Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

O objetivo geral deste método de imagem confocal ao vivo é observar diretamente os processos celulares, a fusão secundária do palato durante o desenvolvimento facial craniano. Comece separando a cabeça do corpo do embrião sob um microscópio de dissecação em uma placa de Petri contendo PBS fresco em temperatura ambiente. Segure a cabeça com um par de pinças finas número cinco e use um segundo par de pinças para remover a parte superior do cérebro, cortando qualquer tecido extra fora das prateleiras palatinas com um segundo par de pinças.

Remova a mandíbula com cuidado sem danificar as prateleiras palatinas. Quando a mandíbula estiver descolada, remova cuidadosamente a língua e confirme a presença de um sinal repórter robusto na costura do epitélio da linha média. É importante não danificá-lo, explicou o palato durante a dissecção para manter intacta a costura do epitélio da linha média.

Em seguida, remova o cérebro posterior, o tronco cerebral e ambos os maxilos com as prateleiras palatinas aderidas. Corte o tecido anterior da mandíbula superior, mantendo intactos os palatos primário e secundário. Remova o septo nasal no lado nasal do explante para expor a costura do epitélio da linha média e confirme se a camada de epitélio entre o tecido está intacta.

Agora, adicione o meio de imagem ao vivo a um prato com fundo de vidro de 35 milímetros e coloque as prateleiras palatais dissecadas, com o lado oral voltado para baixo no prato o mais próximo possível do fundo do vidro. Em seguida, coloque pastilhas de gelo seco em uma superfície condutora perto da placa de cultura para acelerar a solidificação da agarose no meio de imagem. Quando a agarose estiver semissólida, monte a placa de cultura em um microscópio confocal invertido equipado com uma câmara de incubação de 37 graus Celsius e use uma seringa para aplicar vaselina entre a placa de cultura e a tampa de cultura para evitar a evaporação do meio de imagem.

Selecione uma objetiva de baixa ampliação para localizar a região de interesse. Em seguida, selecione uma objetiva de alta ampliação e escaneie várias pilhas z com etapas de cinco mícrons por 16 a 24 horas, usando a excitação a laser apropriada. A imagem ao vivo da cultura do explante de palato revela múltiplos processos celulares que medeiam a fusão do palato, com os contatos iniciais entre as duas células do epitélio sendo feitos por saliências de membrana.

Quando as duas camadas de epitélio se encontram, elas formam uma costura de epitélio de linha média em camadas multicelulares, seguida de intercalação para gerar uma camada de célula única integrada, costura de epitélio de linha média por meio da convergência de epitélios. As células do epitélio em níveis z mais profundos também são progressivamente deslocadas para o lado oral da costura do epitélio da linha média, contribuindo para o processo de convergência do epitélio. A migração celular direcionada posterior é observada na costura do epitélio da linha média do palato médio.

Com eventos de extrusão de células epiteliais observados durante a fusão do palato, sugerindo que as células epiteliais na costura do epitélio da linha média podem ser removidas por este processo ativo. Esta costura de epitélio integrada acabará por se quebrar para alcançar a confluência. Além disso, a actina filamentis torna-se enriquecida na fronteira entre as áreas do epitélio e do mazenkemo, formando uma estrutura semelhante a um cabo ao longo do eixo ântero-posterior.

O software pode ser usado para rastrear comportamentos celulares específicos de interesse, durante a fusão do palato com o melhor método para rastreamento celular, dependendo do sinal repórter usado no experimento.