Na Vivo Ensaio para detecção de células T antígeno-específicas função citolítica usando um modelo de vacinação

O objetivo geral deste experimento é permitir a detecção da morte específica do antígeno in vivo de uma célula-alvo em um modelo murino. Este método pode ajudar a responder a perguntas no campo da imunologia, como suficiência e detecção de morte citolítica específica do antígeno de células-alvo em um sistema imunológico atacado e como isso pode ser modificado pela manipulação das células T para melhorar a função in vivo. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite ao pesquisador avaliar o potencial citolítico antígeno-específico de forma direta e rápida, pois o ensaio não depende do crescimento ou infecção do tumor.

Apresentando esses procedimentos estarão Cara Haymaker e Yared Hailemichael para nos instruir do Departamento de Oncologia Médica do Melanoma. Depois de anestesiar os camundongos, de acordo com o protocolo de texto, use álcool isopropílico a 70% para pulverizar a área da base da cauda para injeção. Usando uma agulha de calibre 27 presa a uma seringa e com o lado chanfrado voltado para cima, penetre de quatro a cinco milímetros na região da base da cauda e injete 100 microlitros de solução peptídica previamente preparada.

Em seguida, lateralmente ao local de injeção da vacina, injete 100 microlitros de anticorpo anti-CD4D. Aplicar cuidadosamente 50 miligramas de imiquimod creme por ratinho nos locais de vacinação. Esfregue o creme na superfície até que o creme não seja mais visível e seja totalmente absorvido.

Em seguida, injete 100 microlitros de 100.000 UIs por mililitro de proteína rhIL-2 humana recombinante por via intraperitoneal, na região abdominal inferior. Depois de isolar os esplenócitos dos camundongos e lisar os glóbulos vermelhos, de acordo com o protocolo de texto, realize a pulsação do peptídeo ressuspendendo primeiro as células a 10 a sextas células por mililitro em meio completo. Divida as células em dois tubos cônicos de 15 mililitros e rotule-os como pulsados ou não pulsados.

Para OVA 257 a 264 pulsantes, adicione um micrograma por mililitro de peptídeo ao tubo rotulado como pulsado. Em seguida, incube células pulsadas e não pulsadas a 37 graus Celsius por uma hora. Adicione 10 mililitros de meio completo aos tubos pulsados e não pulsados para lavar as células-alvo.

Em seguida, gire as células restantes a 475 x g e temperatura ambiente, por cinco minutos, antes de aspirar o sobrenadante. Prepare um meio de alta marcação de CSFE adicionando 1 microlitro por mililitro de CSFE ao RPMI 1640 com 2% de FBS, para uma concentração final de cinco micromolares por milímetro. Em seguida, prepare o meio de baixa marcação do CSFE adicionando um microlitro por mililitro de CSFE ao RPMI 1640 com 2% de FBS, para uma concentração final de 0,5 micromolar por mililitro.

Para rotular os esplenólitos alvo, ressuspenda 10 até a sexta célula por mililitro de células pulsadas com meio de alta marcação de LCR preparado e 10 até a sexta célula por mililitro de células não pulsadas com meio de baixa marcação de LCR. Misture as suspensões celulares por inversão suave ou redemoinho. Em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius por 15 minutos, remisturando as células a cada cinco minutos.

Em seguida, adicione 10 mililitros de meio completo a cada suspensão de célula e centrifugue as células a 475 x g e temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, aspire o sobrenadante e use 10 mililitros de PBS frio para ressuspender as células. Gire as células a 475 x g e 4 graus Celsius por cinco minutos, antes de repetir a lavagem do PBS.

Conte as células e misture o CSFE pulsado com peptídeo altamente marcado com células não pulsadas com CSFE com baixo marcado na proporção de 1: 1 para injeção em camundongos receptores. Manter uma alíquota de uma vez 10 elevado a sexta células misturadas para utilizar na avaliação da citometria de fluxo de base. Após injetar e isolar as células-alvo, de acordo com o protocolo de texto, realizar avaliação da atividade CTL usando um protocolo de citometria de fluxo padrão, adquirindo células usando o canal FITC com um laser de 488 nanômetros para excitação.

Antes da injeção de células-alvo marcadas com CSFE, a mistura de células 1:1 foi executada em um citômetro de fluxo para determinar as frequências basais das células-alvo CSFE alta e baixa. Aqui está a estratégia de gating para detectar mudanças nas populações de CSFE. Um portão inicial foi feito usando os parâmetros FSC e SSC.

O total de células positivas para LCR foi então submetido, antes de avaliar as mudanças na frequência, pois essa população é relativamente pequena quando comparada aos espenlócitos endógenos não marcados. Um exemplo da frequência relativa das populações de CFE antes da injeção é mostrado aqui e deve ser próximo de um para um. A necessidade do priming covex é vista neste painel, onde nenhuma morte das células-alvo altas do CSFE pulsadas pelo antígeno foi observada 24 horas após a injeção.

Esta figura demonstra a morte efetiva das células-alvo altamente marcadas com CSFE pulsado por antígeno, já que o pico observado antes da injeção quase não foi detectado e a proporção foi drasticamente alterada de 50% para 1% de detecção. Finalmente, a figura também mostra a cinética da morte de células-alvo de alto rótulo do LCR pulsado por antígeno, avaliando a perda dessa população 6 e 24 horas após a injeção. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em dois a três dias, dependendo do antígeno e da função das células T.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a marcação do CSFE deve ser uniforme e a cinética da resposta CTL deve ser avaliada antes de realizar o ensaio. Após este procedimento, outros métodos como ELISA, ELISPOT e coloração por citometria de fluxo intracelular também podem ser realizados para avaliar as alterações na função efetora e responder a outras perguntas adicionais. Depois de assistir a este vídeo, você poderá ter uma boa compreensão de como avaliar a função CTL in vivo na ausência de uma infecção ou tumor.