontos de tempo progressivos, células MESForam propostos para migrar nas dimensões oronasal e anteroposterior 11 , 13 , mas esses comportamentos celulares dinâmicos foram inicialmente não confirmados devido à incapacidade de observá-los no tecido palatal vivo. Recentemente, conseguimos observar diretamente esses comportamentos através do desenvolvimento de uma nova metodologia de imagem ao vivo que combina métodos genéticos de rótulos fluorescentes com imagens confocais ao vivo de prateleiras palatinas explantadas. Em primeiro lugar, para visualizar comportamentos dinâmicos celulares em células epiteliais de paladar durante a fusão paladar, geramos um rato repórter específica-epitelial por cruzamento de ratinhos ROSA26-mTmG flox com ratinhos Keratin14-cre 14, 15. Imagens vivas confocais da cultura explante de palato dos embriões resultantes confirmaram alguns comportamentos celulares previamente propostos e eventos de romance identificados no processo de fusão 6 </Sup&gt;. As protrusões da membrana celular epitelial precederam o contato inicial da célula-célula seguido de convergência epitelial por intercalação celular e deslocamento celular oronasal. Notavelmente, também descobrimos que a extrusão celular, um processo relatado para desempenhar papéis importantes na homeostase epitelial, foi um mecanismo importante que conduzia a fusão palatina secundária do mouse 6 , 16 . Este método de imagem pode ser usado com outras linhas repórter; Utilizamos ratos transgênicos Lifeact-mRFPruby 17 , 18 para examinar a dinâmica do citoesqueleto da actina durante o processo de fusão. Outros repórteres também podem ser empregados para observar outros aspectos específicos da fusão palatina e este método pode ser adaptado para microscopia confocal de microscopia confocal ou microscópio de disco giratório, dependendo das necessidades de imagem e da disponibilidade do microscópio. A imagem ao vivo está se tornando cada vez mais uma abordagem fundamental na biologia do desenvolvimento. PartiParticularmente, a morfogênese craniofacial é complexa e os defeitos congênitos humanos que afetam o rosto são comuns. Este método de imagem ao vivo confocal ajudará a melhorar a compreensão dos mecanismos básicos de desenvolvimento subjacentes, bem como a origem de anormalidades craniofaciais humanas.

<table><tbody><tr><td>< reagentes> fortes< / fortes ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DMEM / F12</td><td>Tecnologia da vida</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Tecnologia da vida</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Tecnologia da vida</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / estreptomicina</td><td>Life technology</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Agarose de baixo ponto de fusão</td><td>BioExpress</td><td>E-3111-125</td><td></td></tr><tr><td>Prato com fundo de vidro de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina (vaselina)</td><td>Sigma</td><td>16415-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratin14-cre</td><td></td><td>MGI: J:65294</td><td>Alelo = Tg(KRT14-cre)1Amc</td></tr><tr><td>ROSA26mTmG</td><td></td><td>MGI: J:124702</td><td>Alelo = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td></tr><tr><td>Lifeact-mRFPruby</td><td></td><td>MGI: J:164274</td><td>Alelo = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td></tr><tr><td><forte>Microscópio</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luz Branca SP5 microscópio confocal</td>Microscópio confocal de disco giratório <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>Cell Observer</td></tr></tbody></table>

imagem ao vivo do mouse fusão do palato secundário

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

A fusão das prateleiras palatinas secundárias para formar o palato secundário intacto é um processo chave no desenvolvimento de mamíferos e a sua ruptura pode levar ao palato secundário fissurado, uma anomalia congênita comum em humanos. A fusão secundária do palato tem sido amplamente estudada, levando a vários mecanismos celulares propostos que podem mediar esse processo. No entanto, esses estudos foram realizados principalmente em tecidos embrionários fixos em pontos de tempo progressivos durante o desenvolvimento ou em culturas de explantes fixas analisadas em pontos de tempo estáticos. A análise estática é limitada para a análise de processos morfogenéticos dinâmicos, como a fusão palatina e quais tipos de comportamentos celulares dinâmicos medeiam a fusão palatina, é incompletamente entendido. Aqui descrevemos um protocolo para imagens vivas da fusão de palato secundário ex vivo em embriões de camundongo. Para examinar os comportamentos celulares da fusão palatina, a queratin14 -cre específica do epitélio foi utilizada para rotular as células epiteliais do palato em ROSA26-mTmG embriões repórter flox . Para visualizar a actina filamentosa, utilizaram-se ratos repórter Lifeact-mRFPruby . A imagem viva da fusão secundária do palato foi realizada por dissecção de prateleiras palatais secundárias recentemente aderidas de embriões de dia embrionário (E) 14,5 embriões e cultura em meio contendo agarose em um prato de fundo de vidro para permitir a imagem com um microscópio confocal invertido. Usando esse método, detectamos uma variedade de novos comportamentos celulares durante a fusão palatina secundária. A percepção de como os comportamentos celulares distintos são coordenados no espaço e no tempo contribui grandemente para a nossa compreensão desse processo dinamométrico dinâmico. Este protocolo pode ser aplicado a linhas de mouse mutantes, ou culturas tratadas com inibidores farmacológicos para avançar a compreensão de como a fusão palatina secundária é controlada.

A imagem viva da cultura de explantes de palato revelou vários processos celulares que mediam a fusão palatina 6 . Os contatos iniciais entre duas células epiteliais são feitos por protrusões de membrana ( Figura 2 B-2E ). Quando duas camadas epitélias se encontram, elas formam um MES em camadas de células múltiplas seguido de intercalação para fazer uma MES de camada celular única integrada através da convergência ep...

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ao vivo da fusão do palato secundário do mouse usando microscopia confocal. Este protocolo pode ser usado em combinação com uma variedade de linhas de mouse repórter fluorescentes e com inibidores de via para visão mecanicista. Este protocolo pode ser adaptado para imagens ao vivo em outros sistemas de desenvolvimento.

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

O objetivo geral deste método de imagem confocal em tempo real é observar diretamente os processos celulares da fusão do palato secundário durante o desenvolvimento craniofacial. Comece separando a cabeça do corpo do embrião sob um microscópio estereoscópico em uma placa de Petri contendo PBS fresco, à temperatura ambiente. Segure a cabeça com um par de pinças finas número cinco e use um segundo par de pinças para remover o cérebro superior, cortando qualquer tecido adicional fora das prateleiras palatinas com outro par de pinças.Remova a mandíbula cuidadosamente sem danificar as prateleiras palatinas. Quando a mandíbula estiver destacada, remova cuidadosamente a língua e confirme a presença de um sinal robusto do marcador no fechamento epitelial mediano. É importante não danificar esse fechamento, como explicado durante a dissecação, para manter o fechamento epitelial mediano intacto.Em seguida, remova o cérebro posterior, o tronco encefálico e ambas as maxilas com as prateleiras palatinas aderidas. Corte o tecido da mandíbula superior anterior, mantendo intactos o palato primário e secundário. Remova o septo nasal no lado nasal do explante para expor a linha média da junção epitelial e confirme que a camada epitelial entre os tecidos está intacta.Agora, adicione o meio de imagem viva a uma placa de fundo de vidro de 35 milímetros e posicione as prateleiras palatinas dissecadas, com o lado oral voltado para baixo na placa, o mais próximo possível do fundo de vidro. Em seguida, coloque pelotas de gelo seco sobre uma superfície condutora próxima à placa de cultura para acelerar a solidificação da agarose dentro do meio de imagem. Quando a agarose estiver semi-sólida, monte a placa de cultura em um microscópio confocal invertido equipado com uma câmara de incubação a 37 graus celsius e use uma seringa para aplicar vaselina entre a placa de cultura e a tampa da cultura para evitar a evaporação do meio de imagem.Selecione uma objetiva de baixa ampliação para localizar a região de interesse. Em seguida, escolha uma objetiva de alta ampliação e realize a varredura de múltiplas pilhas z com passos de cinco mícrons durante 16 a 24 horas, utilizando a excitação a laser apropriada. O imageamento em tempo real de culturas de explantes de palato revela múltiplos processos celulares que medeiam a fusão palatina, sendo os contatos iniciais entre as duas células epiteliais estabelecidos por protrusões da membrana.Quando as duas camadas epiteliais se encontram, formam uma junção epitelial medial com múltiplas camadas celulares, seguida por intercalação para gerar uma camada celular única e integrada, a junção epitelial medial, por meio da convergência epitelial. As células epiteliais em níveis z mais profundos também são progressivamente deslocadas para o lado oral da junção epitelial medial, contribuindo para o processo de convergência epitelial. Observa-se migração celular direcionada para a região posterior na junção epitelial medial do palato médio.Com eventos de extrusão celular epitelial observados durante a fusão do palato, sugere-se que as células epiteliais na junção epitelial mediana possam ser removidas por meio desse processo ativo. Essa junção epitelial integrada acabará se degradando para alcançar a confluência. Além disso, a actina filamentosa se torna enriquecida na borda entre as áreas epitelial e mesenquimal, formando uma estrutura semelhante a um cabo ao longo do eixo anterior-posterior.Pode-se utilizar software para acompanhar comportamentos celulares específicos de interesse durante a fusão do palato, sendo o melhor método para o rastreamento celular dependente do sinal do marcador utilizado no experimento.

live-imaging-of-mouse-secondary-palate-fusion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Um método para controlar a fusão de células de organismos vivos ao longo do tempo é descrito. A abordagem utiliza...

A Cre-Lox Abordagem Recombinação P para Detecção de fusão celular In Vivo</em

Fonte: Pietruczyk, E. A., et al. Laminectomia e implantação de janela da medula espinhal no camundongo. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a implantação de uma janela da medula espinhal em um camundongo anestesiado para imagens in vivo. O protocolo estabiliza a medula espinhal exposta usando uma lamínula de borossilicato e uma placa traseira impressa em 3D. Este método permite a microscopia de dois fótons de alta resolução para estudar a dinâmica da barreira hematoencefálica e as...

Implantação de janela da medula espinhal em um camundongo para imagens in vivo

Neural mitose de células progenitoras é um parâmetro crítico da neurogénese. Muito do nosso entendimento da mitose progenitor neural é baseado na análise de tecido fixo. Imagens ao vivo em fatias de cérebro de embriões é uma técnica versátil para avaliar a mitose com resolução temporal e espacial de alta em um ambiente controlado.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Estudos de desenvolvimento palato são motivadas pela incidência de fenda palatina, um defeito de nascença que impõe uma carga tremenda de saúde e pode deixar desfiguração duradoura. Nós demonstramos aqui uma técnica para prateleiras palatinas cultura que podem ser utilizados para estudar diferentes vias de sinalização envolvidos no desenvolvimento do palato e de fusão.

Método de Estudar Palatal Fusão usando estático Órgão Cultura

Este protocolo descreve a detecção da migração de células-tronco periósteis periósteis mediadas pelo CCL5 em tempo real usando microscopia intravital animal viva.

Imagem em tempo real da migração induzida por CCL5 de células-tronco esqueléticas periósteis em camundongos

Apresentamos um protocolo de isolamento e cultura de células mesenquimais palatinas embrionárias primárias para imagens de lapso de tempo de crescimento bidimensional (2D) e ensaios de reparação de feridas. Também fornecemos a metodologia para análise dos dados de imagem de lapso de tempo para determinar a formação de fluxo celular e a motilidade direcional.

Isolamento e imagem de lapso de tempo das células mesenquima palatinas embrionárias do camundongo primário para analisar atributos de movimento coletivo

Este protocolo descreve uma nova janela de imagem mamária com uma tampa substituível (R.MIW). A microscopia intravital após a implantação do R.MIW permite imagens longitudinais e de vários dias da glândula mamária saudável e doente com resolução celular durante os diferentes estágios de desenvolvimento.

Microscopia intravital longitudinal usando uma janela de imagem mamária com tampa substituível

Este artigo descreve um procedimento passo a passo para o estabelecimento de um modelo de camundongos com fístula oronasal. A fístula oronasal foi criada empregando-se cautério oftalmológico aquecido para lesar a porção da linha média do palato duro, resultando na formação de uma abertura entre as cavidades oral e nasal.

Estabelecimento de um modelo de fístula oronasal em camundongos

A imagem por imunofluorescência é limitada pela capacidade de observar processos biológicos complexos e dependentes do tempo em apenas um único instantâneo no tempo. Este estudo descreve uma abordagem de imagem ao vivo conduzida em cortes de glândula submandibular de camundongos com corte preciso. Esta abordagem permite a observação em tempo real das interações célula-célula durante a homeostase e os processos de regeneração e reparo.

Interrogando interações célula-célula na glândula salivar via imagem de células vivas ex vivo

A imagem ao vivo ex vivo é uma técnica poderosa para estudar os processos dinâmicos de movimentos celulares e interações em tecidos vivos. Aqui, apresentamos um protocolo que implementa microscopia de dois fótons para rastrear células epiteliais dentárias vivas em incisivos adultos inteiros cultivados.

Usando imagens ao vivo ex vivo para investigar divisões celulares e movimentos durante a renovação dentária de camundongos

A tradução dos achados da microscopia intravital é desafiada por sua penetração em profundidade rasa no tecido. Aqui, descrevemos um modelo de camundongo com câmara de janela dorsal que permite o co-registro de microscopia intravital e modalidades de imagem clinicamente aplicáveis (por exemplo, TC, RM) para correlação espacial direta, potencialmente simplificando a tradução clínica dos achados da microscopia intravital.

Um modelo de camundongo tumoral de câmara de janela de dobra cutânea dorsal para microscopia intravital combinada e ressonância magnética na pesquisa translacional do câncer

Aprenda a realizar imagem ao vivo por microscopia confocal da fusão do palato secundário em embriões de camundongo. Este protocolo permite observar processos celulares dinâmicos durante o desenvolvimento craniofacial em tempo real.

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

Explorar mais vídeos