Name: Na Vivo Ensaio para detecção de células T antígeno-específicas função citolítica usando um modelo de vacinação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Aprenda a detectar células T citolíticas antígeno-específicas em modelo murino usando ensaio in vivo. Este método permite avaliar rapidamente o potencial citolítico sem depender de crescimento tumoral ou infecção.

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Este trabalho é apoiado pela pesquisa de NIH (A1R03AI120027 (RN) e 1R21AI20012 (RN)), concessão de pesquisa institucional (RN), start-up conceder (RN) e semente de MD Anderson CIC concede (RN).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) do Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center e institucional Cuidado Animal.
1. preparação de peptídeo para a vacina
<ol><li>Dissolver o liofilizado peptídeo com fosfato salino (PBS) para a concentração adequada e vórtice para 30 s. Nota: Para hgp10025–33, a concentração final é de 1 mg/mL e para óvulos257–264, a concentração final é de 0,5 mg/mL. Reconstitua o peptídeo antes da injeção. Não guarde após reconstituição.</li>
</ol>2. isolamento de Splenocytes de rato transgénico
Nota: O isolamento de células do baço deve ser executado de forma estéril.
<ol><li>
Eutanásia o rato transgénico OT-1 usando o método de asfixia aprovado CO2 e remover o baço. Nota: Rato transgénico apropriado é utilizado nesta etapa específico para o peptídeo de escolha.<ol>
<li>Coloque o mouse do seu lado direito. Pulverize o lado esquerdo do mouse com 70% de etanol (EtOH). Puxe a pele usando fórceps e cortar a pele com uma tesoura cirúrgica; o baço será visível dentro da cavidade peritoneal. Delicadamente abri a cavidade peritoneal para acessar o baço. Remova o baço usando fórceps.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Desagregar o baço por colocá-lo em um filtro de 70 µm em uma placa de Petri com 2 mL de meio A (PBS com 1% de soro fetal bovino (FBS)) e o esmagamento do baço com o fim de um êmbolo.
	<ol>
<li>Recolha os splenocytes da placa de Petri e coloque em um tubo cónico de 50 mL. Lave o tubo de ensaio com 5 mL de meio A duas vezes para coletar todas as células. Adicionar meio um up de 25 mL e centrifugar as células durante 5 min à temperatura ambiente a 475 x g.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirar as células e ressuspender em 1 mL / por tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) baço. Incubar em temperatura ambiente por 5 min. adicionar 10 mL de meio A centrífuga à temperatura ambiente em 475 x g. resuspenda o pellet em 10 mL de meio A e remover detritos filtrando a suspensão de células através de um filtro de 70 µm em um limpo 50ml cónico.</li>
	<li>
Contar as células usando trypan azul e um hemocytometer. Ressuspender as células em PBS para uma concentração final de 106 -6 de 100 células/mL. Para óvulos257–264 específicos matando, resuspenda em 106 células/mL e para hgp10025–33 específicos matando, resuspenda em 1006 células/mL.
	<ol>
<li>Girar as células restantes à temperatura ambiente durante 5 min à 475 g. x aspirar o sobrenadante e ressuspender em 15 mL PBS fria para lavar as células. Repita a etapa de lavagem mais uma vez. Girar as células à temperatura ambiente durante 5 min à 475 g. x aspirar o sobrenadante e ressuspender em PBS fria de acordo com o volume final determinado na etapa 2.4.</li>
		<li>Suspensão de célula única de transferência para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e manter no gelo até injeção no destinatário C57/BL6 rato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. injeção de Splenocytes de ratos transgênicos
<ol><li>Coloque destinatário C57/BL6 rato em uma retenção com o lado dorsal. Pulverizar a superfície de base de cauda de injeção com álcool isopropílico a 70%. Administre 100 µ l de suspensão de célula única (secção 2) por via intravenosa na veia de cauda, utilizando uma agulha 27G com o lado de bisel voltado para cima.</li>
</ol>4. Covax administração
Nota: Se as células são injetadas no período do tarde, covax deve ser administrado na manhã seguinte até 18 horas após injeção de célula.
<ol><li>Coloque o mouse em uma caixa clara anestesia com isoflurano 1-3%. Depois que os ratos são totalmente anestesiados, transferi os ratos para os cones de nariz ligados ao colector da câmara de anestesia. Manter os ratos contidos com o lado dorsal acima. Nota: Anesthetization é confirmado por uma pitada de dedo breve para verificar se que uma resposta de retirada não é eliciada. A lei federal limita o uso de isoflurano na ordem de um veterinário licenciado.</li>
	<li>Pulverizar a superfície de base de cauda de injeção com álcool isopropílico a 70%. Injetar 100 µ l de solução de peptídeo (da seção 1) por via subcutânea com uma agulha de 27G com a seringa penetrando 4-5 mm na região base da cauda, a agulha cónica virados para cima. Nota: Os ratos são vacinados em um flanco com injeção subcutânea na base da cauda10.</li>
	<li>Injete 100 µ l anti-CD40 anticorpo (0,5 mg/mL de caldo) lateralmente o local da injeção de vacina.</li>
	<li>Aplique cuidadosamente imiquimod creme 50 mg/rato sobre os locais de vacinação. Esfregue o creme de imiquimod na superfície até que o creme não é mais visível e é totalmente absorvido.</li>
	<li>Injetar 100 µ l de proteína de 100.000 UI/mL rhIL-2 intraperitonealmente (i.p.) na região abdominal inferior. Observe os ratos por 5 min após eles recuperarem totalmente da anestesia. Nota: Experimento é uma pausa neste ponto por 3 dias.</li>
</ol>5. isolamento dos Splenocytes alvo para etiquetar com CFSE
Nota: O isolamento de células do baço deve ser executado de forma estéril.
<ol><li>Abater os camundongos C57BL/6 de acordo com o método de asfixia aprovado CO2 . Remova spleen(s) como na etapa 2.1.1. Desagregar o baço e lavar splenocytes como em passos 2.2.1 - 2.2.3. Lyse pilhas de sangue vermelhas como em etapas 2.3 - 2.3.2.</li>
	<li>Remova as células para a contagem usando um hemocytometer e calcular para uma concentração final de células em 106 células/mL em solução CFSE-rotulagem (descrita na etapa 7). Gire as células remanescentes à temperatura ambiente durante 5 min à 475 x sobrenadante de aspirado de g..</li>
</ol>6. o peptídeo pulsando de alvo Splenocytes
Nota: Peptídeo pulsando deve ser executada de maneira estéril.
<ol><li>Ressuspender as células em 106 células/mL em mídia completa (RPMI 1640 mídia com 10% FBS, 1% L-glutamina (Gln-L), 1% penicilina/estreptomicina (caneta/Strep)). Divida as células em 2 tubos (cônicas de 15 mL). Rotule cada tubo como pulsado ou unpulsed.</li>
	<li>
Adicione o peptídeo para o tubo rotulado pulsada. Para óvulos257–264 pulsando, adicionar 1 µ g/mL e para hgp10025–33 pulsando, adicionar 2 µ g/mL. Nota: As células unpulsed submeter-se a incubação mesma como as células pulsadas só que sem a adição do peptide.<ol>
<li>Incube as células + peptídeo a 37 ° C por 1h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar 10 mL de mídia completa (RPMI 1640 mídia com 10% FBS, 1% L-glutamina (Gln-L), 1% penicilina/estreptomicina (caneta/Strep)) para cada tubo de lavar ambos pulsado e unpulsed nas células-alvo. Gire as células remanescentes à temperatura ambiente durante 5 min à 475 x sobrenadante de aspirado de g..</li>
</ol>7. preparação de CFSE para etiquetar Splenocytes alvo
<ol><li>
Preparar a solução de criação de etiquetas CFSE durante a célula lavar na etapa 6.3; as células pulsadas serão rotuladas como CFSEOi e o unpulsed como CFSEEis. Prepare-se 1 mL de solução CFSE-rotulagem de 106 células. Nota: CFSE é sensível à luz e deve ser protegido da luz em todos os momentos.<ol>
<li>Preparar CFSEOi -rotulagem mídia adicionando 1 uL/mL CFSE (solução de 5 mM) para uma concentração final de 5 µM/mL na mídia RPMI 1640 com 2% FBS.</li>
		<li>Preparar CFSEEis -rotulagem mídia adicionando 1 uL/mL CFSE (solução 0,5 mM) para uma concentração final de 0,5 mídia µM/mL RPMI 1640 com 2% FBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. rotulagem dos Splenocytes alvo com CFSE
Nota: CFSE rotulagem deve ser executada de maneira estéril.
<ol><li>Ressuspender as células alvo pulsado e unpulsed (da etapa 6.3) em 106 células/mL CFSE-rotulagem meios de comunicação. Ressuspender as células pulsadas com preparados CFSEOi-rotular a mídia e as células unpulsed com preparados CFSEEis-rotulagem mídia.</li>
	<li>Mistura de células e mídia CFSE-rotulagem por inversão suave ou agitação. Não misture num Vortex. Incubar as células e mídia CFSE-rotulagem a 37 ° C durante 15 min. Remix as células cada 5 min.</li>
	<li>Adicione 10 mL de mídia completa de células de suspensão e girar cada célula em temperatura ambiente por 5 min a 475 x g.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de PBS frio. Gire as células a 4 ° C por 5 min a 475 x g.</li>
	<li>Repita a etapa 8.4.</li>
	<li>Contar as células e a mistura do peptide-pulsado, CFSEOi-rotulado com unpulsed, CFSElo-rotulado células na proporção de 1:1 para injeção em ratos destinatários. Manter uma alíquota de 1 x 106 misturada de células a ser usado para uma avaliação de citometria de fluxo da linha de base (seção 11). Nota: O volume final para injeção é de 100 µ l por rato. A contagem de células final é 10e6 células. Perda do volume na seringa e agulha precisa ser levado em conta e deve ser estimada em 500 µ l.</li>
</ol>9. injeção de células-alvo
Nota: Mantenha células CFSE-etiquetadas, protegidas da luz, antes e durante a injeção, tanto quanto possível.
<ol><li>Coloque destinatários camundongos C57BL/6 em uma retenção com o lado dorsal. Pulverizar a superfície de base de cauda de injeção com álcool isopropílico a 70%. Administre 100 µ l de suspensão de célula única por via intravenosa na veia da cauda com o lado de bisel voltado para cima.</li>
</ol>10. re-isolamento de células-alvo
Nota: O timing desta etapa é crítica e dependente da citotoxicidade CTL e a força do antígeno para a estimulação. Para avaliação de matar um alvo264 -pulsado óvulos257–, as células precisam ser colhido 4-6 h após a injeção. Desde que as células CFSE-etiquetados são luz sensíveis, processos baços no escuro.
<ol><li>Eutanásia os destinatários camundongos C57BL/6 de acordo com o método de asfixia aprovado CO2 .</li>
	<li>Remova spleen(s) como na etapa 2.1.1. Desagregar o baço e lavar splenocytes como em passos 2.2.1 - 2.2.3. Lyse pilhas de sangue vermelhas como em etapas 2.3 - 2.3.2.</li>
	<li>Ressuspender as células em uma célula de fluorescência ativada 1 mL classificação Reserva (FACs) (1% de BSA + PBS) para avaliação por citometria de fluxo.</li>
</ol>11. retenção de lógica para determinar a atividade CTL por citometria de fluxo
<ol><li>
Realize a avaliação da atividade CTL usando um protocolo de citometria de fluxo padrão. Adquira as células usando o canal FITC em um citômetro de fluxo com um 488 nm laser para excitação11.
	<ol>
<li>Portão em linfócitos ao vivo usando os parâmetros de dispersão (SSC) dispersão direta (FSC) vs lado. Subjulgá dentro do portão de linfócitos ao vivo para a população total de CFSE-positivo. Nota: As células injetadas CFSE-rotulado comporão um pequeno subconjunto dos linfócitos totais presentes no baço. As células de CSFE-positivo devem aparecer como duas populações distintas sobre a escala logarítmica.</li>
		<li>Use um formato de histograma para determinar a porcentagem do unpulsed (esquerdo pico, CFSEEis) e pulsado (certo pico, CFSEOi) populações. Perda das CFSEOi células indica atividade CTL antígeno-específicas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+quantification+of+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+cell-permeable+fluorogenic+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates.</a> Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).</li>
<li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+relationship+and+protective+immunity+of+memory+CD8+T+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets.</a> Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627(2014).</li>
<li>Johansson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+education+in+mice+with+single+or+multiple+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules.</a> J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).</li>
<li>Hailemichael, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+antigen+at+vaccination+sites+induces+tumor-specific+CD8%28%2B%29+T+cell+sequestration%2C+dysfunction+and+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion.</a> Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).</li>
<li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+regression+and+autoimmunity+after+reversal+of+a+functionally+tolerant+state+of+self-reactive+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).</li>
<li>Cho, H. I., Celis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+peptide+vaccines+eliciting+extensive+CD8+T-cell+responses+with+therapeutic+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects.</a> Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).</li>
<li>Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+for+pre-clinical+study+of+human+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy.</a> Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Enquanto este protocolo é simples, existem alguns passos críticos que devem ser executados com cuidado. A escorva covax após injeção da antígeno-específicas células T sendo testada é necessária ver qualquer matança dos alvos pulsados. Embora seja possível que a vacinação covax à base de água cria uma condição inflamatória aguda, para a fase inflamatória crônica, substituindo a formulação de curta duração à base de água com uma abordagem baseada em óleo de liberação lenta-antigénio pode produzir um melhor resultado<sup cl...

Múltiplos protocolos existem para avaliar o potencial (CTL) citolítica de um CD8+ ou CD4+ células T. Esta avaliação pode ser facilmente feita em vitro sob condições controladas1,2,3. Além disso, modelos de doenças infecciosas, tais como LCMV, classicamente têm examinado a função CTL através do uso de diferencialmente CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetato succinimidil éster) rotulada nas células-alvo onde o CFSEOi-pilhas etiquetadas são pulsado com um peptídeo e CFSEEis-etiquetado alvo, as células são deixadas unpulsed. As células são então injetadas na proporção de 1:1 e avaliados em relação à perda do CFSEOi-etiquetados pulsados alvos por citometria de fluxo4. Modelos de vacina e rejeição também usaram estratégias semelhantes para avaliação do na vivo matando por ambos os CD8+ e CD4+ T células bem como NK células5,6. Isto é um ensaio poderoso, mas requer o uso de agentes infecciosos que encha o sistema imunológico antes da injeção do alvo.
Este protocolo, por outro lado, não requer nenhuma infecção prévia do host e em vez disso, utiliza uma estratégia de vacinação para prime o sistema imunológico antes da injeção do alvo. Esta vacinação é composta por uma formulação à base de água de vacina de peptídeo que exige a prestação de um cocktail de immunostimulatory chamado covax7, consistindo de um receptor Toll-like 7 (TLR7) agonista (imiquimod creme), uma agonística anti-CD40 anticorpo e a interleucina-2 (IL-2) levando a combinação sinérgica de immunostimulatory agentes para o levantamento de escorva de peptídeo específico e robusta resposta imune. Como tal, este ensaio fornece uma leitura rápida da função CTL como a vacina é administrada junto com as células para avaliação da função de apenas três dias antes da injeção das células alvo. Além disso, a preparação de covax é forte o suficiente para que a capacidade de abate da célula T antígeno-específicas aprontada pode ser vista entre 4 e 24 h após a injeção.
A principal limitação do presente protocolo é identificar o cronograma na vivo para a detecção de matança de destino que é apropriada para o antígeno e a hipótese a ser testada. Cuidadosa avaliação deve ser realizada, como variações na força de antígeno, bem como alterações genéticas sendo testado em células T pode resultar em função CTL diferencial que exigiria uma detecção de temporização diferente de matar alvo. Além disso, enquanto que a concentração adequada de peptídeo para vacinação foi otimizada para melanoma humano antígeno glicopeptídeo 100 (hgp10025-33) e ovalbumina257-264 (óvulos257-264)8,9 , uso de outro modelo de antígeno que pode ser mais apropriado para um determinado estudo exigiria mais validação. Por causa de diferenças antecipadas na capacidade dos antígenos um alvo para estimular a função efetora CTL em combinação com o covax como adjuvante, otimização da frequência de concentração e dose de dose IL-2 pode ser essencial para atingir o objetivo desejado. Em geral, este protocolo permite uma avaliação rápida de matar função na vivo e pode ser adaptado a qualquer determinado antígeno.

<table><tbody><tr><td>Camundongos C57BL/6 fêmeas de 6 a 12 semanas de idade&nbsp;</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>C57 Black 6 camundongos</td></tr><tr><td>OT-1 camundongos fêmeas de 6-12 semanas de idade&nbsp;</td><td>Jackson Labs</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>hgp10025&ndash; 33&nbsp;</td><td>CPCScientific</td><td>834139</td><td>KVPRNQDWL</td></tr><tr><td>OVA 257&ndash; 264&nbsp;</td><td>CPCScientific</td><td>MISC-012</td><td>SIINFEKL</td></tr><tr><td>Imiquimod creme 5%&nbsp;</td><td>Fougera</td><td>51672-4145-6</td><td>Aldara Creme</td></tr><tr><td>CD40-específico mAb&nbsp;</td><td>BioXcell</td><td>BE0016-2</td><td>clone FGK4.5</td></tr><tr><td>rhIL-2 proteína&nbsp;</td><td>Hoffman LaRoche Inc</td><td>136</td><td>Proteína IL-2 humana recombinante</td></tr><tr><td>70% álcool isopropílico Preparação&nbsp;</td><td>Kendall</td><td>S-17474</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>Tampão de Fosfato Salino</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td> tampão de lise <td>de hemácias de soro bovino fetal</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td>tampão de lise de glóbulos vermelhos</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>penicilina/estreptomicina</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Life Technologies</td><td>C34554</td><td>5-(e 6)-Carboxifluoresceína diacetato éster succinimidílico</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL MCT graduado natural&nbsp;</td><td>Tubo de microcentrífuga</td> <td>Fisher</td><td>05-408-129</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Fisher</td><td>BP8201500</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Solução azul de tripano, 0,4%&nbsp; &nbsp;</td><td>Hemocitômetro Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de calibre 27</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr></tbody></table>

na vivo ensaio para detecção de células t antígeno-específicas função citolítica usando um modelo de vacinação

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Metodologias atuais para matar antígeno-específicas são limitadas para uso em vitro ou utilizadas em modelos de doenças infecciosas. No entanto, há não um protocolo especificamente concebido para medir o antígeno-específicas matança sem uma infecção. Este protocolo é projetado e descreve métodos para superar essas limitações, permitindo a detecção de antígeno-específicas matando de uma célula-alvo por CD8+ T células na vivo. Isso é realizado através da fusão de um modelo de vacinação com um alvo marcado CFSE tradicional matando o ensaio. Esta combinação permite que o pesquisador avaliar o potencial CTL antígeno-específicas diretamente e rapidamente como o ensaio não é dependente do crescimento do tumor ou infecção. Além disso, a leitura é baseada em citometria de fluxo e assim deve ser facilmente acessível para a maioria dos pesquisadores. A principal limitação do estudo é identificar o cronograma na vivo que é apropriado para a hipótese a ser testada. Variações na força de antigénio e mutações nas células T que podem resultar em função citolítica diferencial precisam ser cuidadosamente avaliada para determinar o momento ideal para colheita da pilha e avaliação. A concentração apropriada de peptídeo de vacinação foi otimizada para hgp10025-33 e óvulos257-264, mas ainda mais validação seria necessária para outros peptídeos que podem ser mais adequados para um determinado estudo. Em geral, este protocolo permite uma avaliação rápida de matar função na vivo e pode ser adaptado a qualquer determinado antígeno.

Antes da injeção de células-alvo CFSE-etiquetadas, a mistura de 1:1 célula é executada em um citômetro de fluxo para determinar as frequências de linha de base de ambos o CFSEOi e CFSEEis nas células-alvo. Figura 1 A mostra a estratégia associada para detectar mudanças nas populações CFSE, um portão inicial é feito usando parâmetros de FSC e SSC. As células CFSE positivo totais então são subgated antes de avaliar as alte...

O objetivo do presente protocolo é permitir detecção de in vivo matando de uma célula-alvo em um modelo murino de antígeno-específicas.

Na Vivo Ensaio para detecção de células T antígeno-específicas função citolítica usando um modelo de vacinação

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

O objetivo geral deste experimento é permitir a detecção da eliminação específica de células-alvo por antígeno in vivo em um modelo murino. Este método pode ajudar a responder perguntas no campo da imunologia, como a suficiência e detecção da eliminação citolítica específica de antígeno em células-alvo em um sistema imunológico atacado e como isso poderia ser modificado pela manipulação das células T para aprimorar a função in vivo. A principal vantagem desta técnica é que ela permite ao pesquisador avaliar diretamente e rapidamente o potencial citolítico específico de antígeno, já que o ensaio não depende do crescimento tumoral ou de infecção.Apresentando este procedimento, estará Cara Haymaker, e Yared Hailemichael, que nos orientarão do Departamento de Oncologia Médica de Melanoma. Após anestesiar os camundongos, de acordo com o protocolo descrito, utilize álcool isopropílico a 70% para pulverizar a região da base da cauda para a injeção. Usando uma agulha de 27 gauge acoplada a uma seringa, com o bisel voltado para cima, penetre quatro a cinco milímetros na região da base da cauda e injete 100 microlitros da solução de peptídeo previamente preparada.Em seguida, lateralmente ao local da injeção da vacina, injete 100 microlitros de anticorpo anti-CD4D. Aplique cuidadosamente 50 miligramas por camundongo de creme de imiquimode nos locais da vacinação. Esfregue o creme na superfície até que não seja mais visível e esteja completamente absorvido.Em seguida, injete 100 microlitros de 100.000 UI por mililitro de proteína humana recombinante rhIL-2 por via intraperitoneal, na região abdominal inferior. Após o isolamento de esplenócitos de camundongos e a lise das hemácias, conforme descrito no protocolo, realize o pulsamento com peptídeo ressuspendendo inicialmente as células a 10 elevado à sexta células por mililitro em meio completo. Divida as células em dois tubos cónicos de 15 mililitros e rotule-os como pulsado ou não pulsado.Para o pulsamento com OVA 257 a 264, adicione um micrograma por mililitro do peptídeo ao tubo identificado como pulsado. Em seguida, incube as células pulsadas e não pulsadas a 37 graus Celsius por uma hora. Adicione 10 mililitros de meio completo aos tubos pulsado e não pulsado para lavar as células-alvo.Em seguida, centrifugue as células restantes a 475 x g e temperatura ambiente por cinco minutos, antes de aspirar o sobrenadante. Prepare um meio de marcação alto com CSFE adicionando 1 microlitro por mililitro de CSFE ao RPMI 1640 com 2% de FBS, para uma concentração final de cinco micromolares por mililitro. Em seguida, prepare o meio de marcação baixo com CSFE adicionando um microlitro por mililitro de CSFE ao RPMI 1640 com 2% de FBS, para uma concentração final de 0,5 micromolar por mililitro.Para marcar os esplenócitos-alvo, re-suspenda 10 elevado à sexta potência de células por mililitro de células pulsadas com meio de marcação alto de CSFE preparado e 10 elevado à sexta potência de células por mililitro de células não pulsadas com meio de marcação baixo de CSFE. Misture as suspensões celulares por inversão suave ou agitação circular. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius por 15 minutos, remexendo as células a cada cinco minutos.Em seguida, adicione 10 mililitros de meio completo a cada suspensão celular e centrifugue as células a 475 x g e temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, aspire o sobrenadante e utilize 10 mililitros de PBS frio para ressuspender as células. Centrifugue as células a 475 x g e 4 graus Celsius por cinco minutos, antes de repetir a lavagem com PBS.Conte as células e misture as células marcadas com CSFE alto, pulsadas com peptídeo, com as células marcadas com CSFE baixo, não pulsadas, em uma proporção de 1:1 para injeção em camundongos receptores. Guarde uma alíquota de um vezes 10 à sexta potência de células mistas para uso em uma avaliação de linha de base por citometria de fluxo. Após a injeção e reisolamento das células-alvo, conforme descrito no protocolo, realize a avaliação da atividade CTL utilizando um protocolo padrão de citometria de fluxo, adquirindo as células no canal FITC com laser de 488 nanômetros para excitação.Antes da injeção de células-alvo marcadas com CSFE, a mistura de células em proporção 1:1 foi analisada em um citômetro de fluxo para determinar as frequências basais das células-alvo CSFE alto e CSFE baixo. Aqui é mostrada a estratégia de seleção para detectar alterações nas populações de CSFE. Um primeiro seleção foi feita utilizando os parâmetros FSC e SSC.As células positivas para CSFE totais foram então subselecionadas, antes da avaliação das alterações na frequência, pois esta população é relativamente pequena em comparação com os esplenócitos endógenos não marcados. Um exemplo da frequência relativa das populações de CSFE antes da injeção é mostrado aqui e deve ser próxima à proporção de um para um. A necessidade do "priming" com covex é evidenciada neste painel, no qual nenhuma lise das células-alvo com alto marcador CSFE, pulsadas com antígeno, foi observada nas 24 horas pós-injeção.Esta figura demonstra a eliminação eficaz das células-alvo marcadas com CSFE alto e pulsadas com antígeno, já que o pico observado antes da injeção foi quase indetectável, e a proporção foi drasticamente alterada de 50% para 1% de detecção. Por fim, a figura também mostra a cinética da eliminação das células-alvo marcadas com CSFE alto e pulsadas com antígeno, avaliando a perda dessa população tanto em 6 quanto em 24 horas após a injeção. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em dois a três dias, dependendo do antígeno e da função das células T.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a marcação com CSFE deve ser uniforme e que a cinética da resposta de LCT deve ser avaliada antes de executar o ensaio. Após este procedimento, outros métodos como ELISA, ELISPOT e coloração por citometria de fluxo intracelular também podem ser realizados para avaliar alterações na função efetora e responder outras questões adicionais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a função de LCT in vivo na ausência de infecção ou tumor.

in-vivo-assay-for-detection-antigen-specific-t-cell-cytolytic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Muitas infecções provocar uma forte resposta CTL, mas, ocasionalmente, a quantidade de células que respondem não se relaciona com o controle do...

Specific Antigen In Vivo Ensaio Killing usando células CFSE rotuladas Alvo

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em MoDC de células dendríticas derivadas de monócitos para medir a imunogenicidade de vacinas disponíveis comercialmente. Os ensaios do MoDC investigam as respostas das células dendríticas a antígenos, patógenos ou tratamentos e podem fornecer informações sobre respostas imunes, desenvolvimento de vacinas e pesquisa de imunoterapia.

Um ensaio in vitro baseado em células dendríticas pulsadas por vacina para induzir a proliferação de linfócitos

O vídeo demonstra um método imunológico para monitorar in vivo a produção de linfócitos T citotóxicos induzidos por adjuvantes ou CTL. Um camundongo é pré-injetado com linfócitos T CD8 + de doadores proliferativos corados com corante geneticamente modificado. A injeção subcutânea de ovalbumina com adjuvantes gera linfócitos T CD8+ citotóxicos que são identificados pós-colheita por meio de imunomarcação e citometria de fluxo.

Uma técnica imunológica para monitorar a geração de linfócitos T citotóxicos mediados por adjuvantes

Foi desenvolvido um ensaio in vitro para investigar o papel das vias de imunorreguladores na regulação da secreção de citoquinas por células T CD4 + específicas para o HIV.

In Vitro Ensaio para avaliar o impacto da imunorreguladora Pathways on específica para o HIV CD4 T efetoras celular Função

A capacidade de monitorar as respostas das células T em detalhe, in vivo é importante para o desenvolvimento da nossa compreensão da resposta imune. Aqui nós descrevemos o uso de matrizes alvo fluorescentes (ACL) em um ensaio in vivo de células T em que avalia&gt; 250 parâmetros simultaneamente por citometria de fluxo.

O Uso de fluorescentes alvo Matrizes para a Avaliação de respostas de células T<em&gt; In vivo</em

Descrevemos técnicas baseadas em imagens de animais inteiros e citometria de fluxo para monitorar a expansão de células T CD8+ específicas do antígeno em resposta à imunização com nanopartículas em um modelo murino de vacinação.

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

Apresentamos aqui um pedido de uma norma técnica imunológica (CFSE manchado OT-eu proliferação) destinados a monitorar rapidamente mediada por adjuvante T linfócitos citotóxicos (CTL) geração in vivo. Esta estimativa rápida das capacidades CTL é útil para o desenvolvimento de vacinas profiláticas contra patógenos intracelulares, bem como as vacinas terapêuticas do câncer.

Rápida na Vivo avaliação dos recursos de geração de linfócitos de T citotóxicos do adjuvante para desenvolvimento de vacinas

Aqui, apresentamos um protocolo para o ex vivo deteção qualitativa do antígeno-específicos CD8+ T células. Análise é possível com suspensões celulares único de órgãos ou de pequenas quantidades de sangue. Uma ampla gama de estudos requer a análise das respostas de célula de T citotóxicas (vacinação e estudos de imunoterapia do câncer).

Quantificação simultânea de vetor anti e Antiespecíficas do transgene CD8+ T células Via MHC tetrâmero coloração após a vacinação com um vetor Viral

Nós descrevemos aqui um ensaio in vivo cytometry-baseado do fluxo da matança que permita a examinação do immunodominance em respostas citotóxicas do linfócito de T (CTL) a um antígeno modelo do tumor. Nós fornecemos exemplos de como este ensaio elegante pode ser empregado para estudos mecanistic e para o teste da eficácia da droga.

Adaptando os ensaios de citotoxicidade in vivo para estudar Imunodominância em respostas de células T CD8+ específicas do tumor

Este protocolo descreve a geração cirúrgica de tumores pancreatic ortotópicos e a digestão rápida de tumores pancreatic recentemente isolados do murine. Após a digestão, populações de células imunes viáveis podem ser usadas para análise a jusante, incluindo a estimulação ex vivo das células T para detecção intracelular de citocina por citometria de fluxo.

Geração de tumores pancreáticos ortotópicos e caracterização ex vivo da citotoxicidade de células T infiltrada tumoral

Este manuscrito descreve como avaliar a imunogenicidade in vivo de vesículas extracelulares derivadas de células tumorais (EVs) usando citometria de fluxo. Os EVs derivados de tumores submetidos à morte de células imunogênicas induzidas pelo tratamento parecem particularmente relevantes na imunossuperveiência tumoral. Este protocolo exemplifica a avaliação dos EVs de tumor imunoestimulatório induzidos por oxaliplatina, mas pode ser adaptado a várias configurações.

In vivo Triagem de imunogenicidade de vesículas extracelulares derivadas do tumor por citometria de fluxo de células T esplênicas

Aprenda a detectar células T citolíticas antígeno-específicas em modelo murino usando ensaio in vivo. Este método permite avaliar rapidamente o potencial citolítico sem depender de crescimento tumoral ou infecção.

Na Vivo Ensaio para detecção de células T antígeno-específicas função citolítica usando um modelo de vacinação

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