3D ultraestrutura mitocondrial do músculo de voo indirecto Drosophila revelada pela série-seção elétron Tomography

O objetivo geral deste vídeo é determinar a aplicação da tomografia eletrônica de seção seriada para estudar a ultraestrutura mitocondrial do músculo de voo indireto da Drosophila. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular estrutural, como a estrutura e a relação funcional com as mitocôndrias. A principal vantagem dessa técnica é que a ultraestrutura celular é revelada em três dimensões.

Para iniciar o experimento, anestesiar cinco espécimes de Drosophola no gelo e mergulhar cada mosca em um mililitro de agarose de baixo ponto de fusão a 4% em tampão fosfato. Deixe a agarose solidificar no gelo. Em seguida, use um micrótomo de lâmina vibratória para seccionar Drosophola embebido em gel de agarose em fatias com 100 micrômetros de espessura.

Mergulhe as fatias em solução fixadora contendo 2,5% de glutaraldeído em tampão fosfato molar de ponto zero um. Lave as seções de tecido em três gotas de tampão fosfato e, em seguida, lave com duas gotas de tampão fosfato com 20% BSA. Coloque as seções em transportadores de ouro para congelamento de alta pressão, ou HPF, preenchidos com tampão e 20% BSA.

Em seguida, carregue a amostra contendo os transportadores em um freezer de alta pressão de acordo com o manual do usuário. Após o congelamento, libere os suportes do suporte sob nitrogênio líquido e transfira-os para um dispositivo de substituição livre resfriado a 140 graus Celsius negativos. Execute o protocolo de substituição livre com o coquetel FS contendo 2% de glutaraldeído, 2% de tetróxido de ósmio, 0,1% de acetato de uranila em acetona.

Incorpore amostras em resina à temperatura ambiente. Em seguida, polimerize a resina a 65 graus Celsius por 16 horas. Apare os blocos de amostra para expor a face do bloco desejada que contém tecido.

Em seguida, pré-trate as partículas de ouro de 10 nanômetros com 1% BSA por 30 minutos. Lave e suspenda as partículas de ouro em solução salina tamponada com fosfato, ou PBS. Sobreponha as partículas de ouro em grades de lâminas de cobre revestidas com filme de carbono para criar marcadores fiduciais.

Corte seções seriais de 200 a 250 nanômetros de espessura usando um ultramicrótomo. Em seguida, colete as seções seriais em grades de slot usando um loop perfeito para seções finas. Manchar as seções com citrato de chumbo Reynolds por 10 minutos.

Sobreponha uma segunda camada de partículas de ouro fiducial no topo das seções. Carregue a grade em um suporte de tomografia de eixo duplo e insira no microscópio eletrônico de transmissão operando a 200 quilovolts. Alinhe o microscópio no foco eucêntrico.

Configure o software de coleta automática de dados, ajuste e alinhe o feixe de elétrons na configuração de imagem multiescala, adquira referências escuras e claras da câmera em uma área vazia sem filme de carbono na configuração de coleta de tomografia. Em seguida, colete um atlas de grade em baixa ampliação. Selecione mitocôndrias em seções seriadas como alvos para coleta de tomografia, adquira uma série de inclinação de 60 graus negativos a 60 graus positivos com incrementos de dois graus no eixo A para cada alvo.

Finalmente, colete a segunda série de inclinação. Gire o suporte da amostra 90 graus. Adquira um novo atlas.

Selecione as posições correspondentes e adquira a série de inclinação no eixo B para cada alvo. Usando este método, micrografias 2-D e tomógrafos 3-D de seções seriadas cobrindo todo o volume de uma mitocôndria foram geradas. Os tomogramas de seção serial unidos são projetados para criar uma seção longitudinal com o eixo z mostrado verticalmente.

A tomografia eletrônica de corte seriado foi aplicada para analisar características estruturais de cristas mitocondriais que refletem seu estado energético e envelhecimento. Fatias de reconstruções tomográficas de elétrons mitocondriais revelam mudanças entre as membranas lamelares através do eixo z. Segmentação tomográfica ilustrando uma espiral canhota em 3-D.

Os padrões de troca de cristas foram analisados e as cores renderizadas no modelo de segmentação. Um corte tomográfico mostra a confluência da matriz lateral através das membranas das cristas. Um modelo de segmentação foi gerado do tomograma mostrando a confluência da matriz lateral e cristas representativas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a tomografia eletrônica de seção serial, que pode ser adaptada para estudar qualquer estrutura celular em três dimensões.